针对清除剂受体B1的抑制HCV复制的抗原结合蛋白

摘要

本发明涉及与SR－B1靶区结合的抗原结合蛋白，所述靶区在本文中被鉴定为涉及HCV E2结合的区域。被鉴定的靶区是由SEQ ID NOs：1、2、3或4的单链抗体结合的区域。

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号60/586,356的利益，所述临时申请于2004年7月8日提交，在此引入本文作为参考。

发明背景

不认为本申请所引用的参考文献是所请求保护的发明的现有技术。

据估计世界上约3％的人口感染丙型肝炎病毒(HCV)。(Wasley等人，Semin.Liver Dis.20：1-16，2000.)HCV暴露在小部分情况下导致明显的急性疾病，而在大部分情况下病毒引起慢性感染，从而导致肝脏炎症并缓慢发展为肝衰竭和肝硬化。(Strader等人，ILAR J.42：107-116，2001.)流行病学调查指出HCV在肝细胞癌发病中的重要作用。(Strader等人，ILAR J.42：107-116，2001.)

HCV可以分为许多不同的基因型(1-6)以及亚型(a-c)。基因型和亚型的分布在地理上和危险群体之间有变化。(Robertson等人，Arch Virol.143：2493-2503，1998.)。

HCV基因组由约9.5 kb的单链RNA组成，所述RNA编码约3000个氨基酸的前体多蛋白。(Choo等人，Science 244：362-364，1989，Choo等人，Science 244：359-362，1989.)HCV多蛋白包含的病毒蛋白的顺序为：C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。前体多蛋白切割产生成熟的结构和非结构性病毒蛋白。(Neddermann等人，Biol.Chem.378：469-476，1997.)

作为其感染循环的部分，HCV进入细胞中。宿主细胞LDL受体和CD81分子已被鉴定为推定的HCV受体。LDL受体被认为经由结合病毒相关的LDL颗粒介导病毒的内在化。(Agnello等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：12766-12771，1999.)CD81分子被认为基于来自HCV基因型1a的重组包膜蛋白E2结合HCV E2。(Pileri等人，Science282：938-941，1998.)

发现HCV包膜糖蛋白E2与人肝癌细胞的结合不依赖于CD81。负责E2与人肝细胞结合的受体被鉴定为人清除剂受体B族1型(SR-B1)。(Scarselli等人，The EMBO Journal 21：5017-5025，2002.)

发明概述

本发明涉及结合SR-B1靶区的抗原结合蛋白，所述靶区在本文中被鉴定为涉及HCV E2结合的区域。被鉴定的靶区是由SEQ IDNOs：1、2、3或4的单链抗体结合的区域。

因此，本发明的第一个方面涉及包含第一个可变区和第二个可变区的被分离的抗原结合蛋白。第一个和第二个可变区结合一个或多个靶区，所述靶区选自：SEQ ID NO：1靶区、SEQ ID NO：2靶区、SEQID NO：3靶区和SEQ ID NO：4靶区。

提到“被分离的”指与自然界中发现的不同的形式。不同的形式可以是例如与自然界中发现的不同的纯度和/或自然界中没有发现的结构。自然界中没有发现的结构包括将不同的区域组合在一起的重组结构，例如，将一个或多个鼠CDR插入到人构架支架中的人源化抗体，将来自抗体结合蛋白的一个或多个CDR插入到不同的构架支架中的杂合抗体，以及来源于天然人序列的抗体，其中编码轻和重可变结构域的基因随机组合在一起。

被分离的蛋白优选基本上不合血清蛋白。基本上不含血清蛋白的蛋白存在于缺少大部分或所有血清蛋白的环境中。

“可变区”具有来自重链或轻链的抗体可变区的结构。抗体重链和轻链可变区包括在构架上用间隔隔开的3个互补决定区。互补决定区主要负责识别特定的表位。

关于SEQ ID NOs：1、2、3或4限定的靶区是与相应的单链抗体结合的SR-B1区。例如，SEQ ID NO：1靶区是与SEQ ID NO：1的多肽结合的区域。

与被鉴定的靶区相同的靶区结合的蛋白与SEQ ID NOs：1、2、3或4竞争结合被鉴定的靶区。例如，与SEQ ID NO：1的多肽竞争结合SR-B1的蛋白结合SEQ ID NO：1靶区。

提到“蛋白”或“多肽”指邻接的氨基酸序列并且不提供最小或最大大小的限制。存在于蛋白或多肽中的一个或多个氨基酸可以包含翻译后修饰，例如糖基化和二硫键形成。

优选的抗原结合蛋白是单克隆抗体。提到“单克隆抗体”指具有相同或基本上相同的互补决定区和结合特异性的抗体的集合。单克隆抗体中的变异是如果抗体由相同的构建体产生将会出现的变异。

单克隆抗体可以由例如特定的杂交瘤或包含一个或多个编码该抗体的重组基因的重组细胞产生。抗体可以由超过一个的重组基因编码，其中例如一个基因编码重链并且一个基因编码轻链。

本发明的另一方面描述了药物组合物。该组合物包含抗原结合蛋白和药物上可接受的载体。

本发明的另一方面描述了包含编码抗原结合蛋白的重组基因的核酸。重组基因包含编码多肽的重组核酸和用于正确转录和加工的调节元件(它可以包括翻译和翻译后元件)。重组基因可以不依赖于宿主基因组而存在或可以是宿主基因组的部分。

重组核酸是由于其序列和/或形式而在自然界中不存在的核酸。重组核酸的实例包括纯化的核酸，组合在一起的两个或更多个核酸区域，从而提供了与自然界中发现的不同的核酸，以及天然地互相结合的一个或多个核酸区域(例如上游或下游区)的缺失。

