CDK2结合蛋白CINP通过ATM/ATR信号通路影响HCV复制的研究

摘要

丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。目前全球发现约有3％的人口(约1亿三千到1亿7千万)感染HCV，因此HCV感染已经成为全球关注的共同话题。虽然目前对HCV病毒的生活周期及机体的抗病毒机理进行了深入的研究，但是还是缺乏针对HCV有效的保护性疫苗和治疗方法。HCV是单链正链的RNA病毒，属黄病毒(Flavivwidae)科。HCV的基因组大小为9.6kb，包括一个大的开放阅读框(ORF)和两侧的5’，3，非编码区(NTRs)，总共编码10个有独立功能的HCV蛋白，根据功能的不同分别命名为C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。另外存在一种F蛋白(forframeshiftprotein)或称为ARFP蛋白(altematereadingframeprotein)，由HCV的C蛋白(coreprotein)的重叠阅读框翻译得来，目前尚不清楚其功能。
　　HCV的复制依赖以自身基因组的正链RNA为模板合成互补的负链RNA，再以该负链RNA为模板在体内大量合成正链RNA。在这个阶段，NS5B作为RNA依赖的RNA多聚酶(RdRp)发挥重要的作用，也因为如此NS5B成为许多抗病毒治疗的靶点。由于NS5B的C末端的21个疏水氨基酸负责将NS5B锚定在细胞膜，NS5B也被称为“tail-anchoredprotein”。HCV的复制需要形成膜相关的复制复合体(membrane-associatedreplicationcomplex)，因此NS5B的疏水氨基酸对于HCV在胞内的顺利复制是必不可少的。HCV的复制复合体由主要病毒蛋白、复制中的RNA以及一些改变的细胞质膜构成，而复制的场所主要在内质网膜、高尔基体、线粒体甚至是溶酶体。近年研究发现HCVRNA的复制与细胞脂代谢之间关系密切，主要是病毒蛋白与宿主蛋白通过脂质结构进行相互作用或者传递运输。
　　关于HCV复制的详细机制，目前研究并不是很透彻。已有的研究表明，许多宿主蛋白参与HCV复制。例如较早开始研究的免疫抑制剂环孢素A(cyclosporinA，CsA)，在体外实验研究中发现其能够抑制HCVRNA复制，主要机制是CsA的靶蛋白cyclophilinB通过与HCV的NS5B相互作用，从而增加NS5B的RNA结合能力。其他分子例如FK506结合蛋白FKBP8以及Hsp90均发现能与NS5A相互作用，影响HCVRNA复制。
　　本实验室前期研究通过酵母双杂交实验发现细胞周期依赖性激酶2结合蛋白(cdk2-interactingprotein，CINP)与HCVRNA依赖的RNA聚合酶NS5B有相互作用，并在体外及细胞免疫共沉淀实验中进行了证实。据此推测CINP可能参与调控HCV复制。为了验证这一想法，首先在亚基因组复制子细胞中干扰CINP，发现阻断CINP表达后HCVRNA水平下降。Westernblot结果显示HCV非结构蛋白NS5A、NS3表达下降，免疫荧光结果也发现CINP干扰组的NS5A阳性率明显减少。由于亚基因组Replicon细胞中，HCV病毒建立了长期稳定的复制周期，与真实个体的生存情况有一定的差异，因此利用新建立的HCVcc感染系统进一步验证了上述实验结果。结果发现，在HCVcc系统中，采用siRNA抑制CINP表达后HCV复制严重受损，表现为HCVRNA水平及NS5A、NS3、core蛋白水平明显下降。为进一步证实CINP蛋白对HCV感染性病毒颗粒的产生的影响，采用了感染实验检测病毒滴度。结果表明，干扰CINP能够显著抑制上清中HCV感染性颗粒的产生，并且这种抑制主要是通过抑制HCV复制实现的。为了进一步探讨CINP影响HCV复制的机制，研究首先检测CINP是否参与HCV复制复合体形成。利用细胞内免疫共沉淀检测CINP与构成HCV复制复合体的其他非结构蛋白(NS3/4A，NS5A)的相互作用，发现CINP与NS3/4A、NS5A均没有相互作用。并且免疫荧光激光共聚焦实验发现CINP与NS5A(近似代表HCVRC)也没有明显的共定位。此外，初步的体外酶活实验发现小剂量CINP对NS5B的酶活性没有明显影响，但是大剂量的CINP显著增强NS5B的酶活性。上述结果提示：CINP的正常表达使HCV顺利复制所必须，但是是否通过参与HCV复制复合体调控HCV复制，还有待进一步研究。
　　最近的研究报道发现，CINP是细胞周期检控点蛋白，与DNA损伤应答通路的重要分子ATRIP有相互作用，共同对抗由复制压力造成的细胞DNA损伤，起到保护细胞基因组稳定性的作用。有研究显示，在HCV亚基因组复制子细胞中应用DNA损伤通路抑制剂一定程度上可以下调HCVRNA水平，在HCVcc系统中也有类似结果。这些研究提示，CINP可能通过DNA损伤通路(主要是ATM/ATR通路)来实现对HCV的复制的调控。为此，首先在Huh7.5细胞中干扰CINP表达，再加入ATM/ATR通路激活剂HU/aphidicolin处理细胞，结果发现不能激活ATM/ATR信号传导通路，表现为磷酸化的ATM与ATR表达缺失，其下游的传导因子Chk1/Chk2的活化形式-磷酸化水平缺失。上述实验结果一方面验证了已有的文献报道，另一方面也完善了CINP对ATM通路影响的结果。进一步使用ATM/ATR小分子抑制剂(CGK733、KU55933)处理复制子细胞或HCVcc系统，发现应用这些抑制剂后HCVRNA水平下降，HCV非结构蛋白NS5A表达下调，提示ATM/ATR通路的活化为HCV复制所必须，而且抑制ATM/ATR通路活化后对HCV复制产生的影响与干扰CINP表达后类似，而阻断CINP表达对ATM/ATR路有明显的抑制作用。因此上述研究结果表明，CINP参与了ATM/ATR通路的活化，而ATM/ATR通路的活化是HCV病毒在细胞内顺利复制的必需条件。CINP对ATM/ATR通路的调节可能是其影响HCV复制的重要机制之一，这一发现也为临床研制抗HCV药物提供了一定的实验基础。