猪生产性状相关基因CACNA2D1的序列及其用途

摘要

本发明公开了一种猪生产性状相关基因CACNA2D1的序列及其用途。用由序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，以及SEQID No.6和SEQ ID No.7组成的三对引物对猪总DNA进行PCR扩增、测序，得到序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；然后以此序列设计两对引物SEQ IDNo.8和SEQ ID No.9，以及SEQ ID No.10和SEQ ID No.11，对猪总DNA进行扩增，得到长度分别为458和349bp的DNA片段，分别对其进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID No.15’端第352位碱基是G还是A，第1739处碱基是A还是G。应用该标记基因检测了与猪重要生产性状间的相关性，表明它与某些重要生产性状存在显著相关，本发明的基因可作为猪育种辅助选择的遗传标记。

说明书

技术领域

本发明涉及猪的分子生物学技术及育种领域，具体涉及一种猪生产性状相关基因CACNA2D1的序列及其用途。即猪的与生产性状相关基因CACNA2D1部分序列的克隆、单核苷酸多态性分析以及利用该基因作为猪生产性状的遗传标记。

背景技术

分子遗传标记是指受基因控制并可用于间接选择的各个性状。根据遗传标记进行选种，可望识别具有优良基因的种畜个体，提高选择强度，缩短世代间隔，获得最大遗传进展。九十年代以来，随着分子生物学技术的进步以及在猪育种领域中的应用，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种技术相结合，大大加速了猪育种进程。分子标记能否在育种实践中发挥应有的作用，取决于4个因素：(1)具有与目标基因紧密连锁的分子标记；(2)具有多态性高的分子标记绘制的遗传图谱；(3)能否实现分子标记分析自动化，降低成本，简化实验；(4)应用标记预测育种值的方法的改进。能够应用于分子标记辅助选择的基因或标记必须对目标性状具有较大的遗传贡献率，即主效基因或标记，因此寻找这些主效基因和与之紧密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的前提和基础，也是当前和今后一段时间猪分子生物学领域的研究重点和急需解决的问题。

猪CACNA2D1基因由39个外显子以及38个内含子组成，mRNA编码区长3273bp，编码1091个氨基酸(Brown JP et al.，1998，Cloning and deletionmutagenesis of the alpha2 delta calcium channel subunit from porcinecerebral cortex.Expression of a soluble form of the protein that retains[3H]gabapentin binding activity.J Biol Chem.273(39)：25458-65)。根据人和鼠CACNA2D1基因基因组长度，估计猪CACNA2D1基因基因组长度为40多万bp。

CACNA2D1基因编码骨胳肌钙离子通道的α₂和δ辅助亚基，是人类恶性高温综合症的(Malignant hyperthermia syndrome)候选基因之一(Robinson等，2000)，与之对应的猪的应激综合症(PSS)不仅能引起猪的死亡，而且可导致劣质肉(如PSE，DFD肉等)。发明人(2005，Radiation hybrid mapping ofskeletal muscle calcium channel genes CACNB1 and CACNG1 to Dorcinechromosome 12 and CACNA2D1 to porcine chromosome 9.Animal Genetics.36，358-359)利用辐射杂种细胞系将CACNA2D1基因定位在猪的第9号染色体上，其位置与de Koning等(2001，Detection and characterization ofquantitative trait loci for meat quality traits in pigs.Journal of AnimalScience.79，2812-29)和郭晓令(2002，猪的胴体值，肉质及外形性状的QTL定位。德国基尔大学农学与食品学院博士论文)在9号染色体上分别发现的影响肉质性状的QTL重叠。可以推测CACNA2D1基因是这些QTL合适的候选基因，有必要研究CACNA2D1基因的变异对肉质性状的影响。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition，C→T，在其互补链上则为G→A)或颠换(transversion，C→A，G→T，C→G，A→T)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

检测SNP的方法有许多，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)以及高效液相色谱等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。

Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，该方法为单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。其基本过程是：①PCR扩增靶DNA；②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子：③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。但它也有不足之处。例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率。Takao认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出。

本发明提供猪CACNA2D1基因基因组第27、28、29外显子，第27、28内含子全部序列和第29内含子部分序列，以及第27和29内含子内的遗传变异与猪胴体和肉质性状间的关系。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪生产性状相关基因CACNA2D1的序列及其用途。