本发明的另一方面描述了抑制细胞中的HCV复制的方法。该方法涉及向细胞提供有效量的抗原结合蛋白。

本发明的另一方面描述了抑制患者中的HCV复制的方法。该方法涉及对患者施用有效量的抗原结合蛋白。

本发明的另一方面描述了包含编码抗原结合蛋白的重组核酸的重组细胞。

本发明的另一方面描述了产生抗原结合蛋白的方法。该方法涉及在核苷酸序列表达于该细胞中的条件下培养包含编码抗原结合的重组基因的细胞并分离抗原结合蛋白。

提到“分离”指从一个或多个细胞组分中分离蛋白。优选地，该蛋白是基本上纯化的。

除非特定术语是互相排斥的，提到“或”指任何一个或两个可能性。偶尔地，短语例如“和/或”用于强调任何一个或两个可能性。

提到开放式的术语例如“包括”允许另外的元素或步骤。偶尔地，短语例如“一个或多个”与或不与开放式的术语一起用于强调另外的元素或步骤的可能性。

除非明确说明，提到术语例如“一个(a)”或“一个(an)”不限于一个。例如“一个细胞”不排除“多个细胞”。偶尔地，短语例如一个或多个用于强调可能存在多个。

本发明的其他特征和优点由于本文所提供的另外描述，包括不同的实施例，而是显而易见的。所提供的实施例举例说明在本发明实践中有用的不同组分和方法。所述实施例不限制所请求保护的发明。基于本公开内容，技术人员可以鉴别并采用对实践本发明有用的其他组分和方法。

附图简述

图1举例说明了IgG分子的结构。“V_L”指轻链可变区。“V_H”指重链可变区。“CL”指轻链恒定区。“CH₁”、“CH₂”和“CH₃”为重链恒定区。

图2举例说明了单链抗体的结构。“V_L”指轻链可变区。“V_H”指重链可变区。

图3A和3B提供了SEQ ID NOs：1、2、3和4的单链抗体的氨基酸序列比对，并且指出了不同的互补决定区(“CDR”)、构架区(“FW”)和接头。“SEQ1”指SEQ ID NO：1。“SEQ 2”指SEQID NO：2。“SEQ3”指SEQ ID NO：3。“SEQ4”指SEQ ID NO：4。CDR可以比图中举例说明的更长。所提供的比对除去了CDR中共同的缺口。

图4A-4D举例说明了编码SEQ ID NOs：1、2、3和4的核酸序列。图4A举例说明了编码SEQ ID NO：1的核酸序列(SEQ ID NO：5)。图4B举例说明了编码SEQ ID NO：2的核酸序列(SEQ ID NO：6)。图4C举例说明了编码SEQ ID NO：3的核酸序列(SEQ ID NO：7)。图4D举例说明了编码SEQ ID NO：4的核酸序列(SEQ ID NO：8)  。

图5提供了SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

图6提供了举例说明SEQ ID NOs：1、2、3和4的单链抗体抑制E2蛋白与HepG2细胞系结合的能力的结果。垂直轴代表与HepG2细胞结合的E2蛋白的百分比，所述细胞指没有与单链抗体一起预温育的细胞。使用无关的单链抗体(D5)作为对照。一式两份进行实验，显示了一式两份样品的平均值。

图7提供了举例说明SEQ ID NO：2的单链抗体(“scFVC11”)抑制培养的人肝细胞的HCV感染的结果。通过定量PCR在总RNA上测量病毒复制并且表达为HCV拷贝数/350000细胞。试验在一式三份的孔中进行并且值与标准差一起显示。测试了两个不同浓度25和5μg/ml的SEQ ID NO：2的单链抗体。使用浓度为25μg/ml的无关的单链抗体(FV)作为对照。使用HCV复制酶抑制剂作为抑制感染的阳性对照(“Pol抑制剂”)。

图8提供了举例说明包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4可变区的IgG4分子抑制E2蛋白与CHO7s细胞系结合的能力的结果。使用无关的IgG作为阴性对照。

发明详述

本申请鉴定了可被靶向抑制HCV E2与细胞结合的特定SR-B1区。下文提供的实施例举例说明了SEQ ID NOs：1-4的单链抗体抑制HCV E2结合的能力，包含SEQ ID NOs：2或4可变区的IgG分子抑制HCV E2结合的能力，以及SEQ ID NO：2抑制HCV复制的能力。

抑制HCV E2结合可以具有研究工具和治疗应用。研究工具应用包括利用结合蛋白作为工具来研究HCV结合和复制，并且鉴定与相同区域结合的另外的结合蛋白。治疗应用包括利用那些具有适当的药物特性例如功效和没有不可接受的毒性的化合物来治疗或抑制患者中的HCV发作。

靶SR-B1是包含大胞外环的糖蛋白，所述环通过跨膜结构域在氨基末端和羧基末端锚定于质膜。(Krieger Journal of ClinicalInvestigation 108：793-797，2001.)SR-B1高度表达于肝脏肝细胞和生成类固醇的组织中，并介导胆固醇和磷脂的选择性细胞摄入。(Acton等人，Science 271：518-520，1996，Urban等人，J.Biol.Chem.275：33409-33415，2000.)

SEQ ID NO：9提供用于获得SEQ ID NOs：1、2、3和4的单链抗体的SR-B1氨基酸序列。SEQ ID NO：9可以用作抗原结合蛋白的参考框架。

I.抗原结合蛋白

抗原结合蛋白包含提供与表位特异性结合的抗体可变区。抗体可变区可以存在于例如完整的抗体、抗体片段以及抗体或抗体片段的重组衍生物中。

图1和2提供了不同类型的抗原结合蛋白的一些实例。图1举例说明了完整的IgG分子和不同的抗体区。IgG分子包含4条多肽链：2条较长的重链和2条较短的轻链。每条重链和轻链包含恒定区和可变区。在可变区内为负责抗原特异性的高变区。(参见，例如，Breitling等人，Recombinant Antibodies，John Wiley & Sons，Inc.和Spektrum Akademischer Verlag，1999；和Lewin，Genes IV，OxfordUniversity Press and Cell Press，1990.)

