利用噬菌体展示技术定量检测融合蛋白或融合蛋白的亲和物质的方法

摘要

本发明涉及一种定量检测外源蛋白数量或定量检测与外源蛋白结合的亲和物质的方法。本发明克服了以往只将噬菌体展示技术用于外源蛋白的表达定性检测的技术局限，实现了利用噬菌体展示技术进行外源蛋白的定量检测或对能与其结合的亲和物质进行定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种利用噬菌体展示技术定量检测融合蛋白和定量检测与外源蛋白结合的亲和物质的方法。

背景技术

在基因功能研究和药物筛选的过程中，经常涉及蛋白质或蛋白质亲和物质的定量检测。常用的实验手段就是表达目的蛋白质以后，结合凝胶电泳，如SDS-PAGE，IFE等技术，将不同蛋白分离，然后利用酶联免疫吸附分析(Elisa)、蛋白质印迹(Western blotting)和质谱等方法对蛋白质的表达情况进行定量检测或结合配体分析。这些常用的蛋白质检测方法通常使用的耗材昂贵，检测成本高，如需要高质量的专一的抗体或精密贵重的检测仪器等。对于一些种类的蛋白质，因为各种各样的因素导致其表达的量非常少，常规的检测手段常常由于受方法灵敏度的限制或者样品中非特异背景的干扰，对于微量的蛋白检测往往由于检测限的限制而无法准确测定蛋白质的浓度，更无法进一步定性及定量地测定与蛋白质结合的亲和物质。例如，通常Elisa和Western印迹检测方法的应用检测界限为1-10ng/mL，小于检测限的蛋白不容易检测到。

通常将蛋白质在原核细胞或真核细胞中表达后用于定量检测或配体分析，一般都需要将蛋白质进行分离纯化。而噬菌体展示技术(phage displaytechnology)是将外源蛋白质或多肽与噬菌体外壳蛋白融合表达，从而将外源蛋白表达在噬菌体的表面，可以与固定的亲和物质相结合。并且蛋白质通过活的噬菌体与编码其的基因直接偶联，而且蛋白质的表达量可以通过噬菌体的扩增而增大，此外蛋白质只需通过噬菌体的分离而得到分离纯化，从而绕过通常的蛋白质表达系统所需的分离纯化过程。

但是，目前蛋白质融合表达在噬菌体表面以后，主要应用于蛋白质的定性检测，如从展示表达有多种蛋白质的噬菌体展示库中筛选与特定的固定配基(如蛋白、多肽或细胞等)有相互作用的蛋白质，通过多轮的扩增筛选后，得到与固定的配基有相互作用的克隆是否是目的蛋白的定性结果。这些应用的局限性在于都是定性地筛选分析与特定固定配体结合的蛋白质或多肽，无法进一步地定量分析融合蛋白量，更无法定量地检测能与融合蛋白结合的亲和物质。

因此，目前现有技术中迫切需要一种改进的定量分析待测蛋白量或蛋白亲和物质的方法，从而可快速、灵敏地检测待测蛋白或蛋白亲和物质的量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用噬菌体展示技术定量检测待测蛋白或融合蛋白的亲和物质的方法。

在本发明的第一方面，提供一种定量检测外源蛋白数量或定量检测与外源蛋白结合的亲和物质数量的方法，包括步骤：

(a)将含有第一噬菌体的溶液上样，使之与支持介质上的亲和物质结合，其中所述的第一噬菌体上展示有待检测的外源蛋白，并且所述的支持介质上固定有与所述外源蛋白结合的亲和物质，所述的亲和物质选自：配体、结合蛋白或抗体；

(b)洗涤所述的支持介质，从而去除未结合的第一噬菌体；

(c)用含有待测的外源蛋白或待检测的与所述外源蛋白结合的亲和物质的溶液洗脱所述的支持介质，通过竞争性结合使得一部分结合的噬菌体与支持介质发生解离，进入溶液，从而获得洗脱的第一噬菌体；