猪生产性状相关基因CACNA2D1的序列如SEQ ID No.1所示。

所述的SEQ ID No.1序列全长为2413bp，其中包含猪CACNA2D1基因基因组第27、28、29外显子，第27、28内含子的全部序列和第29内含子的部分序列。SEQ ID No.1序列第352bp处存在G→A，第1739bp处存在A→G的单核苷酸替换。SEQ ID No.1序列扩增和序列测定的三对引物如SEQ ID No.2至SEQ IDNo.7所示。SEQ ID No.1序列第352bp和第1739bp处单核苷酸多态性的两对引物如SEQ ID No.8至SEQ ID No.11所示。

猪CACNA2D1基因第27内含子PCR-SSCP多态性位点(SEQ ID No.1序列第352bp)基因型不同时，肌内脂肪含量、肌肉粗蛋白和肌内水分含量存在显著差异。AA基因型猪的肌内脂肪含量显著高于AB和BB基因型(p＜0.05)，而AA基因型猪的肌肉粗蛋白和肌内水分含量则显著低于AB和BB基因型(p＜0.05)。

猪CACNA2D1基因第28内含子PCR-SSCP多态性位点(SEQ ID No.1序列第1739bp处)基因型不同时，腿臀重、腿臀脂肪重、肌肉粗蛋白和肌内脂肪含量存在显著差异。DD基因型猪的腿臀重显著大于CC和CD基因型(p＜0.05)，DD基因型猪的腿臀脂肪重显著大于CD基因型(p＜0.05)，DD基因型猪的肌内粗蛋白含量显著低于CC和CD基因型(P＜0.05)，而CC基因型猪的肌内脂肪含量则显著低于DD和CD基因型(P＜0.05)。

本发明具有的有益效果：本发明运用PCR-SSCP结合PCR产物直接测序的方法分析猪CACNA2D1基因上述长2413bp序列第352bp和第1739bp处单核苷酸多态性，具有操作简便，灵敏度高，可大规模检测样本的优点；PCR产物直接测序不仅大大的简化了操作步骤，而且还可确定突变的部位和性质。利用SEQ ID No.1序列第352bp和第1739bp处的单核苷酸多态性引起的不同基因型与猪生产性状的关系，对开展猪生产性状的分子遗传标记辅助选择，提高猪生产性状选种的准确性，提高遗传进展，具有重要意义。

附图说明

图1(a)是第27内含子多态位点PCR-SSCP分型结果电泳图谱；

图1(b)是第28内含子多态位点PCR-SSCP分型结果电泳图谱；

图2(a)是第27内含子多态位点所在序列(引物IV)测序峰图；

图2(b)是第28内含子多态位点所在序列(引物V)测序峰图。

具体实施方式

在于克隆猪CACNA2D1基因基因组第27、28、79外显子，第27、28内含子全部序列和第29内含子部分序列，寻找猪CACNA2D1基因的突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪的分子育种提供辅助选择方法。

本发明提供的检测猪CACNA2D1基因单核苷酸多态性及其与猪生产性状的关系的方法，是由引物I～III对猪基因组DNA进行PCR扩增，得到序列表中的SEQID No.1的DNA序列(2413bp)，然后根据该序列设计引物IV和V，用以进行PCR扩增，扩增产物长度分别为458和349bp。扩增产物变性后在12％非变性聚丙烯酰胺(29∶1)凝胶中电泳，剥胶银染后判断基因型，将纯合子测序后确定自序列表SEQ ID No.1的5’端第352位碱基是G还是A，第1739位碱基是A还是G。

引物IV的PCR扩增产物长458bp，如果自序列表SEQ ID No.1的5’端第352位碱基是G，其纯合体基因型是AA；自序列表SEQ ID No.1的5’端第352位碱基是A，其纯合体基因型是BB；其杂合子的基因型是AB。

引物V的PCR扩增产物长349bp，如果自序列表SEQ ID No.1的5’端第1739位碱基是G，其纯合体基因型是CC；自序列表SEQ ID No.1的5’端第1739位碱基是A，其纯合体基因型是DD；其杂合子的基因型是CD。

用引物IV对猪总DNA进行PCR-SSCP分析，结果表明AA基因型猪的肌内脂肪含量显著高于AB和BB基因型(p＜0.05)，而AA基因型猪的肌肉粗蛋白和肌内水分含量则显著低于AB和BB基因型(p＜0.05)。