2条重链的羧基区是通过二硫键连接以产生Fc区的恒定区。Fc区对于提供生物学活性例如补体和巨噬细胞活化是重要的。组成Fc区的2条重链多肽中的每一条延伸穿过铰链区进入不同的Fab区。

在较高等的脊椎动物中存在着2类轻链和5类重链。轻链为κ或λ。重链限定抗体的种类并且为α、δ、ε、γ或μ。例如，IgG具有γ重链。对于不同类型的重链还存在着亚类，例如γ₁、γ₂、γ₃和γ₄。重链赋予铰链区和尾区特殊的构象。(Lewin，Genes IV，OxfordUniversity Press and Cell Press，1990.)

亚类还可以被进一步表征。例如IgG₂亚型可以进一步分为IgG_2a和IgG_2b。(Hahn G.S.(1982)Antibody Structure，Function and ActiveSites.In Physiology of Immunoglobulins：Diagnostic and ClinicalAspects.S.E.Ritzmann(ed)Alan Liss Inc.，New York；和TurnerM.W.(1983)Immunoglobulins.In Immunology in Medicine.AComprehensive Guide to Clinical Immunology.2^nd Edition.EJ.Holborow & W.G.Reeves(eds.)Grune & Stratton，London.)。

包含抗体可变区的抗体片段包括Fv、Fab和Fab₂区。每个Fab区包含由可变区和恒定区组成的轻链，以及包含可变区和恒定区的重链区。轻链由二硫键通过恒定区与重链连接。Fab区的轻链和重链可变区提供了参与抗原结合的Fv区。

抗体可变区还可以是包含可变区的蛋白的部分，所述蛋白例如单链抗体和微型抗体(minibody)。单链抗体包含通过接头连接在一起的轻和重可变区。(参见图2。)该接头可以是例如约5-16个氨基酸。微型抗体是自我装配为约80kDa的二价二聚体的单链-CH3融合蛋白。

可变区的特异性由3个高变区(也称为互补决定区)确定，它们插入在更保守的侧翼区(也称为构架区)之间。与构架区和互补决定区相关的氨基酸可以如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，U.S.Department of Health and HumanServices，1991所描述的进行编号和比对。

II.SEQ ID NOs：1-4靶定的区

由SEQ ID NOs：1、2、3和/或4结合的SR-B1区提供了抑制HCV E2结合的靶区。SEQ ID NOs：1-4的单链抗体不必结合不同的区域。SEQ ID NOs：1和4应当识别相同的表位。SEQ ID NOs：1和4具有非常高的同源性，其在CDR3中有一个不同的氨基酸，并且在构架区中具有较小的改变。

本文所描述的抗原结合蛋白结合涉及HCV E2结合的SR-B1靶区。尽管HCV E2结合的抑制被期望通过与直接涉及HCV E2结合的位点相互作用而发生，但涉及HCV E2结合的区域可以包括不直接与HCV E2结合相互作用的区域。例如，靶定的区可以涉及为直接结合HCV E2的不同区提供正确的构象。

SEQ ID NOs：1-4的单链抗体是可用于抑制HCV E2结合的抗原结合蛋白的实例。SEQ ID NOs：1-4还可用于设计与靶定的区结合的另外的抗原结合蛋白。例如，利用涉及衍生SEQ ID NOs：1-4的技术，利用SEQ ID NOs：1-4中提供的序列信息，或采用SEQ IDNOs：1-4作为工具以根据实验鉴定与相同区结合的蛋白，可以进行另外的结合蛋白的设计。

SEQ ID NOs：1-4提供了能够整合到抗原结合蛋白中的可变区序列和互补决定区序列。图3A和3B提供了SEQ ID NOs：1-4的氨基酸序列并且指出了不同的互补决定区、框架工作区和接头区的位置。

抗原结合蛋白抑制HCV E2结合和HCV复制的能力可以利用例如下文实施例中所描述的那些方法进行评估。抑制HCV E2结合的抗原结合蛋白可以用作获得另外的抗原结合蛋白的起始构建体。

II.A.单链抗体的修饰

已知序列例如SEQ ID NOs：1、2、3或4的单链抗体可以被衍生以增强稳定性并增强抗原结合。影响稳定性的因素包括疏水性残基的暴露，所述疏水性残基隐藏在整个Ig分子界面的恒定域界面；导致分子间相互作用的Fv表面上的疏水区暴露；以及在Fvβ折叠内部或在V_H和V_L之间的正常界面中的亲水性残基。(Chowdhury等人，Engineering scFvs for Improved Stability，p.237-254 inRecombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols，(Eds.Welschof和Krauss)Humana Press，Totowa，New Jersey，2003.)

通过置换对稳定性有影响的问题残基可以增强稳定性。隐藏的疏水性残基及暴露的亲水性残基可能存在问题。考虑到问题残基来增强单链抗体稳定性的技术是本领域众所周知的。(Chowdhury等人，Engineering scFvs for Improved Stability，p.237-254 inRecombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols，(Eds.Welschof和Krauss)Humana Press，Totowa，New Jersey，2003.)

利用例如定点诱变和链改组的技术可以增强单链抗原的亲和力。进行定点诱变可以置换一个或多个互补决定区的氨基酸并随后鉴定具有更高亲和力的抗体。(Azzazy等人，Clinical Biochemistry35：425-445，2002.)

