去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基

摘要

本发明提供一种可以使在体外培养中等去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞有效且容易地再分化成原来的软骨细胞的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基和去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法。所以，本发明提供用于使去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞向原来的软骨细胞再分化并含有胰岛素和从BMP－2及其类似物中选择的至少一种的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，和通过使用该去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基、培养去分化型软骨细胞，来使该去分化型软骨细胞向原来的软骨细胞再分化的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法。上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基更优选含有T3的方式。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于使在体外培养中等去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞再分化成原来的软骨细胞的、去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基。

背景技术

软骨构成耳、鼻、气管、关节、椎间盘等，在与骨一起保持身体的形态或进行日常生活动作方面发挥重要的作用。这样的软骨如果因关节软骨损伤等外伤、变形性关节病等年龄增加性疾病、关节风湿等炎症性疾病、肿瘤手术后的大型疾病、先天异常等受到损伤，则步行等生活动作变得困难或者不能保持身体外形等，而给日常生活带来显著障碍。与软骨相关的这些疾病等的患者数量众多，上述变形性关节病的发病人数每年据称达90万人，期望出现对这些疾病等的有效解决策略。

以往，针对这些疾病等，进行人工关节的利用、自身软骨的移植等处置，但因为存在耐久性、感染、供体部位损伤等问题，所以需要不存在这种问题的解决策略，对可以进行软骨再生医疗的技术开发的期待提高。

在上述软骨再生医疗中，必须确立软骨细胞的有效培养技术，对于软骨细胞的培养·增殖方法，尽管有很多报告(参照专利文献1和2)，但软骨细胞在培养中以极高的概率去分化，变化为成纤维细胞样，但作为在该软骨细胞去分化、变化为成纤维细胞样的去分化型软骨细胞下的情况的对应策略·解决策略，提出有利用静水压使去分化型软骨细胞再分化的方法、进行三维培养使其再分化成去分化型软骨细胞的方法等，但在这些方法的情况下，目前的现状是不能有效且容易地使上述去分化型软骨细胞再分化成原来的软骨细胞。为了实现上述软骨再生医疗，期望提供一种能够使在体外培养中等去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞有效且容易地再分化成原来的软骨细胞的技术。

专利文献1：特表2003-534792号公报

专利文献2：特表2004-502401号公报

发明内容

本发明的目的在于，解决以往存在的问题以实现以下目的。即，本发明的目的在于，提供去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基和去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，它们在鼻、耳、咽喉、关节等软骨的缺损·损伤部位的移植用原料、美容整形等美容用原料等的有效生产中很重要，软骨再生医疗的发展中可以做出贡献，能够使在体外培养中等去分化而变化成成纤维细胞样的去分化型软骨细胞有效且容易地再分化成原来的软骨细胞。

鉴于上述现状，本发明的发明人等进行了潜心研究，结果发现，在并用胰岛素与BMP-2时，优选还并用T3时，可以使去分化且软骨特性减弱的去分化型软骨细胞有效且容易地再分化成原来的软骨细胞。本发明是基于本发明人等的上述发现而提出的发明，用于解决上述课题的手段如下所述。即，

<1>一种去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其特征在于，用于使去分化且软骨特性减弱的去分化型软骨细胞向原来的软骨细胞再分化，含有胰岛素、和从BMP-2及其类似物中选择的至少一种。

<2>根据上述<1>所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其中，含有T3。

<3>根据上述<1>或<2>所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其中，BMP-2的类似物为BMP-4。

<4>根据上述<1>～<3>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其中，含有胰岛素0.05～500μg/mL。

<5>根据上述<1>～<4>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其中，含有从BMP-2及其类似物中选择的至少一种1ng/mL～40μg/mL。

<6>根据权利要求<1>～<5>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其中，含有10^-9～10^-5M的T3。

<7>根据权利要求<1>～<6>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其中，含有从成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、胰岛素样生长因子类(IGF-1)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素(GH)、糖皮质激素、维生素D、IL-1受体拮抗剂、雌激素、雄激素、转化生长因子α(TGFα)、转化生长因子β(TGFβ)、骨形态形成蛋白类(BMP)、表皮生长因子、血小板来源生长因子类、铁传递蛋白、亚硒酸、亚油酸、白蛋白、抗坏血酸、软骨调素(modulin)类、肝素结合因子、α成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、促细胞分裂激素、结缔组织生长因子、肝细胞生长因子、花生四烯酸、前列腺素A、前列腺素B、前列腺素E、前列腺素F、和组胺中选择的至少一种。

