玉米成熟胚途径的愈伤组织诱导及植株再生方法

摘要

本发明属于植物组织和细胞培养技术领域。具体涉及一种利用玉米自交系成熟胚途径的植株再生方法，其特征在于，先将所述的玉米自交系成熟胚诱导产生胚芽，由该胚芽诱导产生愈伤组织，选取其中的胚性愈伤组织，不经过继代培养，直接再生为完整植株。与现有技术相比，省略掉现有技术中工作量较大、耗时较长的继代过程，快速诱导胚性愈伤组织并直接转入分化过程产生绿苗。再生体系构建时间较现有技术显著缩短，并且扩大了能够应用植物组织培养技术的玉米自交系种类。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织和细胞培养技术领域，与玉米的组织培养有关，具体涉及一种利用玉米成熟胚途径诱导愈伤组织，不经过继续代培养直接再生完整植株的方法。

背景技术

玉米(Zea may.L.)是世界上种植范围非常广泛的作物，主要用途为粮食和饲料，随着世界人口的增长以及畜牧业的发展，玉米在农业生产中占有越来越重要的地位。

在玉米的遗传转化中，具备胚性愈伤组织培养和再生体系的转化受体系统是首选的方法。玉米转化受体系统构建一般选择分化程度低，分生能力强的组织作为诱导或转化材料，如花粉、花药、幼穗、幼胚、茎尖、幼苗茎段、叶鞘、种子发芽不久的各种组织部位。Green和Phillips(1975)首次报道从玉米幼胚诱导出愈伤组织并成功的获得了再生植株，此后大部分研究者利用玉米幼胚作为玉米组织培养的主要外植体。但是幼胚作为外植体存在着很大的局限性。它受到严格的时间限制，只能在玉米生长的特定阶段进行取胚的工作，不能根据科研工作的需要随时获取幼胚进行组织培养。

许多研究者对玉米成熟胚途径的诱导进行了研究。与幼胚相比，成熟胚诱导的优势主要体现在它易于操作，可以不受季节的限制随时获得愈伤组织。现有的方法大致如下，将成熟胚放在含有不同激素组合的MS或N6培养基上或改良的MS或N6的培养基上，诱导形成愈伤组织，愈伤组织经过继代培养数次，再转于分化培养基诱导分化直至成苗后移栽。郭丽红等以玉米自交系晴3、大黄的成熟胚和玉米根尖为材料，在MS培养基上诱导产生愈伤组织，经过5次继代培养，再转于悬浮培养，建立了玉米悬浮细胞系(郭丽红等，玉米根尖和成熟胚的愈伤组织培养及悬浮系的建立，云南大学学报(自然科学版)，1999，21(1)，P141-144)。王春英等对16份玉米自交系成熟胚用N6培养基诱导，每25天继代一次，应用组织培养产生的变异经筛选获得了一些抗病性增强的玉米自交系(王春英等，应用细胞工程技术提高玉米骨干自交系抗病增产研究，山东农业科学，2001年，第1期，P4-6，15)。曹俊梅等对30个基因型的玉米成熟胚在MS、N6两种基本培养基上进行离体培养，愈伤组织每20天继代一次，经分析诱导率，得出基因型是影响成熟胚愈伤组织诱导能力和愈伤组织质量的重要因素的结论(曹俊梅等，基因型及生长调节物质对玉米成熟胚培养的影响，淮阴师范学院学报(自然科学版)，2005，Vol14 No12.，P154-158)。曹俊梅等还对13种鲜食玉米为主的玉米自交系成熟胚与幼胚以N6作为诱导及分化培养基，愈伤组织每2-3周继代一次，发现几乎所有自交系继代中逐渐褐化(曹俊梅等，玉米幼胚和成熟胚愈伤组织分化反应性比较，新疆农业大学学报，2005，28(2)，P10-13)。王昌涛等利用自交系18红和18白的幼胚、茎尖、成熟胚作为外植体，在MS培养基上诱导，成熟胚接种型愈伤组织。经继代培养，愈伤组织褐化死亡(王昌涛等，玉米不同外植体愈伤组织的诱导及植株再生的研究，沈阳农业大学学报，2005，36(5)P515-518)陈莉等对45份甜玉米自交系的成熟胚以N6为诱导及分化培养基，继代2次，再进行分化，只有自交系B12-2-2和A50分化出了绿苗(陈莉等，甜玉米成熟胚的组织培养及其植株再生研究，江苏农业科学2006年，第66期，P75-79)；陈莉等还以杂交种TD08和两种对照材料Z31、P138的成熟胚和茎尖作为外植体，在N6培养基上诱导，经继代后发现三种材料的成熟胚愈伤组织出现褐化(陈莉等，玉米成熟胚和茎尖愈伤诱导及其植株再生能力比较，新疆农业大学学报，2006，29(3)，P46-49)。

