中药有效成分谱筛选方法

摘要

本发明是一种中药有效成分谱筛选方法。其特征在于经：1)获得中药化学成分指纹图谱1，2)确定中药作用的靶器官、靶组织或靶细胞，3)提取其总蛋白和/或总核酸，4)将总蛋白和/或总核酸结合在固相载体上，5)将提取的中药成分与结合总蛋白和/或总核酸的固相载体进行反应，6)获得反应后的固相载体和中药提取液，7)中药提取液再进行色谱分析获得指纹图谱2和指文图谱3，8)比对指纹图谱1、指纹图谱2和指纹图谱3，确定中药的有效成分谱。本发明在中药现代化和科学化的研究中具有重大意义，可将中药进一步优化，去除大量无效成分，为减少中药不良反应、增加中药质量可控性提供依据。本发明适用于与机体蛋白质和/或核酸相互作用后产生药理作用的一切中药或天然药物。

说明书

技术领域

本发明涉及中药成分测定技术领域，具体地说是中药有效成分谱筛选方法。

背景技术

中药是祖国医学的瑰宝，中药曾经为中华民族的繁衍生息做出了不可磨灭的功绩。由于现代西方医药的发展，由于西方医药文化的侵入，中药在我国的地位不断下降，而西方国家包括日本、韩国、德国在天然药物的研发方面已经走到我国的前列。中药避开中医药文化，实际上也就是天然药物，寻找其有效成分的指导思想也颇为一致。根据现代生物学研究的成果，医药界均认为中药和天然药物发挥疗效都有其内在的物质基础，即通过其含有的单个或多个化学成分实现的。除了个别中药的有效成分就是主要化学成分外，大多数中药起作用是通过多成分作用于多个分子靶标实现的，也就是一个综合的调理作用。对于单味中药，起作用的成分可能是数个到数十个不等，对于复方药物来讲，有效成分则更为复杂。

近代药物研究成果也表明，中医药先贤所写下的医药处方是行之有效的治病良方，但不一定是最佳处方；即使是最佳处方，处方中各中药煎煮出来的成分不一定都是有效成分。中药现代化研究的一个重要思想就是要认识其有效成分，尽量减少不必要的成分，这样一方面增加了药物的质量可控性，也有利于减少药物的服用剂量，减少不良反应。现代中医药的发展在遵循先贤经验积累的基础上应当有所突破，中药的有效成分谱和药物作用机制谱到目前一直缺乏有效的研究手段，复方中药更是高深莫测。中药作用解释的不彻底性是我国传统中药的软肋，也常常得不到西方医学的认同。因此，中药作用的物质基础和中药作用机制一直是困扰中药现代化、中药科学化的瓶颈。由于中药作用机制和物质基础解释不清，严重影响我国中医药的发展，严重影响中药的国际地位，严重影响中药的国际医药市场空间。

筛选中药有效成分的经典方法就是利用植物化学手段从中药中提取单一的化学成分，然后将提出来的成分逐一进行活性筛。此技术曾经为中药的研究做出过重大贡献，也是研究中药有效成分的基本手段，但是此技术只适用于主要成分为有效成分的中药；由于活性筛选使用的量较大，中药中某些含量很低的化学成分提取后再进行活性筛选要么提取很困难，要么成本很高，因此严重阻碍中药低含量有效成分的筛选；根据中医药理论，中药作用很可能是多种化学成分共同作用的结果，逐一分析的方法背离了中药综合调理的本质。随着新技术的推广应用，目前中药物质作用基础发展到指纹图谱阶段。中药指纹图谱就是利用色谱技术将中药提取物中的混合化学成分进行规范化的分离，使指纹图谱中的指纹峰与某一种化学成分对应起来，尽管有时也并不知道某一指纹峰所对应化学成分的确切化学结构。中药指纹图谱的研究为中药药材的鉴定和质量控制提供了有效手段，但是没有将中药成分和中药有效性明确联系起来，数量繁多的指纹峰到底是有效成分还是应当去掉的无效成分也不清楚；在我国中药质量控制和质量鉴定的实践中甚至出现用毒性成分作为药材质量指标的现象，这也充分表明中药化学成分没有和疗效建立科学的联系。在作用机制方面，近来有人提出了“寡核苷酸中药筛选系统”，就是用中药处理模型动物后，观察模型动物基因谱表达的变化。然而，模型动物给与任何药物都能发生基因表达变化，药物或处理因素导致基因表达谱的变化还会因检测手段的影响被异常放大，使得基于基因水平作用机制的筛选结果显得很不稳定；更为致命的是，对于繁多的基因表达谱变化不能和中药的化学成分建立科学的联系或进行科学的解释；因此，此方法本身也不能解决中药有效成分的问题。