<8>根据上述<1>～<7>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其中，已再分化的软骨细胞选自玻璃软骨细胞和弹性软骨细胞。

<9>根据上述<1>～<8>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其中，已再分化的软骨细胞通过平面培养、三维培养和团块(pellet)培养的任意一种被培养。

<10>一种去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，其特征在于，通过使用上述<1>～<9>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，培养去分化且软骨特性减弱的去分化型软骨细胞，来使该去分化型软骨细胞向原来的软骨细胞再分化。

<11>根据上述<10>所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，其中，培养进行3～6周。

<12>根据上述<10>或<11>所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，其中，已再分化的软骨细胞中的II型胶原表达·产生量值C与去分化型软骨细胞中的II型胶原表达·产生量值D之间的比(C/D)，为1以上。

<13>根据上述<10>～<12>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，其中，在去分化型软骨细胞中，I型胶原表达·产生量为生物体内的软骨细胞的I型胶原表达·产生量以上，且II型胶原产生量为生物体内的软骨细胞的II型胶原表达·产生量以下，且II型胶原表达·产生量为去分化型软骨细胞的II型胶原表达·产生量以上。

<14>根据上述<10>～<13>中任意一项所述的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，其中，去分化型软骨细胞中的抗压强度、抗断裂强度和杨氏模量，大于再分化的软骨细胞中的抗压强度、抗断裂强度和杨氏模量大。

附图说明

图1的左图为培养开始后不久的软骨细胞(P0)的照片，右图为培养开始约30天、4次传代后的软骨细胞(P4)的照片。上图是表示培养开始后不久的软骨细胞(P0)与培养开始后约30天、4次传代后的软骨细胞(P4)中基因的表达状态的电泳带的有无的照片。

图2是表示使用含有胰岛素、BMP-2和T3的培养基和含有胰岛素和BMP-2的培养基培养的上述去分化型软骨细胞中I型胶原的表达量的测定结果的曲线图。

图3是表示使用含有胰岛素、BMP-2和T3的培养基和含有胰岛素和BMP-2的培养基培养的上述去分化型软骨细胞中II型胶原的测定结果的曲线图。

图4是表示使用含有胰岛素、BMP-2和T3的培养基和含有胰岛素和BMP-2的培养基培养的上述去分化型软骨细胞中X型胶原的表达量的测定结果的曲线图。

图5是表示比较研究含有胰岛素、BMP-2和T3的实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中该BMP-2含量的优选范围的结果的数据。

图6是表示比较研究含有胰岛素、BMP-2和T3的实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中该胰岛素含量的优选范围的结果的数据。

图7是表示比较研究含有胰岛素、BMP-2和T3的实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中该T3含量的优选范围的结果的数据。

图8是表示在向培养的去分化型软骨细胞的再分化用培养基中，胰岛素、BMP-2、T3的各含量分别为5μg/mL、200ng/mL、10^-7M的情况和除了用BMP-4代替上述BMP-2以外组成相同的培养基中的I型胶原的基因表达量的测定结果的曲线图。

图9是表示在向培养的去分化型软骨细胞的再分化用培养基中，胰岛素、BMP-2、T3的各含量分别为5μg/mL、200ng/mL、10^-7M的情况和除了用BMP-4代替上述BMP-2以外组成相同的培养基中的II型胶原的基因表达量的测定结果的曲线图。

图10是表示在向培养的去分化型软骨细胞的再分化用培养基中，胰岛素、BMP-2、T3的各含量分别为5μg/mL、200ng/mL、10^-7M的情况和除了用BMP-4代替上述BMP-2以外组成相同的培养基中的X型胶原的基因表达量的测定结果的曲线图。

图11是表示通过三维培养的三维培养物中作为机械性质的压缩强度的测定结果的曲线图。

图12是表示通过三维培养的三维培养物的照片数据。

图13是表示作为将使用去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的培养物移植到裸鼠的皮下2个月时的培养物的机械性质，测定压缩强度的结果的曲线图。