用引物V对猪总DNA进行PCR-SSCP分析，结果表明DD基因型猪的腿臀重显著大于CC和CD基因型(p＜0.05)，DD基因型猪的腿臀脂肪重显著大于CD基因型(p＜0.05)，DD基因型猪的肌内粗蛋白含量显著低于CC和CD基因型(p＜0.05)，而CC基因型猪的肌内脂肪含量则显著低于DD和CD基因型(p＜0.05)。

本发明提供了鉴定上述2413bp序列第352bP处(第27内含子内)和第1739bP处(第28内含子内)单核苷酸变异的PCR-SSCP基因型分型方法。其步骤包括：根据所获得的上述SEQ ID No.1序列设计引物，引物序列分别如序列表SEQ D No.8～11所示，在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段用聚丙烯酰胺凝胶电泳分型并测序检测。

本发明进一步提供了利用PCR-SSCP方法确定的不同基因型个体与生产性状间的相关关系。

实施例1：基因组序列的获得

用酚-仿法从金华猪血样中提取猪基因组总DNA，将猪CACNA2D1基因mRNA序列与人CACNA2D1基因基因组序列比对，确定其全部外显子序列后，根据猪CACNA2D1基因第27、28、29、30外显子序列设计引物，引物序列如下：

引物I：正向引物F₁：5’TTG CCA CTG TAT AAG GAC C 3’

       反向引物R₁：5’AAT CAA TTC ACA GAC ACT CCA 3’

引物II：正向引物F₂：5’ACC ATG ATG CCT GAT TCA TAA G 3’

        反向引物R₂：5’AAA CCC AGA AAC ATA TGA GGA C 3’

引物III：正向引物F₃：5’GTA GGG AGC AGT GAA AAC ATA GT 3’

         反向引物R₃：5’GAG TGA AAG CAC GGT TTG TTG TA 3’

以提取的猪基因组DNA为模板，用这三对引物进行PCR扩增，PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为1μl，dNTPs浓度为200μmol/L，正、反向引物浓度为0.4μmol/L，3U的Taq DNA聚合酶(Sangon，Shianghai)，加去离子水至总体积25μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃变性50s、(引物I：57℃，引物II：57.5℃，引物III：56℃)退火50s，72℃延伸40s，35个循环后于72℃延伸10min.不同引物的PCR产物经纯化(UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物技术公司)后，以R₁、R₂、R₃、F₁、F₂和F₃为测序引物进行序列测定，序列测定由上海生工生物技术公司完成。所测序列经整合后长度为2413bp，把此整合的序列与猪CACNA2D1基因的mRNA序列进行序列比对发现：此序列包含的猪第27、28、29外显子序列与猪CACNA2D1基因mRNA序列相应部分的同源性为100％。

实施例2：基因片段的获得及多态检测方法的建立

选择金华猪、皮特兰和象山野猪为试验材料，根据上述猪CACNA2D1基因序列设计引物，引物序列如下：

引物IV：正向引物F₄：5’GCCCACTTAATGGACTGTTCT  3’

       反向引物R₄：5’CAAGGGAGTGAAAGCACGGT  3’

引物V：正向引物F₅：5’CAGCACTGCCAGGTGATA  3’

       反向引物R₅：5’TAATTCTCATCCCAAAGTCAA  3’

用这两对引物在金华猪、皮特兰和象山野猪三个猪种DNA中进行PCR扩增，PCR反应总体系为10μl，其中10×Buffer 1.0μl，25mM MgCl₂ 0.7μl，10mMdNTP 0.2μl，上、下游引物(10pM)各0.8μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，模板DNA 0.6μl(25ng)，加ddH₂O至10.0μl。PCR扩增条件为：94℃ 4min；94℃1min.58℃40sec。72℃50sec。35个循环后再72℃延伸8min，扩增片段长度分别为引物IV458bp，引物V349bp，2％琼脂糖电泳检测表明，扩增条带特异性好，可直接用于SSCP检测。

PCR-SSCP检测

取5ul PCR扩增产物，加入7μl变性上样缓冲液(95％去离子甲酰胺，0.2mmol/L EDTA，0.05％二甲苯青，0.05％溴酚蓝)混匀，于98℃变性8min，立即冰浴5min，取10μl上样，12％非变性聚丙烯酰胺(29∶1)，恒压400V，循环水泵控温至25℃以下电泳10h，剥胶银染。