可以进行链改组以提供与抗原结合的可变区的新组合。通过将单链抗体的可变区(例如V_H)与不同可变区(例如V_L)谱组合可以进行链改组以产生单链抗体文库，所得到的文库包含已知对抗原特异的可变区和随机的可变区。针对抗原淘选文库以鉴定与抗原结合的亲和力增强的单链抗体。

II.B.基于可变区的信息构建抗原结合蛋白

来自SEQ ID NOs：1-4的单链抗体的可变区和互补决定区可以被整合到抗原结合蛋白中。将可变区整合到抗体或抗体片段中的技术是本领域众所周知的。(例如，Azzazy等人，Clinical Biochemistry35：425-445，2002，Persic等人，Gene 187：9-18，1997.)此类技术的一个实例如下：

1)利用对V_H和V_L区特异的PCR引物分别扩增Fv结构域，该引物可以包括另外的核苷酸以用于引入独特的限制位点、用于提供剪接位点以及编码另外的氨基酸；

2)将被扩增的可变编码区整合到哺乳动物表达盒中。编码V_H的核酸可以被插入到包含用于表达人重链(例如人γ4重链)的盒的质粒中，而V_L编码区可以被导入表达轻链(例如人λ轻链)的载体中。两种载体在抗体的前导序列和恒定区序列之间应当携带内含子。该内含子应当包含适合于克隆被扩增的FV结构域的独特的限制位点；以及

3)IgG产生可以通过在293-EBNA中共转染V_H和V_L表达载体来实现。

可以进行所概述操作的众多改变以将可变区整合到抗体或抗体片段中。此类改变包括例如使用编码不同类型的抗体轻链和重链或其片段的载体，使用单个载体以及使用不同类型的宿主细胞。

将互补决定区嫁接到抗体或抗体片段中的技术也是本领域众所周知的。此类技术一般参考人源化鼠抗体进行描述，其通过将鼠可变区嫁接到人抗体构架上并且在需要时进行进一步修饰来实现。(例如，O′Brien等人，Humanization of Monoclonal Antibodies by CDRGrafting，p81-100，From Methods in Molecular Biology VoI 207：Recombinant antibodies for Cancer Therapy：Methods and Protocols(Eds Welschof和Krauss)Humana Press，Totowa，New Jersey，2003.)

在不同的实施方案中，抗原结合蛋白是完整的抗体、抗体片段或者是抗体或抗体片段的重组衍生物，其中：

a)第一个可变区为包含第一个CDR、第二个CDR以及第三个CDR的V_h区，所述第一个CDR包含SEQ ID NO：1的氨基酸31-35，所述第二个CDR包含SEQ ID NO：1的氨基酸50-66，且所述第三个CDR包含SEQ ID NO：1的氨基酸99-108；并且第二个可变区为包含第一个CDR、第二个CDR以及第三个CDR的V₁区，所述第一个CDR包含SEQ ID NO：1的氨基酸158-170，所述第二个CDR包含SEQ ID NO：1的氨基酸186-192，且所述第三个CDR包含SEQID NO：1的氨基酸225-235；

b)第一个可变区为包含第一个CDR、第二个CDR以及第三个CDR的V_h区，所述第一个CDR包含SEQ ID NO：2的氨基酸31-37，所述第二个CDR包含SEQ ID NO：2的氨基酸52-67，且所述第三个CDR包含SEQ ID NO：2的氨基酸100-114；并且第二个可变区为包含第一个CDR、第二个CDR以及第三个CDR的V₁区，所述第一个CDR包含SEQ ID NO：2的氨基酸164-176，所述第二个CDR包含SEQ ID NO：2的氨基酸192-198，且所述第三个CDR包含SEQ ID NO：2的氨基酸231-241；

c)第一个可变区为包含第一个CDR、第二个CDR以及第三个CDR的V_h区，所述第一个CDR包含SEQ ID NO：3的氨基酸31-35，所述第二个CDR包含SEQ ID NO：3的氨基酸50-66，且所述第三个CDR包含SEQ ID NO：3的氨基酸99-108；并且第二个可变区为包含第一个CDR、第二个CDR以及第三个CDR的V₁区，所述第一个CDR包含SEQ ID NO：3的氨基酸158-170，所述第二个CDR包含SEQ ID NO：3的氨基酸186-192，且所述第三个CDR包含SEQID NO：3的氨基酸225-235；

d)第一个可变区为包含第一个CDR、第二个CDR以及第三个CDR的V_h区，所述第一个CDR包含SEQ ID NO：4的氨基酸31-35，所述第二个CDR包含SEQ ID NO：4的氨基酸50-66，且所述第三个CDR包含SEQ ID NO：4的氨基酸99-108；并且第二个可变区为包含第一个CDR、第二个CDR以及第三个CDR的V₁区，所述第一个CDR包含SEQ ID NO：4的氨基酸158-170，所述第二个CDR包含SEQ ID NO：4的氨基酸186-192，且所述第三个CDR包含SEQID NO：4的氨基酸225-235；

e)第一个可变区由SEQ ID NO：1的氨基酸1-119组成并且第二个可变区由SEQ ID NO：1的氨基酸136-245组成；

f)第一个可变区由SEQ ID NO：2的氨基酸1-125组成并且第二个可变区由SEQ ID NO：2的氨基酸142-251组成；

g)第一个可变区由SEQ ID NO：3的氨基酸1-119组成并且第二个可变区由SEQ ID NO：3的氨基酸136-245组成；或

h)第一个可变区由SEQ ID NO：4的氨基酸1-119组成并且第二个可变区由SEQ ID NO：4的氨基酸136-245组成。

II.C.抗原结合蛋白的进一步鉴定

SEQ ID NOs：1、2、3或4的单链抗体可以用于鉴定与靶定的区结合的另外的抗原结合蛋白。利用不同的技术，例如筛选与SEQ IDNOs：1、2、3或4竞争结合SR-B1的抗原结合蛋白，对由SEQ ID NOs：1、2、3或4的单链抗体识别的表位作图，以及利用表位自身选择另外的抗原结合蛋白，可以进行鉴定。

利用SR-B1作为抗原可以产生用于竞争测定的抗原结合蛋白。产生抗原结合蛋白例如单链抗体、抗体或抗体片段的技术是本领域众所周知的。此类技术的实例包括使用噬菌体展示技术、啮齿类动物抗体的鉴定和人源化、以及利用XenoMouse或Trans-Chromo小鼠产生人抗体。(例如，Azzazy等人，Clinical Biochemistry 35：425-445，2002，Berger等人，Am.J.Med.Sci.324(1)：14-40，2002.)