图14是表示将使用去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的培养物移植到裸鼠的皮下2个月时的培养物的照片数据。

具体实施方式

(去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基、和去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法)

本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，被用于使在体外培养中等去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞再分化成原来的软骨细胞，其含有胰岛素、和从BMP-2及其类似物中选择的至少一种而成，优选进一步含有T3而成，进一步含有根据需要适当选择的其它成分而成。

本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，包括使用本发明的上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，培养在体外培养中等去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞，由此使该去分化型软骨细胞再分化成原来的软骨细胞，还包括根据需要适当选择的其它处理等。

以下对本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基、和使用了该培养基的本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法进行说明。

对上述胰岛素没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以为市售品，也可以为适当合成的胰岛素。

上述胰岛素在上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的含量，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如优选0.05～500μg/mL。

如果上述胰岛素的含量不到0.05μg/mL，再分化会没有被诱导，如果超过500μg/mL，再分化的诱导有时被抑制。

上述BMP-2表示骨形成蛋白(bone morphogenetic protein-2)。作为该BMP-2，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以为市售品，也可以为适当合成的BMP-2。

作为上述BMP-2的类似物(analog)，没有特别限制，可以从公知的物质中适当选择，例如可以适当举出BMP-4等。

作为从上述BMP-2及其类似物中选择的至少一种，例如可以并用上述BMP-2和上述BMP-4，也可以单独使用上述BMP-2或上述BMP-4，但优选单独使用上述BMP-2。

作为从上述BMP-2及其类似物中选择的至少一种在上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的含量，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但例如优选1ng/mL～40μg/mL。

从上述BMP-2及其类似物中选择的至少一种的含量，如果不到1ng/mL，有时再分化没有被诱导，如果超过40μg/mL，再分化的诱导有时被抑制。

上述T3是指甲状腺激素(Triiodothryonine)。作为该T3，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以为市售品，也可以为适当合成的T3。

如果在上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中含有上述T3，与含有上述胰岛素和从上述BMP-2及其类似物中选择的至少一种的情况相比，不仅可以更有效地使上述去分化型软骨细胞再分化，而且还可以进一步有效地抑制被认为在成为骨时大量表达的X型胶原的表达，在这一点是有利的。

作为上述T3在上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的含量，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但例如优选10^-9～10^-5M。

上述T3的含量如果不到10^-9M，有时再分化没有被有效诱导，如果超过10^-5M，再分化的诱导会被抑制，如果在上述数值范围内，与含有上述胰岛素和从上述BMP-2及其类似物中选择的至少一种的情况相比，不仅可以更有效地使上述去分化型软骨细胞再分化，而且可以进一步有效抑制上述X型胶原的表达。

作为上述其它成分，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以适当举出能给上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化带来影响的物质、溶剂等。

作为上述可以给上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化带来影响的物质，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、胰岛素样生长因子类(IGF-1)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素(GH)、糖皮质激素(地塞米松等)、维生素D、IL-1受体拮抗剂、雌激素、雄激素(睾丸激素等)、转化生长因子α(TGFα)、转化生长因子β(TGFβ)、骨形态形成蛋白类(BMP)、表皮生长因子、血小板来源生长因子类、铁传递蛋白、亚硒酸、亚油酸、白蛋白、抗坏血酸、软骨调素类、肝素结合因子、α成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、促细胞分裂激素、结缔组织生长因子、肝细胞生长因子、花生四烯酸、前列腺素A、前列腺素B、前列腺素E、前列腺素F、和组胺等。

它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。

作为上述溶剂等，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以适当举出水等。

作为上述水，可以举出灭菌水、超纯(millipore)Q水等。

作为上述其它成分在上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的含量(总量)，没有特别限制，可以根据目的适当选择。

述去分化型软骨细胞作为利用本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的培养对象，为软骨细胞在体外培养中等去分化而软骨特性减弱的细胞。

在本发明中，上述软骨特性是指在生物体内的上述I型胶原和上述II型胶原的表达·产生量，该软骨特性减弱，是指上述I型胶原的表达·产生量(A)与去分化成该去分化型软骨细胞之前的上述软骨细胞(去分化前软骨细胞)中的上述I型胶原的表达·产生量(B)之间的比(A/B)为1以上，或者上述II型胶原的表达·产生量值C与去分化成该去分化型软骨细胞之前的上述软骨细胞(去分化前软骨细胞)中的上述II型胶原表达·产生量D之间的比(C/D)为1以下。