银染后用扫描仪将凝胶上的电泳带谱扫描进电脑中保存。经分析，引物IV有三种基因型，分别定义为AA、BB和AB(图1a)，图1a中，泳道2、5为AA基因型的扩增产物，泳道3、7为CC基因型的扩增产物；泳道4、6为CT基因型的扩增产物；引物V也有三种基因型，分别定义为CC、DD和CD(图1b)，图1b中泳道6、7为CC基因型的扩增产物，泳道2为DD基因型的扩增产物，泳道1、3、4、5为CD基因型的扩增产物；将纯合子个体扩增测序后发现引物IV在序列SQ ID N0.1第352bp处发生G→A的突变和引物V在序列SQ ID N0.1第1739bp处发生A→G的突变(图2a，图2b)。

实施例3：分子标记在不同猪群中的多态分布

在大白猪、杜洛克、长白猪、皮特兰、金华猪和野猪中检测了猪CACNA2D1基因第27和28内含子部分序列的单核苷酸多态性，检测结果如表1和表2所示，独立性卡方检验表明，这两个位点的不同基因型在所检测的几个猪种中差异极显著(p＜0.001)。

表1  猪CACNA2D1基因第27内含子PCR-SSCP多态性在不同猪群中的分布结果

品种数量AA基因型 AB基因型 BB基因型 A基因频率 B基因频率大白猪190 3 16 0.079 0.921长白猪101 9 0 0.550 0.450杜洛克猪481 28 19 0.313 0.687皮特兰猪240 14 10 0.292 0.708金华猪579 35 13 0.465 0.535野猪124 2 6 0.417 0.583

表2  猪CACNA2D1基因第28内含子PCR-SSCP多态性在不同猪群中的分布结果

品种数量 CC基因型 CD基因型 DD基因型 C基因频率 D基因频率大白猪21 3 4 14 0.238 0.762长白猪10 0 1 9 0.050 0.950杜洛克猪48 0 3 45 0.031 0.969皮特兰猪26 4 4 18 0.231 0.769金华猪70 11 42 17 0.457 0.543野猪21 0 9 12 0.214 0.786

实施例4：分子标记与生产性状的关联分析

为了确定CACNA2D1基因多态性与猪表型差异是否相关，选择浙江大学实验牧场组建的160头金华×皮特兰F₂代资源群体为试验材料，采用实施例2所建立的PCR-SSCP方法进行多态性检测，根据电泳图谱显示的表型，统计基因型频率。用SPSS(13.0)的GLM程序对所检测金华×皮特兰资源家系F₂代个体的基因型与猪生产性状值进行最小二乘分析，模型为Y＝总体均数+基因型效应+性别效应+协变量+残差。基因型和性别效应为固定效应，胴体性状以屠体重为协变量，肉质性状不考虑协变量。

不同基因型与生产性状间的统计分析结果总结于表3和表4。

由表3可以看出，猪CACNA2D1基因第27内含子PCR-SSCP多态性位点基因型不同时，肌内脂肪含量、肌肉粗蛋白和肌内水分含量存在显著差异。AA基因型猪的肌内脂肪含量显著高于AB和BB基因型(p＜0.05)，而AA基因型猪的肌肉粗蛋白和肌内水分含量则显著低于AB和BB基因型(p＜0.05)。

表3  猪CACNA2D1基因第27内含子PCR-SSCP多态性位点基因型与生产性状的统计分析表

    性状Traits  最小二乘均数±标准误LSM±SE  AA AB  BB    胴体重  54.7±1.36 56.11±0.56  55.42±0.59    腿臀重  7.43±0.21 7.46±0.08  7.48±0.09    腿臀肌肉重  5.63±0.18 5.48±0.07  5.57±0.08    腿臀脂肪重  1.85±0.12 2.00±0.05  1.96±0.05    蹄重  1.61±0.13 1.51±0.05  1.51±0.05    胴体长  71.59±0.96 72.37±0.40  72.27±0.42    肩背膘厚  4.88±0.23 4.72±0.10  4.73±0.10    6-7肋骨背膘厚  3.40±0.21 3.43±0.09  3.40±0.09    胸腰背膘厚  2.61±0.20 2.50±0.08  2.48±0.09    臀背膘后  2.48±0.21 2.46±0.09  2.42±0.09    眼肌面积  33.59±1.97 31.74±0.77  35.80±0.84    L^*  49.43±1.39 48.85±0.57  47.40±0.60    a^*  0.05±0.51 0.37±0.21  -0.06±0.22    b^*  10.10±0.54 9.89±0.22  9.39±0.23    C^*  10.57±2.26 10.10±0.93  10.79±0.97    H^*  91.64±3.14 88.60±1.29  90.25±1.35    眼肌pH₄₅  6.25±0.11 6.14±0.04  6.14±0.05    腿臀肌肉pH₄₅  6.31±0.10 6.29±0.04  6.30±0.04    眼肌温度  39.72±0.43 39.04±0.18  38.87±0.19    腿臀肌肉温度  40.06±1.11 39.56±0.45  38.62±0.47    眼肌电导率  2.72±1.48 3.27±0.57  3.92±0.64    腿臀肌肉电导率  3.62±1.33 4.20±0.51  4.97±0.57    系水率  0.56±0.03 0.58±0.01  0.59±0.01    肌内脂肪含量  5.59±0.46^a 2.48±0.15^b  2.58±0.17^b    肌肉粗蛋白含量  22.96±0.38^a 24.12±0.12^b  24.31±0.14^b    肌肉水分含量  70.93±0.60^a 72.79±0.19^b  72.48±0.22^b