III.蛋白的产生

优选利用重组核酸技术或通过使用杂交瘤来产生抗原结合蛋白。重组核酸技术涉及构建用于蛋白合成的核酸模板。杂交瘤是产生抗原结合蛋白的无限增殖化细胞系。

编码抗原结合蛋白的重组核酸可以表达于宿主细胞中，所述宿主细胞实际上充当编码的蛋白的工厂。重组核酸可以提供编码抗原结合蛋白的重组基因，所述基因自主地存在于宿主细胞基因组之外或作为宿主细胞基因组的部分存在。

重组基因包含编码蛋白的核酸以及用于蛋白表达的调节元件。一般地，存在于重组基因中的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子以及任选存在的操纵基因。在真核细胞中用于加工的优选元件是多腺苷酸化信号。还可存在与抗体有关的内含子。用于抗体或抗体片段生产的表达盒的实例是本领域众所周知的。(例如，Persic等人Gene 187：9-18，1997，Boel等人，J.Immunol.Methods 239：153-166，2000，Liang等人，J.Immunol.Methods 247：119-130，2001.)

利用表达载体促进了重组基因在细胞中的表达。优选地，表达载体除重组基因之外还包含在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择标记、数目有限的有用的限制酶位点以及高拷贝数的潜力。用抗体和抗体片段生产的表达载体的实例是本领域众所周知的。(例如，Persic等人，Gene 187：9-18，1997，Boel等人，J.Immunol.Methods 239：153-166，2000，Liang等人，J.Immunol Methods 247：1 19-130，2001.)

如果需要，利用本领域众所周知的技术可以将编码抗体的核酸整合到宿主染色体中。(参见，Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley，1987-1998，Marks等人，InternationalApplication Number WO 95/17516.International Publication DateJune 29，1995.)

各种不同的细胞系可以用于表达重组的抗原结合蛋白，包括来自原核生物(例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces))以及来自真核生物(例如，酵母、杆状病毒和哺乳动物)的那些。(Breitling等人，Recombinant Antibodies，John Wiley & Sons，Inc.和Spektrum Akademischer Verlag，1999.)

用于重组抗原结合蛋白表达的优选宿主为哺乳动物细胞，所述细胞能够产生具有正确的翻译后修饰的抗原结合蛋白。翻译后修饰包括二硫键形成和糖基化。另一种类型的翻译后修饰为信号肽切割。

正确的糖基化对于抗体功能是重要的。(Yoo等人，Journal ofImmunological Methods 261：1～20，2002.)天然存在的抗体包含至少一个附着在重链上的N-连接的糖类。(同上)另外的N-连接的糖类和O-连接的糖类可以存在并且对于抗体功能可能是重要的。(同上)

不同类型的哺乳动物宿主细胞可以用于提供有效的翻译后修饰。此类宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(Cho)、HeLa、C6、PCI2和骨髓瘤细胞。(Yoo等人，Journal of Immunological Methods261：1-20，2002，Persic等人，Gene 187：9-18，1997.)

杂交瘤是产生抗体的无限增殖化细胞系。利用例如AusubelCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-1998，Harlow等人，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988，和Kohler等人，Nature 256，495-497，1975中所描述的那些的技术可以产生杂交瘤。

IV.组合治疗

与适当的SR-B1位点结合的抗原结合蛋白自身或与一种或多种其他的抗HCV试剂组合可以用于抑制HCV并治疗HCV患者。目前被批准的抗HCV试剂是干扰素α以及与ribovarin组合的干扰素α。不同形式的干扰素α例如重组的干扰素和聚乙烯二醇化(peglyated)的干扰素可以用于治疗HCV感染。(De Francesco等人，AntiviralResearch 58：1-16，2003，Walker等人，Antiviral Chemistry &Chemotherapy 14：1-21，2003.)

各种不同的抗HCV试剂处于不同的临床开发阶段。被开发的不同的抗HCV试剂包括针对不同的HCV靶的试剂。不同的HCV靶的实例包括HCV聚合酶和HCV NS3-NS4A蛋白酶。(De Francesco等人，Antiviral Research 58：1-16，2003，Walker等人，AntiviralChemistry & Chemotherapy 14：1-21，2003.)

V.施用

在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences 20^th Edition，Ed.Gennaro，Mack Publishing，2000；和Modern Pharmaceutics 2^ndEdition，Eds.Banker和Rhodes，Marcel Dekker，Inc.，1990中提供了通常的药物施用的指导方针。

药物学上可接受的载体促进了抗原结合蛋白的储存或施用。用于稳定蛋白溶液制剂的物质包括糖类、氨基酸和缓冲盐。(Middaugh等人，Handbook of Experimental Pharmacology 137：33-58，1999.)

可以通过不同途径，例如皮下、肌内或粘膜施用抗原结合蛋白。利用例如针或喷射注射器(jet-injector)可以进行皮下和肌内施用。粘膜送递例如鼻送递可以涉及利用增强剂或粘膜粘着剂以在吸附部位产生更长的停留时间。(Middaugh等人，Handbook of ExperimentalPharmacology 137：33-58，1999.)

适当的给药方案优选考虑本领域众所周知的因素来确定，所述因素包括患者的年龄、体重、性别和医疗条件；施用途径；所需效果；以及所采用的特定化合物。预期剂量将由1.0μg-1.0mg的总蛋白组成，在本发明的不同实施方案中，该范围为0.01mg-1.0mg以及0.1mg-1.0mg。

VI.实施例

下文提供的实施例进一步举例说明本发明的不同特征。所述实施例还举例说明了对实践本发明有用的方法。这些实施例不限制所请求保护的发明。

实施例1：获得SR-B1特异性的噬菌体抗体的实验程序

筛选CAT(Cambridge抗体技术)噬菌体文库CS中与SR-B1结合的单链抗体。该文库提供了包含重链和轻链抗体的可变部分的单链抗体，所述抗体作为与pIII蛋白N末端的融合体暴露在丝状噬菌体的表面。V_H区通过Ser和GIy的接头与V_L区连接。