此外，上述去分化前软骨细胞是指上述去分化型软骨细胞来源的生物体内的软骨细胞。

对于是否为上述软骨特性减弱的去分化型软骨细胞或者是否为上述去分化前软骨细胞或从上述去分化型软骨细胞再分化的软骨细胞(再分化软骨细胞)，可以基于上述I型胶原表达·产生量、上述II型胶原表达·产生量、上述X型胶原的表达·产生量、抗压强度、抗断裂强度、杨氏模量、平衡压迫系数等进行判断。

即可以判断，就上述II型胶原的表达·产生量比生物体内的软骨细胞少、上述I型胶原的表达·产生量比生物体内的软骨细胞多、且抗压强度、抗断裂强度、杨氏模量、平衡压迫系数等比生物体内的软骨组织低的细胞而言，为上述去分化型软骨细胞的可能性高，另一方面，就上述I型胶原表达·产生量少、上述II型胶原表达·产生量多、且抗压强度、抗断裂强度、杨氏模量、平衡压迫系数等比刺激前的去分化型软骨组织高的细胞而言，为上述再分化型软骨细胞的可能性高。

在此，上述软骨细胞产生软骨基质，对利用甲苯胺蓝的染色具有变色现象，可以通过甲苯胺蓝染色来识别。

在上述软骨细胞中，通常I型胶原的表达·产生量少，被认为在成骨时大量表达的X型胶原的表达·产生量少，II型胶原的表达·产生量多，另外，通常COL2A1基因、COL9A1基因、COL11A2基因、Aggrecan基因、Matrillin3基因、和Chondromodulin 1基因中的至少一种，与上述去分化型软骨细胞相比，高度表达。

所以，如果观察到上述软骨细胞中的上述I型基因表达·产生量，有可能是该软骨细胞发生去分化，变化成成纤维细胞样的去分化型软骨细胞。此外，上述COL2A1基因、上述COL9A1基因、上述COL11A2基因、上述Aggrecan基因、上述Matrillin3基因、和上述Chondromodulin 1基因，是在上述软骨细胞中高度表达的基因，这些基因与作为这些基因的表达结果的II型胶原等蛋白质，可以成为正常细胞的标记物。此外，除了这些以外，蛋白多糖等也可以作为正常细胞的标记物。

作为上述软骨细胞的具体例子，例如可以举出关节软骨细胞(关节软骨非负重部分来源的软骨细胞)、肋软骨细胞(肋软骨来源的软骨细胞)等玻璃软骨细胞，耳廓软骨细胞(耳廓软骨来源的软骨细胞)等弹性软骨细胞等。

它们通常可以单独使用1种，还可以并用2种以上。

上述再分化软骨细胞与上述去分化前软骨细胞相同，在该再分化软骨细胞中，该上述II型基因表达·产生量值C与上述去分化型软骨细胞中的上述II型基因表达·产生量值D之间的比(C/D)，只要超过1，就没有特别限制，优选为10以上，更优选为100～1000。

作为上述去分化型软骨细胞相对于上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的接种细胞量，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如优选10⁵～10⁹个/mL左右，更优选10⁶～10⁸个/mL。

上述去分化型软骨细胞的接种细胞量如果不到10⁵个/mL，细胞可能成为低营养状态，如果超过10⁹个/mL，则细胞可能成为低氧·低营养状态。

作为接种于上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的上述去分化型软骨细胞，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出软骨细胞在体外的培养中去分化而变化成上述去分化型软骨细胞的细胞、作为上述去分化型软骨细胞抽提等得到的细胞，但优选举出前者。

作为上述去分化型软骨细胞在上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的培养条件，没有特别限制，可以根据目的适当选择。

作为上述培养中的培养时间，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但例如通常为1周以上，优选为3～6周。

上述培养时间如果不到1周，则不会充分发生再分化。

作为上述培养中的温度，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如通常为32～42℃，优选为34～39℃。