注：上标含有不同字母表示差异显著，P＜0.05

由表4可以看出，猪CACNA2D1基因第28内含子PCR-SSCP多态性位点基因型不同时，腿臀重、腿臀脂肪重、肌肉粗蛋白和肌内脂肪含量存在显著差异。DD基因型猪的腿臀重显著大于CC和CD基因型(p＜0.05)，DD基因型猪的腿臀脂肪重显著大于CD基因型(p＜0.05)，DD基因型猪的肌内粗蛋白含量显著低于CC和CD基因型(P＜0.05)，而CC基因型猪的肌内脂肪含量则显著低于DD和CD基因型(p＜0.05)。

表4  猪CACNA2D1基因第28内含子PCR-SSCP多态性位点基因型与生产性状的统计分析表

  性状Traits  最小二乘均数±标准误LSM±SE  CC CD  DD  胴体重  55.69±0.56 55.37±0.55  57.42±1.50  腿臀重  7.48±0.08^a 7.37±0.08^a  8.05±0.23^b  腿臀肌肉重  5.53±0.07 5.50±0.07  5.79±0.21  腿臀脂肪重  1.99±0.05^ab 1.90±0.05^a  2.27±0.13^b  蹄重  1.54±0.05 1.46±0.05  1.61±0.14  胴体长  72.37±0.40 71.95±0.39  73.46±1.06  肩背膘厚  4.74±0.10 4.73±0.09  4.62±0.26  6-7肋骨背膘厚  3.46±0.09 3.37±0.09  3.27±0.23  胸腰背膘厚  2.51±0.08 2.47±0.08  2.50±0.22  臀背膘后  2.46±0.09 2.39±0.09  2.41±0.23  眼肌面积  32.84±0.82 34.07±0.83  36.40±2.37  L^*  48.81±058 47.63±0.57  47.74±1.55  a^*  0.14±0.21 0.29±0.21  -0.62±0.56  b^*  9.84±0.23 9.61±0.22  8.99±0.60  C^*  11.39±0.93 9.64±0.90  9.47±2.46  H^*  89.35±1.30 89.05±1.27  94.39±3.45  眼肌pH₄₅  6.14±0.05 6.15±0.04  6.23±0.13  腿臀肌肉pH₄₅  6.25±0.04 6.34±0.04  6.34±0.11  眼肌温度  38.98±0.18 39.07±0.18  38.98±0.48  腿臀肌肉温度  39.49±0.46 39.13±0.45  37.77±1.22  眼肌电导率  3.19±0.58 3.89±0.59  2.73±1.44  腿臀肌肉电导率  4.03±0.52 4.98±0.53  4.04±1.29  系水率  0.59±0.01 0.57±0.01  0.55±0.04  肌内脂肪含量  2.61±0.17^a 2.68±0.19^ab  3.73±0.54^b  肌肉粗蛋白含量  24.22±0.13^a 24.22±0.14^a  23.32±0.40^b  肌肉水分含量Content of Water in Muscle  72.59±0.20 72.44±0.22  72.43±0.63

注：上标含有不同字母表示差异显著，P＜0.05.