为了选择展示与SR-B1受体特异性结合的抗体的噬菌体，将整个细胞用于噬菌体浓缩。该文库(10¹¹噬菌体)与10⁷CHO细胞一起在室温下预温育1小时，随后离心。回收存在于上清液中的未结合的噬菌体并与稳定表达人SR-B1受体(SEQ ID NO：9)的CHO细胞一起温育1小时。细胞随后用PBS洗涤几次并重悬浮于洗脱缓冲液(triethylamina，100mM)中25分钟，随后用Tris.HCl调整pH。回收的噬菌体通过感染TG1细胞进行扩增并且如上所述实施另外2轮的选择。

在第3轮选择后，回收到3×10⁵噬菌体。在基于细胞的ELISA中利用表达SR-B1的CHO细胞以CHO细胞作为阴性对照平行地测试这些(144个噬菌体)样品。在这些噬菌体中，把11个噬菌体克隆记为SR-B1特异性的。随后测试克隆的HCV E2结合能力。

实施例2：HCV E2的抑制

编码产生于噬菌体背景外的SEQ ID NOs：1、2、3和4的克隆能够抑制HCV E2蛋白与HepG2细胞的结合。HepG2是人肝癌细胞系。

脱附细胞并在磷酸缓冲盐水(PBS)、0.2％BSA、10mM Hepes(洗涤缓冲液)中进行洗涤。允许4×10⁵细胞与不同浓度(0.5-5-20-40μg/ml)的单链抗体或无关的单链对照D5在室温下结合30分钟。细胞随后与重组的可溶性E2在室温下温育1小时。通过抗-E2大鼠mAb6/1a(Patel等人J.Gen.Virol.81：2873-2883，2000)和第二抗大鼠PE-缀合的mAb来揭示结合。通过FACS分析测量与细胞相关的荧光。

如图6中所示，SEQ ID NOs：1、2、3和4的抗-SRB1单链抗体抑制E2蛋白与HepG2细胞系的结合。垂直轴代表与HepG2细胞结合的E2蛋白的百分比，所述HepG2细胞指没有与抗体预温育的细胞。一式两份地进行实验，显示了一式两份样品的平均值。

实施例3：利用SEQ ID NO：2的单链抗体抑制HCV感染

利用SEQ ID NO：2的单链抗体举例说明能够抑制HCV E2结合的单链抗体也抑制HCV复制的能力。

将从外科的肝切除术中分离的人肝细胞以3×10⁵细胞/孔的密度接种在24孔微量培养板中。允许细胞附着和恢复24小时并随后更换新鲜培养基，所述新鲜培养基包含不同浓度的抗-SRB1单链抗体SEQ ID NO：2(25和5μg/ml)或对照的最高浓度的无关单链抗体FV(25μg/ml)。

将肝细胞与所示量的单链抗体在37℃预温育1小时，随后更换新鲜培养基，所述新鲜培养基包含相同量的单链抗体和来自HCV慢性患者的固定量(100μl)的感染性人血清。使细胞与病毒温育18小时以允许感染，随后洗涤并温育4天。提取总RNA并通过定量RT-PCR测量病毒复制。

一般地，在感染4天后检测到10⁴-10⁵基因组拷贝/孔。为了确定所测量的病毒RNA来源于活性复制，包括病毒复制酶的小分子抑制剂作为阳性对照。如图7中所示，SEQ ID NO：2的抗-SRB1单链(scFVC11)可以阻断培养的人肝细胞的HCV感染。

实施例4：由单链抗体产生IgG

产生包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4可变区的IgG4分子。使用对V_H和V_L区特异的引物通过PCR分别扩增SEQ ID NO：2或4可变区。该引物包含用于引入独特的限制位点的另外的核苷酸，以及代表剪接位点或编码另外的氨基酸的碱基。

将扩增产物导入两种分开的哺乳动物表达载体中：V_H插入包含用于表达人γ4重链的盒的pEU8.2中，而V_L导入到表达人λ轻链恒定区的载体pEU4.2中。两种载体在抗体的前导序列和恒定区序列之间携带内含子。该内含子包含适合于克隆被扩增的可变结构域的独特的限制位点。

IgG产生通过将V_H和V_L表达载体共转染到293-EBNA细胞(Invitrogen)中，其中利用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)并收集上清液最多8天来完成。根据厂商的说明书利用Hi-Trap A蛋白柱，Amersham，从细胞培养基中纯化IgG。

实施例5：利用抗-SRB1IgG抑制HCV E2蛋白结合

将稳定表达人SR-B1受体的Cho7s细胞(Scarselli等人，TheEMBO Journal 21(19)：5017-5025，2002)用于评估包含SEQ ID NO：2或4可变区的抗-SRB1 IgG抑制HCV E2结合的能力。脱附细胞并在磷酸缓冲盐水(PBS)、0.2％BSA、10mM Hepes(洗涤缓冲液)中进行洗涤。允许4×10⁵细胞与不同浓度(60-12-2.4μg/ml)的抗体在室温下结合30分钟。细胞随后与重组的可溶性E2(携带His-Tag)在室温下温育1小时。

通过抗-五His生物素缀合物以及链霉抗生物素蛋白-R-PE来揭示结合。通过FACS分析测量与细胞有关的荧光。如图8中所示，抗-SRB1 IgG4 SEQ ID NO：2和4抑制E2蛋白与Cho7s细胞系的结合。使用无关的IgG作为阴性对照。

其他实施方案在下述的权利要求内。尽管已显示并描述了几个实施方案，但在不背离本发明的精神和范围的情况下可进行各种修改。

序列表

<110>Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P.Angeletti S.p.A.