(d)测定洗脱的第一噬菌体的滴度Y；

(e)将滴度Y与标准曲线进行比较，从而得出外源蛋白数量或能与其结合的亲和物质的数量。

在本发明的一个优选例中，所述的标准曲线是通过包括以下步骤的方法确定的：

①测定第一噬菌体的滴度A1，其中，所述的第一噬菌体上展示有待检测的外源蛋白；

②通过以下方式测定结合洗脱的第一噬菌体的滴度B1：

(a’)将含有第一噬菌体的溶液上样，使之与支持介质上的亲和物质结合，其中，所述的支持介质上固定有与所述外源蛋白结合的亲和物质，所述的亲和物质选自：配体、结合蛋白或抗体；

(b’)洗涤所述的支持介质，从而去除未结合的第一噬菌体；

(c’)用含有C1浓度的亲和物质的溶液洗脱所述的支持介质，(通过竞争性结合使得一部分结合的噬菌体与支持介质发生解离，进入溶液)，从而获得洗脱的第一噬菌体；

(d’)测定洗脱的第一噬菌体的滴度B1；

③保持C1浓度恒定，重复步骤①和②n-1次，获得在第一噬菌体的滴度在A2至An时的结合洗脱的滴度B2至Bn，其中n代表2-10的正整数；

④根据步骤①-③中获得的滴度A和滴度B，得到标准曲线。

在另一优选例中，所述的C1浓度在1×10^-10mol/L-1×10^-2mol/L之间；更优选在1×10^-8mol/L-1×10^-4mol/L之间。

在本发明的另一优选例中，所述的标准曲线是通过包括以下步骤的方法确定的：

①在第一噬菌体的滴度A1下，通过以下方式测定结合洗脱的第一噬菌体的滴度B1：

(a’)将含有第一噬菌体的溶液上样，使之与支持介质上的亲和物质结合，其中，所述的支持介质上固定有与所述外源蛋白结合的亲和物质，所述的亲和物质选自：结合蛋白、抗体或小分子配体；

(b’)洗涤所述的支持介质，从而去除未结合的第一噬菌体；

(c’)用含有C1浓度的亲和物质的溶液洗脱所述的支持介质，(通过竞争性结合使得一部分结合的噬菌体与支持介质发生解离，进入溶液)，从而获得洗脱的第一噬菌体；

(d’)测定洗脱的第一噬菌体的滴度B1；

②保持第一噬菌体的滴度A1恒定，重复步骤①n-1次，获得用含有C1浓度至Cn浓度亲和物质的溶液洗脱下的第一噬菌体滴度B2至Bn，其中n代表2-10的正整数；

③根据步骤①-②中获得的浓度C和滴度B，得到标准曲线；

其中，所述的第一噬菌体上展示有待检测的外源蛋白。

在本发明的另一优选例中，所述的外源蛋白包括但不限于：核受体蛋白、细胞转录调控因子蛋白或其它药物靶点蛋白。

在本发明的另一优选例中，所述的滴度是噬菌斑数量或菌落形成单位数量。

在本发明的另一优选例中，所述的噬菌体包括但不限于：温和噬菌体或烈性噬菌体。

在本发明的另一优选例中，所述的噬菌体包括但不限于：M13噬菌体、fd噬菌体、f1噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体、或T7噬菌体。

在另一优选例中，当使用的噬菌体是温和噬菌体时，计算菌落形成单位(cfu)的量，从而获得待测蛋白的量。

在另一优选例中，当使用的噬菌体是烈性噬菌体时，计算形成的噬菌斑(pfu)的量，从而获得待测蛋白的量。

在本发明的另一优选例中，所述的含有第一噬菌体的溶液中，第一噬菌体的滴度为10³-10²⁰；更优选的，所述的含有第一噬菌体的溶液中，第一噬菌体的滴度为10⁵-10¹⁵；更优选的，所述的展示有待测外源蛋白的噬菌体的滴度为10⁷-10¹³，最佳地10¹⁰-10¹³。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了展示表达在噬菌体表面的GST蛋白仍然保持与其配基谷胱甘肽结合的能力。