现代药理学研究认为，在极大多数情况下，药物是通过与机体大分子包括酶、受体等蛋白质分子或核酸相互作用产生药理作用的(只有少数药物是通过药物本身的直接理化性质起作用)。这一点对中药中极其复杂的化学成分而言也不例外，因此中药也可以视为是一种由多种单一成分构成的复方制剂，同样适用于此理论。由于蛋白质是生命的实现形式，绝大多数药物是与蛋白质(包括糖蛋白、脂蛋白等)相互作用后产生药理作用的，基因表达调控实际上也离不开调节因子，而调节因子本身就是蛋白质；因而通过与蛋白质相互作用也能影响到基因表达调控。现代药理研究认为，大多数药物发挥作用第一步就是要进入机体细胞，在分子水平就是与细胞内或内环境中的蛋白质发生结合，相反与机体蛋白质不能结合的小分子物质是不能发挥药理作用的(个别与核酸发挥作用的药物除外)。因此以蛋白质为切入点研究中药有望取得重大突破，并找到中药作用的物质基础。

发明内容

本发明的目的上针对已有方法在筛选中药有效成分谱方面的弊端，利用小分子与大分子蛋白质相互作用的原理建立了一套中药有效成分谱的筛选方法。

本发明针对已有方法在筛选中药有效成分谱方面的弊端，利用小分子与大分子蛋白质相互作用的原理建立了一套筛选中药有效成分谱的新方法。本方法经适当变换同样适用于与核酸直接相互作用的中药，筛选出与核酸直接相互作用有效成分。

本发明的筛选方法如下：

1、建立中药提取物的指纹图谱：由于中药的作用是通过其化学成分发挥作用的，先将中药用有关溶剂，比如氯仿、甲醇、水提取，提取后经液相色谱或气相色谱分离(包括二维的液相色谱或多维色谱)，经不同检测器收集信号，获得此中药的化学成分指纹图谱(即指纹图谱1)；

2、确定中药的作用靶器官、靶组织或靶细胞：根据民间用药经验或中药初提物的初步药理结果，确定中药的作用靶器官、靶组织或靶细胞，在某些情况下也可以假定某些组织器官可能是此中药的靶器官；

3、制备靶器官、靶组织或靶细胞的总蛋白样品：将可能的靶器官、靶组织、或靶细胞直接进行匀浆或破碎(没有进行中药处理)，提取其总蛋白(和/或总核酸)；

4、固定总蛋白和/或核酸：将总蛋白和/或结合在固相载体上，固相载体可以是各种可以结合蛋白质和/或核酸的层析柱(比如亲和层析柱、离子交换层析柱等)，也可以是各种能吸附蛋白质的颗粒状物(比如大孔树脂)、或膜状物(比如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)；

5、亲和反应：将提取的中药成分与结合了总蛋白和/或总核酸的固相载体进行充分接触混合，能与总蛋白中某些特异蛋白和/或核酸发生特异结合的化学成分则也能保留在固相载体上；

6、分离固相载体和液相：将反应充分后的反应体系重新分离，获得反应后的固相载体和液相中药提取液；

7、反应后指纹图谱建立：将与固相载体(结合有蛋白质和/或核酸)充分反应后的中药提取液在进行相同色谱条件的指纹分析，获得指纹图谱2；另外也可以通过适当的变性液(比如十二烷基磺酸钠溶液、饱和尿素溶液、饱和盐酸胍溶液、或有机溶液等)将固相载体上的蛋白质和/或核酸进行变性处理，结合在蛋白质和/或核酸上的化学成分则再次释放出来，将释放出来的化学成分再进行色谱分析获得指纹图谱3(色谱条件同指纹图谱1)；