综上所述，玉米成熟胚途径的再生体系构建要经过诱导、继代培养，产生胚性愈伤组织之后再进行植株再生的完全过程。这一过程通常耗时较长，操作多而繁琐，需要多次更换培养基，工作量很大。上述文献的程序和培养基并非适用于所有的玉米自交系，受基因型的限制很大。很多玉米自交系经过继代培养后，愈伤组织的状况变差，逐渐褐化，不能进行分化，这些玉米自交系无法用现有的程序完成整个组织培养过程。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种只需经过一次愈伤组织诱导，不需经过继代培养就能直接分化和再生玉米植株方法。本发明利用优化的培养基和简化培养程序，仅通过诱导过程即可从多个基因型的玉米自交系成熟胚培养中获得胚性愈伤组织，不经过继代培养，将获得胚性愈伤组织直接进行分化培养即可再生成苗。与现有技术比较，本发明可以省略漫长繁琐的继代过程，有效的缩短了玉米成熟胚途径构建再生体系的时间，简化了操作过程并能有效降低消耗，扩大了能够应用组织培养技术的玉米自交系种类。

本发明是这样实现的：

一种玉米成熟胚途径的愈伤组织培养及植株再生方法，该方法是先诱导产生胚性愈伤组织，不经过继代培养过程，直接转入分化培养过程从而再生完整植株，它包括以下步骤：

a)将消毒后的玉米种子放在含有2，4-D的铺有湿滤纸的培养瓶中诱导萌发至胚芽长度在2-5mm之间；

b)切取a)得到的胚芽并将该胚芽轴向切成两半作外植体，将其切面向下置于诱导培养基上，诱导出愈伤组织；

c)从步骤b)的愈伤组织中挑选胚性愈伤组织接种到分化培养基上得到丛生苗；

d)将步骤c)得到的丛生苗分成单个苗，转入生根培养基上再生为完整植株。

所述的培养基如下：

愈伤组织诱导培养基：N6大量元素+N6微量元素+B5有机物+甘氨酸2.0mg/L+L-脯氨酸0.69g/L+水解酪蛋白1g/L+蔗糖30g/L+2，4-D3mg/L+L phytagel2.5g/+AgNO₃10mg/L，补充水分至1L，pH5.8；

愈伤组织分化培养基：N6大量元素+N6微量元素+B5有机物+甘氨酸2.0mg/L+蔗糖30g+phytagel2.5g/L+6-BA0.6mg/L，补充水分至1L，pH5.8；

生根培养基：1/2MS基本培养基+IBA 0.5mg/L+蔗糖15g/L+phytagel2.5g/L，补充水分至1L，pH5.8。

本发明中所涉及的愈伤组织的命名、形态符合以下定义。初生愈伤组织是将胚芽接种到诱导培养基上后，外植体迅速增殖产生的初级形态的愈伤，通常为松软的、微黄色愈伤。胚性愈伤组织是由初生愈伤组织转化而来的结构紧凑、松脆易碎、表面不规则的淡黄色或乳色愈伤(李浚明等编译，植物组织培养教程(第三版)，中国农业大学出版社，2005年出版；Huang等，High-frequency plant regeneration through callus initiation from matureembryos of maize(Zea Mays L.).Plant Cell Rep，2004，22：793-800)。

本发明与现有技术的操作过程不同的是：现有技术是将玉米成熟胚诱导形成初生愈伤组织，再通过继代(通常继代2次以上，每次2-3周)的培养，才能使部分初生愈伤组织可以转化为胚性愈伤组织，再经过分化成苗(从玉米成熟胚愈伤组织诱导到分化再生体系必须经历一个较为漫长的继代过程)。

本发明的积极效果是：对现有技术进行了创新改进，省略掉现有技术中工作量较大、耗时较长的继代过程，快速诱导胚性愈伤组织并直接转入分化过程产生绿苗。再生体系构建时间较现有技术显著缩短，并且扩大了能够应用植物组织培养技术的玉米自交系种类。

附图说明

附图1-8是实施例中的玉米自交系成熟胚诱导再生完整植株的技术流程和培养物的各发育阶段的状态

图1是玉米自交系种子萌发至可取胚芽的状态

图2是玉米自交系种子诱导的胚芽进行诱导培养的起始状态

图3是胚芽诱导培养2-3天的生长状况

图4是胚芽在2-3周诱导培养后形成的初生愈伤组织形态

图5玉米自交系诱导培养3-5周后初生愈伤组织转化形成的胚性愈伤组织(与图4有明显区别)