图2显示了噬菌体展示系统应用于外源蛋白定量检测的最低检测限，即该系统应用于定量检测所需的展示有外源蛋白噬菌体的最低数量为1×10⁴。

图3显示了结合竞争洗脱后，获得的噬菌体侵染细菌的菌落形成单位(cfu)与结合前的展示有外源蛋白GST的噬菌体数量的标准曲线。

图4显示了噬菌体侵染细菌的菌落形成单位(cfu)与竞争性洗脱的还原型谷胱甘肽浓度的标准曲线。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究和试验，发现一种采用噬菌体展示系统定量检测融合蛋白或所述融合蛋白的亲和物质的方法，即根据噬菌体侵染细菌后形成的噬菌斑(或克隆形成单位)数量与融合表达噬菌体表面的蛋白的量之间的相关性，定量检测外源融合蛋白的表达量；或者根据噬菌体侵染细菌后形成的噬菌斑(或克隆形成单位)数量与洗脱时所用能与融合蛋白结合的亲和物质的量之间的相关性来定量。使用本发明的方法，可非常灵敏地对蛋白或蛋白的亲和物质进行定量检测。基于此完成了本发明。

如本发明所用，“噬菌体展示系统”指是一种将目标基因连接到噬菌体外壳蛋白基因，并插入到噬菌体载体上，从而使多肽或蛋白质与外壳蛋白融合并展示表达在噬菌体的表面。被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性。通过合适的亲和选择和扩增，可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些生物活性，并分离出带有目标基因的噬菌体。常用的噬菌体展示系统有：单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统等。

如本发明所用，“噬菌斑”指将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养基中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，可以用肉眼看到的斑点数。每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。

如本发明所用，“菌落形成单位”或“克隆形成单位”指在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，以其表达活菌的数量，进而可用于确定侵染细菌的噬菌体的数量。

如本发明所用，“定量检测”指对噬菌体上展示的外源蛋白或蛋白亲和物质进行量化的测定。定量检测不同于定性检测，定量检测除了可以确定外源蛋白是存在还是不存在，还可以确定外源蛋白存在的量的大小；而定性检测只要确定外源蛋白是存在还是不存在即可。

如本发明所用，“支持介质”是指外源蛋白与亲和物质发生相互作用的支持物，所述支持物本身不能够与外源蛋白或亲和物质发生特异性的结合。比如，所述的支持介质可以是一种层析树脂(如琼脂糖凝胶Sepharose)、纤维素膜、尼龙膜或酶标板等。

如本发明所用，“亲和物质”是指能够与外源蛋白结合的物质，所述的亲和物质包括(但不限于)：所述外源蛋白的配体、结合蛋白或抗体。

具体地说，本发明人将外源蛋白展示表达在噬菌体上，利用融合表达有外源蛋白的噬菌体侵染宿主菌，根据噬菌体侵染细菌后形成的噬菌斑(或菌落形成单位)数量与融合表达噬菌体表面的蛋白的量之间的相关性，以及噬菌体侵染细菌后形成的噬菌斑(或克隆形成单位)数量与洗脱时所用能与融合蛋白结合的亲和物质的量之间的相关性，定量检测外源融合蛋白的表达量或融合蛋白亲和物质的量。该技术可被应用于蛋白质的相互作用或蛋白质类药物靶点配体的筛选。

本发明利用噬菌体侵染宿主菌具有高灵敏度，并且检测时仅需微量融合蛋白的特点，利用模式蛋白GST确定了噬菌体展示系统定量检测的检测范围，形成检测本底控制等优化定量检测适用条件的技术方案，测试了外源融合蛋白最低的检测限或灵敏度等，建立了利用噬菌体展示技术定量检测融合蛋白或融合蛋白的亲和物质的体系。

1.噬菌体展示系统

以往现有技术人员一般利用噬菌体展示克隆技术，将外源蛋白、随机肽段、cDNA或基因组片断通过与噬菌体外壳基因融合表达而展示在噬菌体表面，组成蛋白库或多肽库，用于筛选与目标蛋白、受体、细胞表面受体及化学小分子(药物)有相互作用的蛋白或多肽。而本发明人在此基础上，发展了利用噬菌体展示系统的定量检测融合蛋白或所述融合蛋白的亲和配体的方法，克服了以往只将噬菌体展示技术用于外源蛋白的表达和定性检测的技术局限。

噬菌体展示系统包括丝状噬菌体展示系统(如丝状噬菌体M13、fd、f1等)和烈性噬菌体展示系统(包括噬菌体lambda、T7、T4等)，两者具有各自的优缺点，分别适合不同性质的蛋白的表达。并且同一噬菌体展示系统中还有不同的表达载体选择。如丝状噬菌体的主要外壳蛋白gp8适合表达较小的多肽片断，表达拷贝数多，而次要外壳蛋白gp3适合表达较大的外源蛋白片断，表达的拷贝数少。