8、数据分析：比对指纹图谱的变化，如果此时的指纹峰有明显的改变则表示此峰所代表的化学成分是有效成分。比对指纹图谱1和指纹图谱2，如果有指纹峰下降或消失，则此峰所代表的化学成分很可能就是此中药的有效成分；或比对指纹图谱1和指纹图谱3，则指纹峰相对增高的为有效成分。(甚至可以对指纹峰对应的化学成分进行结构鉴定，确定其化学结构，完全明确其有效成分谱。)

9、新型中药制备：根据筛选出的中药活性成分信息，选取相应的活性成分直接组方，获得优化的新型中药，配方比例可以参照化学成分与蛋白质和/或核酸结合保留的相对值。

10、以上是筛选中药中某些直接有效成分的方法；除此之外，某些中药经口服后，某些化学成分在胃肠道或肝脏生物转化后才发挥相应的疗效，对于此类成分也可以使用此方法进行筛选，只是在筛选前将中药提取物进行肝脏微粒体转化或经肠道细菌转化后再采用此方法。

本发明具有以下特点：

1、在筛选工艺中引入中药提取物与蛋白质和/或核酸相互作用的反应体系，在此反应体系中，蛋白质和/或核酸通过各种方式固定在固相载体上，中药提取物为液相。反应后固相和液相能够顺利分离；

2、中药提取物在与固相蛋白质和/或核酸反应前后进行成分的指纹图谱分析，比对指纹图谱的变化，从而筛选到那些指纹峰所代表的化学成分是此中药的有效成分；

3、将特异的指纹峰成分收集进行结构测定，从而确定有效成分的化学结构，获得完整的有效成分谱信息；

4、根据指纹特征信息、根据有效成分谱中的化学成分信息(部分信息或全部信息)，重新组方得到新型中药。配方可以参照各成分与总蛋白和/或核酸保留的相对比例；

本发明在中药现代化和科学化的研究中具有重大意义，本发明的方法能够尽可能地筛选到中药的活性成分谱，对于含量较低的活性成分特别适用，筛选的结果一方面能够阐明中药的物质基础，另一方面在筛选结果的指导下，可将中药进一步优化，去除大量无效成分，为减少中药不良反应、增加中药质量可控性提供依据。本发明适用于与机体蛋白质和/或核酸相互作用后产生药理作用的一切中药或天然药物。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

实施例1：

某中药具有抗肝脏纤维化的治疗效果。此中药经醇提水沉处理，获得中药水溶液(醇含量低于20％)，将此水溶液调整pH在7.4(TrisHCl)后，低温(2-8℃)平衡过夜(18小时)，高速离心(12000×g)或超滤(0.22μm)制备色谱样品进行高效液相色谱(流动相：水、甲醇、乙腈梯度洗脱)或二维高效液相色谱，信号检测采用二极管阵列或质谱检测器，获得第一张指纹图谱；然后将肝组织匀浆，获得肝组织的总蛋白，将此总蛋白调pH7.4左右，吸附在阴离子型离子层析柱上，用TrisHCl(三氨基甲烷盐酸酸盐)缓冲液(pH7.4)平衡后，将获得的中药水提取液通过层析柱，收集洗脱液，将洗脱液进行色谱分析(条件同前)，将第二次色谱得到的指纹图谱与先前的指纹图谱进行比对，寻找峰高度下降的指纹峰，将此指纹峰的化学成分进行结构分析，找到其化学结构。找到的这些化学成分即是此中药作用于肝脏的有效成分谱。

实施例2：

某中药，具有较好的抗乳腺癌作用。将此中药进行水煮醇沉后，回收乙醇，控制乙醇含量低于20％，加入磷酸缓冲液调整pH为7.4，提取液经2-8℃平衡过夜(1 8小时)后，进行高速离心(12000×g)或超滤(0.22μm或0.45μm)制备样品，将样品进行色谱分析获得指纹图谱；另外将原代培养的乳腺癌细胞或培养的乳腺癌细胞系进行超声破碎，收集总蛋白，将总蛋白吸附在尼龙膜上，再将此尼龙膜浸泡在中药提取物中，2-8℃过夜，然后将尼龙膜用75％乙醇洗涤，收集洗涤液，回收乙醇并控制乙醇含量低于20％，然后用TrisHCl调整pH为7.4，高速离心或超滤后制备样品进行色谱分析(色谱条件同前)，分析两次色谱结果，与实施例1不同，在本实例第二次色谱中指纹峰较高的化学成分为活性成分。