上述培养温度如果不到32℃，有时会引起再分化障碍或细胞死亡。

作为上述成倍生长的氧分压，没有特别限制，可以根据目的适当选择，通常为10～30％，优选为15～25％。

上述氧分压如果不到10％，则会引起再分化障碍或细胞死亡。

作为上述培养中的pH值，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如通常为6～8左右，优选为6.5～7.5。

上述pH值如果不到6或超过8，则有时会引起再分化障碍或细胞死亡。

作为上述培养的形态，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出平面培养(单层培养)、三维培养、团块培养等。

它们可以单独采用1种，也可以并用2种以上。其中，优选三维培养。

上述平面培养(单层培养)例如是在板、皿上进行的二维培养。

上述三维培养例如是在胶原、纤维蛋白、透明质酸等形成的三维基材(支架原料)上或内部进行的培养。

上述三维培养例如可以使用端胶原(アテロコラ-ゲン)(川研公司制)等市售的材料进行。

作为上述三维基材(支架原料)，没有特别限制，可以根据目的对其原料、性状、结构、尺寸等适当选择。

作为上述原料，例如可以举出聚-D-交酯、聚-L-交酯、聚-DL-交酯、聚乙醇酸、聚乳酸、羟基磷灰石、磷酸钙、磷酸钙、羟磷灰石、端胶原、胶原、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂、明胶等。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。其中，适当举出端胶原等。

作为上述性状，例如可以适当举出凝胶状等。

作为上述形状，例如可以基于移植中使用的移植用原料、美容用原料等形状适当选择。

作为上述结构，通常可以适当举出多孔结构、筛网结构、海绵结构等。

上述团块培养是剥落上述平面培养之后的软骨细胞、在培养液中轻轻离心进行的培养。如果利用该团块培养，可以得到圆团块状的培养细胞。该团块培养可以使培养细胞高密度凝聚。

利用使用了本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，从上述去分化型软骨细胞再分化的上述软骨细胞(再分化软骨细胞)，可以形成鼻、耳、咽喉、关节等的软骨缺损·损伤部位的移植用原料、美容整形等的美容用原料等。

作为上述已再分化的软骨细胞(再分化软骨细胞)的培养乃至增殖，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出上述的平面培养(单层培养)、三维培养、团块培养等。

它们可以单独进行，也可以进行2种以上，但其中适当举出三维培养。

上述软骨细胞如果以软骨再生医疗等为目的使其进行体外培养·增殖等时，存在比较容易去分化而变化成成纤维细胞样的去分化型软骨细胞的问题，但利用本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基或本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，可以使该去分化型软骨细胞有效且容易地向上述软骨细胞再分化。所以，利用本发明，进一步培养再分化的软骨细胞(再分化软骨细胞)得到的软骨(软骨细胞块)，通过埋入到软骨缺损部位等，可以很好地用于治疗与软骨相关的各种疾病。本发明可以使用培养患者的软骨细胞得到的细胞作为上述软骨(软骨细胞块)，将其返回到该患者而利用，在软骨再生医疗等中可以很好地使用。

实施例

以下对本发明的实施例进行说明，但这些实施例对于本发明不具有任何限定作用。

-软骨细胞的利用去分化而向去分化型软骨细胞的分化-

向皿中添加10mL在5质量％FBS(胎牛血清)中含有FGF-2(成纤维细胞生长因子-2)和IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、胰岛素、铁传递蛋白、硒酸等的软骨细胞增殖培养基(Cambrex公司制)，在该皿内适当传代软骨细胞(人耳廓软骨来源，20万细胞)，平面培养(单层培养)30天。此外，上述平面培养(单层培养)在37℃、30天、pH7、氧分压20％的条件下进行。

图1的左图为培养开始后不久的软骨细胞(P0)的照片，图1的右图为培养开始约30天、4次传代后的软骨细胞(P4)的照片。图1的上图是表示培养开始后不久的软骨细胞(P0)与培养开始后约30天、4次传代后的软骨细胞(P4)中的I型胶原、II型胶原及GAPDH(甘油醛-6-磷酸脱氢酶)的基因表达的电泳带的有无的照片。