<120>针对清除剂受体B1的抑制HCV复制的抗原结合蛋白

<130>ITR0071 PCT

<150>60/586,356

<151>2004-07-08

<160>9

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>245

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单链抗体

<400>1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala

 1               5                  10                  15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Leu Thr Gly Asp Thr Phe Thr Asp Tyr

            20                  25                  30

Phe Ile Phe Trp Leu Gln Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Met

        35                  40                  45

Gly Leu Ile Asp Pro Lys Asp Ala Gln Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

            85                      90                  95

Ala Thr Asp Ser Val Gly Ala Ala Gly Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly

            100                 105                 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

        115                 120                 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser

    130                 135                 140

Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Phe Ser Cys Ser Gly Ser

145                 150                 155                 160

Gly Ser Ash Ile Gly Ser Tyr Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro

                165                 170                 175

Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu Met His Thr Thr Asp Gln Arg Ala Ser

            180                 185                 190

Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser

        195                 200                 205

Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys

    210                 215                 220

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr

225                 230                 235                 240

Lys Leu Thr Val Leu

                245

<210>2

<211>251

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单链抗体

<400>2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

 1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Asn Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

            20                  25                  30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly Ser Val Tyr Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Mer Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                   95

Cys Ala Arg His Val Leu Gly Gly Gly Trp Glu Val Ser Gln Arg Phe

            100                 105                 110

Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

        115                 120                 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Val

    130                 135                 140

Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr

145                 150                 155                 160

Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val Asn

                165                 170                 175

Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Thr

            180                 185                 190

Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys

        195                 200                 205

Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Leu Ser Glu Asp

    210                 215                 220

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Tyr

225                 230                 235                 240

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

                245                 250

<210>3

<211>245

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单链抗体

<400>3

Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

 1                5                 10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ser His

            20                  25                  30

Ala Ile Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                   40                  45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Arg Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

     50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Asp Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Asn Asp Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                 85                  90                  95

Ala Lys Thr Leu Asn Glu Gly Leu Pro Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

             100                105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

        115                 120                 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Gly

    130                 135                 140

Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asp

145                 150                 155                 160

Ser Ser Asn Ile Glu Ser Tyr Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Val Pro

                165                 170                 175

Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asp Asn Gln Arg Pro Ser

            180                 185                 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser

        195                 200                 205

Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

    210                 215                 220

Gly Ser Trp Asp Asp Asn Leu Asn Gly Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr

225                 230                 235                 240

Lys Val Thr Val Leu

                245

<210>4

<211>245

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单链抗体

<400>4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Thr

 1               5                  10                  15

Ala Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ala Gly Asp Thr Phe Thr Asp Tyr

            20                  25                  30

Phe Ile Tyr Trp Leu Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met

        35                   40                  45

Gly Leu Ile Asp Pro Lys Asp Ala Gln Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe

     50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65                   70                 75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                   90                  95

Ala Thr Asp Ser Val Gly Ser Ala Gly Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

        115                 120                 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser

    130                 135                 140

Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Phe Ser Cys Ser Gly Ser

145                 150                 155                 160

Gly Ser Ash Ile Gly Ser Tyr Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro

                165                 170                 175

Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu Met His Thr Thr Asp Gln Arg Ala Ser

            180                 185                 190

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser

        195                 200                 205

Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys

    210                 215                 220

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr

225                 230                 235                 240

Lys Leu Thr Val Leu

                245

<210>5

<211>735

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码SEQ ID NO：1

<400>5

gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaggaagc ctggggctac agtgaagatc    60

tcctgcaaat tgactggaga cacattcacc gactacttca tattttggct acaactggcc    120

cctggaaaag ggcttcagtg gatgggactt attgatccta aagatgctca aacaatatat    180

gcagagaagt tccagggcag agtcgccatc accgcggaca cgtctaccga cacagcctac    240

atggaagtga gcagcctgag atctgaagac acggccgtct attactgtgc aacagattct    300

gtgggagctg ctggatttga tgtctggggc cgagggacaa tggtcaccgt ctcgagtgga    360

ggcggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggaa gtgcactgcc tgtgctgact    420

cagcccccct cagcgtctgg ggcccccggg cagagggtca ccttctcttg ttctggaagc    480

ggctccaaca tcggaagtta tactgtaaac tggtaccagc agctcccagg agcggccccc    540

agactcctca tgcatactac tgatcagcgg gcctcagggg cgcctgaccg attctctggc    600

tccaagtctg gcacctcagc ctccctggcc atcactgggc tccagtctga ggatgaggct    660

gactatttct gtgcagcatg ggatgacagc ctggatggtc cggtgttcgg cggagggacc    720

aagctgaccg tccta                                                     735

<210>6

<211>753

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码SEQ ID NO：2

<400>6

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc    60

aactgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt actactgggg ctggatccgc    120

cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtgtct attatactgg gaacacctac    180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtccgtcg acacgtccaa gaaccagttc    240

tccctgaagc tgaactccgt gaccgccgca gacacggctg tgtactattg tgcgagacat    300

gttttagggg gagggtggga agtaagtcag agatttgact actggggccg gggcaccctg    360

gtcaccgtct cgagtggagg cggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggaagt    420

gcacagtctg tgttgacgca gccgccctca gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc    480

atctcttgtt ctggaagcag ctccaacatc ggaagtaatc ctgtaaactg gtaccagcag    540

ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc catactaaca atcagcggcc ctcaggggtc    600

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc    660

ctgtctgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgacagcct gaatgcttat    720

gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc cta                                 753

<210>7

<211>735

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码SEQ ID NO：3

<400>7

gaggtgcagc tggtggagac tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc    60

tcctgcaagg cttccggaga caccctcagc agtcatgcta tcatctgggt gcgacaggcc    120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttcgtac agtaaattac    180

gcacagaaat tccagggcag agtcacgatt accgcggacg attccacgag cacggcctac    240

atggaactca atgacttgag atctgaggac acggccgtct attactgtgc gaaaacgcta    300

aatgaggggt taccgtggga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcgagtgga    360

ggcggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggaa gtgcacagtc tgtgctgact    420

cagccacccg gagcgtctgg ggcccccggg cagagggtca ccatctcttg ttctggagac    480

agttccaaca tcgagagtta tgctgtaaat tggtaccagc aagtccctgg aatggccccc    540

aaactcctca tctatcgtga taatcagcgc ccctcagggg tccctgaccg attctctggc    600

tccaggtctg gcacctcagc ctccctggcc atcagtgggc tccagtctga ggatgaggct    660

gattattact gtggatcatg ggatgacaat ttgaatggcc ccacgttcgg cggagggacc    720

aaggtcaccg tccta                                                     735

<210>8

<211>735

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码SEQ ID NO：4

<400> 8

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaagc ctgggactgc agtgaaaatc    60