实施例3：

某中药具有抗心律失常作用，将此中药进行75％乙醇浸泡提取后回收乙醇制备含醇量低于20％的中药提取液，用TrisHCl调整pH为7.4，此中药提取液在4□平衡过夜后高速离心(12000×g)或超滤(0.22μm或0.45μm)后制备色谱样品，色谱分析后获得指纹图谱；另取大鼠心脏匀浆离心后制备总蛋白样品，用大孔树脂吸附蛋白质，吸附后将大孔树脂用pH为7.4的TrisHCl平衡，平衡后沥干树脂，将树脂灌装在玻璃柱中，加入中药提取物2-8℃浸泡过夜，过夜后收集浸泡液，见浸泡液进行色谱分析(色谱条件同前)获得新的指纹图谱，将此图谱与第一次获得的图谱比对，指纹峰下降的峰位活性成分。

实施例4：

某镇静中药的静脉用药疗效很差，但口服用药或十二指肠用药效果较好，提示此药经过肝脏转化后才能产生较好的疗效。将此中药进行乙醇提取回收溶剂后制备含醇量低于20％的水溶液，用TisHCl调整pH为7.4，加入肝微粒体37℃反应2小时后收集反应液高速离心(12000×g)或超滤(0.22μm或0.45μm)后制备样品进行色谱分析获得指纹图谱；取大鼠脑组织匀浆后制备大鼠脑组织总蛋白，将总蛋白用硝酸纤维素膜吸附后沥干浸泡在先前制备的反应液中，2-8℃过夜后再将反应液超速离心或超滤，将制得的样品进行相同条件的第二次色谱分析获得第二张指纹图谱；比对这两张指纹图谱，指纹峰下降明显的化学成分即为此中药的镇静活性成分。

实施例5：

某中药具有较好的抗肺肿瘤作用，并高度怀疑其能直接干扰核酸功能，本法也能对直接作用于核酸的中药成分进行筛选。将此中药进行水煮醇沉后，控制乙醇含量不高于20％，用TrisHCl调整pH至7.4，将此中药提取物于2-8℃平衡过夜后，高速离心或超滤获得中药提取液的色谱样品，将样品进行色谱后得到此中药提取物的第一张指纹图谱。另将获得的肺肿瘤细胞(原代培养)或肺肿瘤细胞系用TriZol试剂(或其他核酸提取试剂)提取细胞中的总核酸(包括DNA和RNA)，并调pH为7.4，将总核酸固定在固相载体上(如离子交换树脂、碱性磷酸钙颗粒)，如此则制备了结合有总核酸的固相载体。再将结合有核酸的固相载体和中药提取液进行亲和反应(充分混合后2-8℃过夜)，然后再将固相载体和中药提取液分离，将中药提取液进行相同条件的色谱分析获得第二张指纹图谱，也可以将固相载体进行变形处理，提取固相载体上结合的中药成分用相同条件的色谱技术获得第二张指纹图谱，将第一张和第两张指纹图谱进行比对，指纹峰相对高度差别较大的化学成分为有效成分。

说明：

1、本发明筛选的活性成分谱是中药有效的物质基础，由于中药中的化学成分在作用于机体时还可能存在相互作用(如协同作用、相加作用或促进作用等)，因此，活性成分谱中的单一组分在疗效验证时未必一定有效，但整个活性成分谱是有效的，这符合中药作用的整体观。

2、某些中药的化学成分可能直接作用于机体核酸类大分子，本法同样适用，只是用适当的方法将核酸固定在固相载体上即可实施，见实施例5的描述。

3、在某些情况下，可以在同一种固相载体上固定靶器官、靶组织或靶细胞的总蛋白和总核酸，用此方法筛选到的有效成分对机体靶标的蛋白质和/或核酸均有药理作用。

4、上述实施例是为了说明本法的应用而列举的有限例子。以上实施例不为穷举，还可以有其他的实施例在本发明保护范围之内。