本发明的方法可以选择各种噬菌体展示系统，包括但不限于：M13噬菌体、fd噬菌体、f1噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体、或T7噬菌体。具体的，可根据需要展示在噬菌体衣壳表面的蛋白的不同(比如蛋白分子量的大小、蛋白的结构特征等因素)进行选择。

并且，外源蛋白通过与噬菌体的外壳蛋白融合表达而展示表达在噬菌体表面。外源蛋白与不同的噬菌体外壳蛋白融合表达，最终在噬菌体表面的表达部位会有不同。如与丝状噬菌体gp3融合是表达于噬菌体的末端，而与gp8融合则是表达于噬菌体的四周。

2.外源蛋白融合噬菌体的制备和纯化

本发明的方法中，各种外源蛋白可展示在各种不同的噬菌体系统中，具体根据目的应用的不同进行选择。

制备外壳展示有外源蛋白的噬菌体的方法是本领域普通技术人员所熟悉的，一般包括步骤：将目标基因连接到噬菌体载体的外壳蛋白的基因上，通过与噬菌体外壳蛋白融合表达，从而使外源的多肽或蛋白质展示表达在噬菌体的表面。

在丝状噬菌体展示系统和烈性噬菌体展示系统中，由于各种原因导致与噬菌体外壳蛋白融合表达的外源蛋白无法被组装进入噬菌体颗粒，从而造成获得的噬菌体中全部或大部分是无外源蛋白组装的“光头”噬菌体(bald phage)，这些大量存在的“光头”噬菌体在检测过程中形成高背景，干扰展示表达蛋白的定量检测。

优选的，可通过以下几种方式去除未展示外源蛋白的噬菌体，获得需测定的展示有外源蛋白的噬菌体。

第一种方式：获得的噬菌体与固定化的配基或抗体孵育结合，孵育后的复合物利用缓冲溶液直接清洗，保留在固定介质上的噬菌体即为展示表达有待测蛋白的噬菌体。在这种情况下，展示蛋白与配基或抗体通常有比较专一特异的结合。

第二种方式：孵育后的复合物利用游离的配基进行竞争性结合，竞争洗脱的噬菌体是展示表达有外源蛋白的噬菌体。

第三种方式：如果竞争性洗脱的噬菌体中，仍然有较多的“光头”噬菌体，可使用pHEN1-KM13丝状噬菌体展示系统，通过利用酶切去除“光头”噬菌体的侵染宿主菌的能力。酶切后得到的噬菌体滴度就是展示表达有外源蛋白的噬菌体数目。因为丝状噬菌体gp3蛋白由N1，N2和CT三个结构域构成，并且其结构保持完整是丝状噬菌体侵染大肠杆菌所必须的，而融合在其N端的外源蛋白通常对丝状噬菌体侵染能力无大的影响。辅助噬菌体KM13在N1-N2结构域与CT结构域之间插入了trypsin酶切位点。融合有外源蛋白的丝状噬菌体gp3来源于噬菌粒，不能被trypsin酶切降解，能保持侵染大肠杆菌的能力；而不融合有外源蛋白的“bald phage”的gp3蛋白来源于改造的辅助噬菌体KM13，一旦被trypsin酶切降解，噬菌体将丧失对大肠杆菌的侵染能力，因而可以利用酶切降低“光头”噬菌体带来的背景。

3.噬菌体滴度测定

“噬菌体滴度”是指单位体积内噬菌体颗粒数量，对于温和噬菌体(如丝状噬菌体)，通常用菌落形成单位(colony forming unit，cfu)表示；对于烈性噬菌体(如λ、T4和T7噬菌体)，通常用噬菌斑形成单位(plaque forming unit，pfu)表示。

本发明的方法中，噬菌体或融合表达有待测蛋白的噬菌体的滴度的测定可采用常规的噬菌体滴度检测方法。具体的测定方法可根据所选择的噬菌体展示系统的不同而不同。常规的噬菌体滴度测定方法是本领域技术人员所熟练掌握的。