图6是玉米自交系诱导产生的胚性愈伤组织转入分化培养基分化1周后愈伤组织表面形成绿色芽点

图7是将诱导产生的胚性愈伤组织转入分化培养基2周后分化出的丛生苗

图8是将图7的丛生苗诱导生根

具体实施方式

实施例1

1、材料来源及外植体制备

本发明的实验材料从72个玉米自交系(包含72种玉米基因型)中筛选而来。申请人在对72种基因型的玉米自交系的愈伤组织诱导培养中，从诱导培养3周的初生愈伤组织中筛选出表现出胚性愈伤组织转化的趋势的愈伤组织，延长1-2周诱导培养，挑选其中的胚性愈伤组织，不再经过继代培养，而将其直接转入分化培养基进行分化培养。申请人挑选了胚性愈伤组织诱导效率较高的HZ35、HZ115、HZ121(该三份玉米自交系种子已于2005年9月20日对外销售)、中134(中国农业大学玉米改良中心提供)和18-599R(四川农业大学玉米研究所提供)5个玉米自交系，于2005、2006年春季播种，在严格自交授粉条件下获得玉米自交系种子。

将上述玉米自交系完整饱满的种子按常规方法进行消毒(参见李浚明等编译，植物组织培养教程(第3版)，中国农业大学出版社，2005年出版)，将消毒后的种子放在含有4mg/L的2，4-D的铺有湿滤纸的培养瓶中诱导萌发(萌发须在暗条件下进行)，培养温度为27±1℃。经48-72小时的暗培养后，使种子发芽(在萌发过程中，应定时查看，以防止胚芽萌发过长(其长度控制在2-5毫米范围内)，影响诱导效率)，得到本发明所述的外植体，即胚芽。

2、培养基制备

按照常规方法制备培养基和灭菌(参见：李浚明等编译，植物组织培养教程(第三版)，中国农业大学出版社，2005年出版)。

愈伤组织诱导培养基：N6大量元素+N6微量元素+B5有机物+2.0mg/L甘氨酸+0.69g/L L-脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3mg/L 2，4-D+2.5g/L phytagel(一种植物凝胶，又称非特胶)+10mg/L AgNO₃(AgNO₃溶液采用抽滤灭菌，在培灭菌后添加)，补充水分至1L，pH5.8。

分化培养基：N6大量元素+N6微量元素+B5有机物+2.0mg/L甘氨酸+30g蔗糖+0.6mg/L 6-BA+2.5g/L phytagel，补充水分至1L，pH5.8。

生根培养基：1/2MS培养基+IBA 0.5mg/L+蔗糖15g/L+2.5g/L phytagel，补充水分至1L，pH5.8。

以上培养基中的N6大量元素、N6微量元素、MS基本培养基成分和B5有机物的成分参见：李浚明、朱登云编译，植物组织培养教程(第3版)，中国农业大学出版社，2005年出版，24-26页。

培养基中的各组分的简称如下，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)。

3、培养条件

在本实施例中，愈伤组织的诱导培养、分化培养以及生根培养均在组织培养室内进行在愈伤组织培养阶段，不需要光照的暗培养条件是：温度：27±1℃，培养时间：24h。在分化培养和生根培养阶段采用光照培养室培养，培养温度：26±1℃，光照强度：1500-2000lx，每天光照14h。

4、接种与培养

在超净工作台上无菌操作将玉米自交系萌发的胚芽切下长为2-4mm胚芽，并该胚芽轴向切成两半作为外植体，将外植体的切面向下置于愈伤组织诱导培养基上(如图B所示)。每培养皿接种20-24块外植体(轴向对半切开的胚芽)，27±1℃暗培养。培养开始2-3天，外植体体积开始膨胀、卷曲(如图C所示)。诱导培养2-3周后，大多数外植体长出了松软的、微黄色的初生愈伤组织(如图D所示)。继续培养1-2周之后，部分初生愈伤组织转变成结构紧凑、松脆易碎、表面不规则的淡黄色或乳色胚性愈伤组织(如图E所示)。将诱导产生的胚性愈伤组织转入所述的分化培养基中进行分化。分化培养1周后，在胚性愈伤组织表面即形成多处绿色芽点(如图F所示)，继续培养1周后，开始有丛生苗分化出来(如图G所示)，将丛生苗分割开，每个苗分别转于生根培养基诱导生根(如图H)。本实施例的效果见表1。

表1：本发明实施例选用玉米自交系材料的愈伤诱导情况

    自交系初生愈伤组织诱导率(100％)胚性愈伤组织诱导率(100％)分化率(100％)    HZ3598.1％43.4％4.4％    HZ11597.5％36.6％3.4％    HZ12198.7％49.4％7.1％    中13494.7％50.9％4.7％    18-599R91.5％55.0％8.0％