从这些照片可知，在培养开始后不久的软骨细胞(P0)中，表达II型胶原，I型胶原不表达。这表示软骨细胞(去分化前软骨细胞)的特征，确认了培养开始后不久的软骨细胞(P0)没有去分化。另一方面，在自培养开始后约30天、4次传代后的软骨细胞(P4)中，II型胶原的表达量减少，I型胶原表达。这是表示去分化型软骨细胞的特征的现象，确认了从培养开始后约30天、4次传代后的软骨细胞(P4)已经去分化。-去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化-

接着，对自培养开始后约30天、4次传代后的软骨细胞(P4)即去分化型软骨细胞，分别使用在基础培养基Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium Nutrient Mixture F-12 HAM(DMEM/F12、Sigma Chemical公司制)中含有胰岛素(MP Biomedicals公司制胰岛素)5μg/mL和BMP-2(山之内制药公司制人重组骨成形蛋白-2)200ng/mL的培养基(实施例1的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基)、和除了这些以外还含有T3(EMD Bioscience公司制L-3，3’，5’-三碘甲状腺原氨酸)10^-7M的培养基(实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基)，将上述去分化型软骨细胞的20万细胞端胶原三维包埋培养7天。该培养相当于本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法。

对使用这2种培养基培养的上述去分化型软骨细胞中的I型胶原(Col-I)、II型胶原(Col-II)和X型胶原(Col-X)的表达量进行测定。就这些结果而言，将上述去分化型软骨细胞(对照，control)中的I型胶原的表达量显示于图2，II型胶原的表达量显示于图3，和X型胶原的表达量显示于图4。此外，在图2～4中的“BI”是指含有上述BMP-2和上述胰岛素的情况，“BIT”是指含有上述BMP-2、上述胰岛素、和上述T3的情况。

从图2～4所示的结果可知，在使用含有胰岛素和BMP-2的实施例1(BI)的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，培养上述去分化型软骨细胞的情况下，与上述对照(control)的去分化型软骨细胞相比存在下述趋势，即上述去分化型软骨细胞中特征性的I型胶原的表达量减少，上述软骨细胞中特征性的II型胶原的表达增加，在软骨被骨置换时可见表达的X型胶原的表达量略微增加。使用含有胰岛素和BMP-2的实施例1(BI)的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基培养上述去分化型软骨细胞情况下的II型胶原表达·产生量的值C、与上述对照(control)的去分化型软骨细胞的II型胶原表达·产生量的值D的比(C/D)，约为10。

另外，在使用含有胰岛素、BMP-2、和T3的实施例2(BIT)的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基培养上述去分化型软骨细胞的情况下，与上述对照(control)的去分化型软骨细胞相比存在下述趋势，即上述去分化型软骨细胞中特征性的I型胶原的表达量大幅度减少，上述软骨细胞中特征性的II型胶原的表达量大幅度增加，在软骨被骨置换时可见表达的X型胶原的表达量有减少。使用含有胰岛素、BMP-2、和T3的实施例2(BIT)的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基培养上述去分化型软骨细胞情况下的II型胶原表达·产生量的值C、与上述对照(control)的去分化型软骨细胞的II型胶原表达·产生量的值D的比(C/D)，为20以上。

从这些结果可以判断，通过使用上述实施例1和实施例2中的各去分化软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基培养去分化并分化成上述去分化型软骨细胞的细胞，可以使其再分化成软骨细胞。另外，还可以判断，在使用实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的情况下，与使用实施例1的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的情况相比，可以使上述去分化型软骨细胞有效且容易地向上述软骨细胞再分化。

-去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的成分配合量的研究-

根据以下的3种比较研究，可知含有胰岛素、BMP-2、和T3的实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的该胰岛素、该BMP-2及该T3的各含量的优选范围。

即，首先使胰岛素含量为5μg/mL，T3含量为10^-7M，BMP-2含量分别为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL，其结果，在该BMP-2的含量为200ng/mL的情况下，II型胶原的表达量最多(图5)。

接着，使胰岛素含量为5μg/mL，BMP-2为200ng/mL，T3含量分别为10^-6M、10^-7M、10^-8M，其结果，在该T3的含量为10^-7M的情况下，II型胶原的表达量最多(图6)。

接着，使BMP-2含量为200ng/mL，T3含量为10^-7M，胰岛素含量分别为50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL，其结果，在该胰岛素的含量为5μg/mL的情况下，II型胶原的表达量最多(图7)。