SEQUENCE LISTING(序列表)

<110>浙江大学

<120>猪生产性状相关基因CACNA2D1的序列及其用途

<130>

<140>1

<141>2006-12-08

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2413

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>exon 27

<222>(7)..(69)

<223>

<220>

<221>exon 28

<222>(747)..(852)

<223>

<220>

<221>exon 29

<222>(1777)..(1864)

<223>

<400>1

tttcagcaag ggagtgaaag cacggtttgt tgtaactgat ggagggatta ccagagttta    60

tcccaaagag taagttcaga taacatctgt aaaagttact acattataag gactactcca   120

aggatatata tatatatata ttactgtata aggatataca gagaaactgg tcgttaatag   180

tagattaaat ggaggttgtt taaagtacta aattattaaa atactccatt tcttaaaaaa   240

aatgctacta tatgattcct caatgttgtt tttgcttgtc acatatacta ccaaatttaa   300

gaggttttaa aagagatttt tctctttcta gacataaact aacttggtta agtgaacata   360

gtggttatta tagcaatata tctgttgaga gcatttacat agaacatcat tgttttcact   420

gattttatct gtgtttatct taagaacagt ccattaagtg ggctgtgtac gcttgttaat   480

attaattgac ttattaactg atttatccat aattacctgg ctggtaaatg gcagagtaaa   540

actgggagtc agctttctct gctccgtaat ttaactctat gctgatctat tgcttagtaa   600

tgtgttattt acaccatcaa tttccactaa cttccttaga cgcacctgag atgcaaacaa   660

atctgtaaag ttcagtgagg tccacaaagg gaaaagtaag ttatcaagga gattaaagaa   720

taaatgatga gccatttcct ccttagggct ggagaaaatt ggcaagaaaa cccagaaaca   780

tatgaggaca gcttctataa aagaagtcta gataacgata actatgtttt cactgctccc   840

tactttaaca gtaagtattg ctttggaatt cagccatcgc agttcctttt tctatgtaag   900

ttattgctac tacctgcttt tcccctaaac aatatcatat gcacaacatt ggagaaaaag   960

aatatccatt tagttgagga ggcaaaatgc ataaatagga aatcagccat ccagtaatgt  1020

agagactgca tattacaggc ctgcacaata catcgaaaca catgtagata atccctcatt  1080

ttcacatttc atttcgtctt ttttagggcc acgcccgtgg catatggagg ttcgcaggat  1140

aggggttgaa ctggagctgt agccaccggc ctacaccaca gcaacagcaa tgagggatcc  1200

aagccgtgtc tgcaacatgc accacagctc acagcaatgc tggatcctta acccacagag  1260

caaggccagg gatcaaatct gcatcctcat ggctattcat cagattcttt tccactgtgc  1320

catgacggga actcaacaaa gtgcaaatat attgaagaat ttttaatgag ttaaaaaaat  1380

ataattaaat caattttcac aaaagaggaa ggtgcagttt ggagaatttc agttttttcc  1440

agggacatgt atcttttaaa atgtaaaagc agttttgtga atctgagatc tttgcacttt  1500

acttgagcag cctcccaata ttttagcaaa cattataaag cagaggtttg gtgtgcagcc  1560

ttcatatgtg agagtagata catttaagct gtttaattct catcccaaag tcaattaatg  1620

aaaatcaatt cacagacact ccaattacct tttatgccag aatatttaag cagaaaacta  1680

tcccccatac ctattaaaag aaatttcata ttatttgatt aatctacata ggtctgttat  1740

tttttgtttt ttgttttttg tttttttttt attttagaaa gtggacctgg tgcttatgaa  1800

tcaggcatca tggtaagcaa agctgtagaa atatacatcc aaggaaaact tcttaaacct  1860

gcaggtgagc atgtatttgt tcacatacat acaatcaaaa ttaaatgtga cccattcctc  1920

gtgttatcac ctggcagtgc tgatcaggaa agccatcagg aagcttcaac caaaataaaa  1980

tcaaagacat gcaaatttaa aaaataaaac acaattagtt acatataaat tggggataaa  2040

ataaaattga tactgtatag agttgaggaa ttttcaaaga agactatatg tttctatact  2100

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gatcccacaa tcccactcta gaagtctatc ccatatagta ttttaaatat acaaaagtag  2220

atatggccaa gaatgtgaaa tgttggtaat aatttaaaca agaaaaggta agtttgcatc  2280

tttgggggaa aagataaatt atggtgtatc tatactatgt atctgttaaa aagaatttgg  2340

atagggatct attttttaaa aaccttacga tatataaaag agttttttga taaaccacgc  2400

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<222>(1)..(23)

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taattctcat cccaaagtca a            21