tcctgcaagg ttgctggcga cacattcacc gactacttca tatactggct gcaacaggcc    120

cctggaaaag ggcctgagtg gatgggactt attgatccta aggatgctca gacaatatac    180

gcagagaagt tccagggcag agtcgccata accgcggaca cgtctacgga cacagcttac    240

atggaactga gcagcctgaa gtctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagattct    300

gtgggatctg ctggttttga tgtctggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcgagtgga    360

ggcggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggaa gtgcactgcc tgtgctgact    420

cagcccccct cagcgtctgg ggcccccggg cagagggtca ccttctcttg ttctggaagc    480

ggctccaaca tcggaagtta tactgtaaac tggtaccagc agctcccagg agcggccccc    540

agactcctca tgcatactac tgatcagcgg gcctcagggg tgcctgaccg attctctggc    600

tccaagtctg gcacctcagc ctccctggcc atcactgggc tccagtctga ggatgaggct    660

gactatttct gtgcagcatg ggatgacagc ctggatggtc cggtgttcgg cggagggacc    720

aagctgaccg tccta                                                     735

<210>9

<211>509

<212>PRT

<213>人

<400> 9

Met Gly Cys Ser Ala Lys Ala Arg Trp Ala Ala Gly Ala Leu Gly Val

 1               5                  10                  15

Ala Gly Leu Leu Cys Ala Val Leu Gly Ala Val Met Ile Val Met Val

            20                  25                  30

Pro Ser Leu Ile Lys Gln Gln Val Leu Lys Asn Val Arg Ile Asp Pro

        35                  40                  45

Ser Ser Leu Ser Phe Asn Met Trp Lys Glu Ile Pro Ile Pro Phe Tyr

     50                 55                  60

Leu Ser Val Tyr Phe Phe Asp Val Met Asn Pro Ser Glu Ile Leu Lys

65                  70                  75                  80

Gly Glu Lys Pro Gln Val Arg Glu Arg Gly Pro Tyr Val Tyr Arg Glu

                 85                 90                  95

Phe Arg His Lys Ser Asn Ile Thr Phe Asn Asn Asn Asp Thr Val Ser

            100                 105                 110

Phe Leu Glu Tyr Arg Thr Phe Gln Phe Gln Pro Ser Lys Ser His Gly

        115                 120                 125

Ser Glu Ser Asp Tyr Ile Val Met Pro Asn Ile Leu Val Leu Gly Ala

    130                 135                 140

Ala Val Met Met Glu Asn Lys Pro Met Thr Leu Lys Leu Ile Met Thr

145                 150                 155                 160

Leu Ala Phe Thr Thr Leu Gly Glu Arg Ala Phe Met Asn Arg Thr Val

                165                 170                 175

Gly Glu Ile Met Trp Gly Tyr Lys Asp Pro Leu Val Asn Leu Ile Asn

            180                 185                 190

Lys Tyr Phe Pro Gly Met Phe Pro Phe Lys Asp Lys Phe Gly Leu Phe

        195                 200                  205

Ala Glu Leu Asn Asn Ser Asp Ser Gly Leu Phe Thr Val Phe Thr Gly

    210                 215                 220

Val Gln Asn Ile Ser Arg Ile His Leu Val Asp Lys Trp Asn Gly Leu

225                 230                 235                 240

Ser Lys Val Asp Phe Trp His Ser Asp Gln Cys Asn Met Ile Asn Gly

                245                 250                 255

Thr Ser Gly Gln Met Trp Pro Pro Phe Met Thr Pro Glu Ser Ser Leu

            260                 265                 270

Glu Phe Tyr Ser Pro Glu Ala Cys Arg Ser Met Lys Leu Met Tyr Lys

        275                 280                 285

Glu Ser Gly Val Phe Glu Gly Ile Pro Thr Tyr Arg Phe Val Ala Pro

    290                 295                 300

Lys Thr Leu Phe Ala Asn Gly Ser Ile Tyr Pro Pro Asn Glu Gly Phe

305                 310                 315                 320

Cys Pro Cys Leu Glu Ser Gly Ile Gln Asn Val Ser Thr Cys Arg Phe

                325                 330                 335

Ser Ala Pro Leu Phe Leu Ser His Pro His Phe Leu Asn Ala Asp Pro

            340                 345                 350

Val Leu Ala Glu Ala Val Thr Gly Leu His Pro Asn Gln Glu Ala His

        355                 360                 365

Ser Leu Phe Leu Asp Ile His Pro Val Thr Gly Ile Pro Met Asn Cys

    370                 375                 380

Ser Val Lys Leu Gln Leu Ser Leu Tyr Met Lys Ser Val Ala Gly Ile

385                 390                 395                 400

Gly Gln Thr Gly Lys Ile Glu Pro Val Val Leu Pro Leu Leu Trp Phe

                405                 410                     415

Ala Glu Ser Gly Ala Met Glu Gly Glu Thr Leu His Thr Phe Tyr Thr

            420                 425                 430

Gln Leu Val Leu Met Pro Lys Val Met His Tyr Ala Gln Tyr Val Leu

        435                 440                 445

Leu Ala Leu Gly Cys Val Leu Leu Leu Val Pro Val Ile Cys Gln Ile

    450                 455                 460

Arg Ser Gln Glu Lys Cys Tyr Leu Phe Trp Ser Ser Ser Lys Lys Gly

465                 470                 475                 480

Ser Lys Asp Lys Glu Ala Ile Gln Ala Tyr Ser Glu Ser Leu Met Thr

                485                 490                 495

Ser Ala Pro Lys Gly Ser Val Leu Gln Glu Ala Lys Leu

            500                 505