从以上结果可以判断，实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的胰岛素、BMP-2、T3的各含量分别为5μg/mL、200ng/mL、10^-7M时，去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化能力出色。-类似物的影响的研究-

接着，在将本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的上述BMP-2置换成作为其类似物的BMP-4时，对上述去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化带来的影响进行如下调查。即，实施例1的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的胰岛素、BMP-2的各含量分别为5μg/mL、200ng/mL的情况；实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的胰岛素、BMP-2、T3的各含量分别为5μg/mL、200ng/mL、10^-7M的情况；除了将该实施例2的培养基中的上述BMP-2用BMP-4替代以外，使用相同组成的培养基，与上述一样进行去分化型软骨细胞的培养。测定培养后的该去分化型软骨细胞中I型胶原表达量、II型胶原表达量和X型胶原表达量。就其结果而言，将作为对照(control)的去分化型软骨细胞中I型胶原的表达量显示于图8，II型胶原的表达量显示于图9，X型胶原的表达量显示于图10。此外，在图8～10中的“BI”是指含有上述BMP-2和上述胰岛素的情况，“BIT”是指含有上述BMP-2、上述胰岛素、和上述T3的情况，“BMP-4”是指含有上述BMP-4、上述胰岛素、和上述T3的情况。

使用含有胰岛素、BMP-4和T3的培养基培养上述去分化型软骨细胞情况下的II型胶原表达·产生量的值C与上述对照(control)的去分化型软骨细胞的II型胶原表达·产生量的值D的比(C/D)，为20以上。

如从图8～10的结果所了解的那样，可以判断，即使在将实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基中的上述BMP-2用作为其类似物的BMP-4代替的情况下，显示出与实施例2中的情况大致相同的向软骨细胞的再分化能力。

-已再分化的软骨细胞的培养物的机械性质-

接着，对于自培养开始后约30天、4次传代后的软骨细胞(P4)即分化成去分化型软骨细胞的细胞，使用在基础培养基Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium Nutrient Mixture F-12 HAM(DMEM/F12、Sigma Chemical公司制)中含有胰岛素(MP Biomedicals公司制胰岛素)5μg/mL和BMP-2(山之内制药公司制人重组骨成形蛋白-2)200ng/mL的培养基(实施例1的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基)和除了这些以外还含有T3(EMD Bioscience公司制L-3，3’，5’-三碘甲状腺原氨酸)10^-7M的培养基(实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基)，将上述去分化型软骨细胞的20万细胞端胶原三维包埋培养21天。该培养相当于本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法。

如图11所示，利用该三维培养的三维培养物中作为机械性质的压缩强度(gr)(利用アキシム公司制ビ一ナストロン测定)，与用不含胰岛素、BMP-2和T3的培养基同样培养的作为对照(control)的软骨细胞的培养物相比，显示出增加趋势(参照图11和图12)。此外，图11和图12中的“BI”是指含有上述BMP-2和上述胰岛素的情况，“BIT”是指含有上述BMP-2、上述胰岛素、和上述T3的情况。

-已再分化的软骨细胞的培养物的机械性质-

接着，使用实施例1的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基和实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，将上述去分化型软骨细胞的20万细胞端胶原三维包埋培养21天，将上述培养物移植到裸鼠2个月，然后与上述同样地测定移植后的该培养物的压缩强度(gr)。

如图13所示，在使用实施例2的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基的培养物中，上述压缩强度(gr)得出比作为上述对照(control)的软骨细胞的培养物高的结果，显示出与生物体内的耳廓软骨(天然软骨(native cartilage))大致相同的抗压强度(参照图13和图14)。此外，图13和图14中的“BI”是指含有上述BMP-2和上述胰岛素的情况，“BIT”是指含有上述BMP-2、上述胰岛素、和上述T3的情况。

产业上的可利用性

本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基和去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，可以很好地用于使在体外培养中等去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞有效且容易地再分化成软骨细胞，并使其继续培养。利用本发明的去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基和去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化方法，从去分化型软骨细胞再分化而培养·增殖的软骨细胞可以很好地用于鼻、耳、咽喉、关节等软骨缺损·损伤部位的移植用原料、美容整形等美容用原料等，在软骨再生医疗中极为有用。