5.根据融合表达有待测蛋白的噬菌体的滴度推算确定待测蛋白质的量

根据表达有外源融合蛋白的噬菌体数目(滴度)，确定标准曲线(或可推导出公式)，从而可推算出检测的外源融合蛋白的量。

将噬菌体展示技术应用于定量测定外源蛋白的量或外源蛋白亲和物质的量，首先需要考虑的是展示表达在噬菌体表面的外源蛋白的自然结构特性，即外源蛋白与亲和物质之间必须存在相互结合，并且两者之间的结合存在一定的数量关系，这特性也是应用噬菌体展示系统进行定量测定的前提；然后需要考虑的是外源蛋白展示表达在噬菌体表面以后，仍然保持有其自然的结构活性，仍然具有结合能力；此外展示外源蛋白的噬菌体的数量必须是可以检测的，并且这种展示有外源蛋白的噬菌体与亲和物质结合的数量在一定范围内能利用标准曲线表示。满足以上条件就可以利用噬菌体展示系统的优点定量检测外源蛋白或外源蛋白亲和物质的量。

本发明的主要优点在于：

以往的技术中均采用噬菌体展示技术进行蛋白表达与否的定性检测，无法进行定量检测。而本发明人发展了利用噬菌体展示系统定量检测外源蛋白或外源蛋白的亲和配体的方法，克服了以往只将噬菌体展示技术用于外源蛋白的表达和定性检测的技术局限。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

应理解，在实施例或实验材料和方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据所需获得的本发明结果而加以变化。并且，这些参数并非用来限定与本发明申请专利范围均等的原理，而是应用正常操作技术下所得到的较佳数据。

本发明具体实施方式中使用到以下的材料和方法，以下方法和实施例中使用的各种载体、噬菌体、试剂等都是作为进一步例证和解释本发明的工具和手段，而并非用于对本发明的限制。并且，常规的PCR、酶切、连接、转化、电泳、质粒抽提、抗性选择、细菌培养等操作是本领域现有技术人员所熟知的，在本发明中不作详细描述。

I.材料

噬菌粒载体pHEN1和辅助噬菌体KM13的构建参见文献(Kristensen P，Winter G：Proteolytic selection for protein folding using filamentousbacteriophages.Fold.Des 1998，3：321-328.)；pGEX-2T购自AmershamPharmacia公司；谷胱甘肽琼脂糖(Glutathione Sepharose)4B和琼脂糖(Sepharose)4B购自Pharmacia公司；还原型谷胱甘肽(glutathione)、PEG8000、胰蛋白酶trypsin 1∶250(＞250U/mg)购自Amresco公司。

大肠杆菌TG1细胞购自Stratagene公司。PCR引物合成和序列测定由上海申能博彩生物技术公司完成。

其它使用的一些常规试剂和材料可参考《分子克隆：实验室指南》中所列举的，在此不作详细描述。

II.具体实施例

常规的PCR、酶切、连接、转化、电泳、质粒抽提、抗性选择、细菌培养等操作是本领域现有技术人员所熟知的，并且也可参照《分子克隆：实验室指南》中所列举的，在此不作详细描述。

实施例1 GST蛋白展示表达噬菌粒的构建

从质粒pGEX-2T中，利用引物GST_Fwd和GST_Rev进行PCR扩增，获得谷胱甘肽S转移酶(GST)基因。PCR产物经NcoI和salI双酶切后与pHEN1噬菌粒连接，得到融合有GST的噬菌粒pHGST。

其中引物GST_Fwd：5’-CATGCCATGGCCATGTCCCCTATACTAGGT-3’(NcoI)和GST_Rev：5’-ACGCGTCGACGGATCCACGCGGAACCAG-3’(SalI)，下划线所指为括号中所示酶切位点。

构建的噬菌粒转化菌落后扩大培养，抽提质粒，酶切验证插入的外源片段大小。琼脂糖凝胶电泳结果表明酶切片断及大小与预期相符，表示各外源蛋白GST基因成功克隆进入载体pHEN1。

实施例2融合表达有外源蛋白的噬菌体的扩增

采用常规方法，将前述构建的噬菌粒转化感受态的大肠杆菌TG1细胞。

挑取转化有噬菌粒的TG1单克隆过夜培养，取0.5mL于含0.1％葡萄糖，60μg/mL氨苄青霉素的50mL LB培养基中37℃培养至OD₆₀₀0.6，加入5×10¹¹KM13辅助噬菌体(moi＝20)超感染，静置30min后，再分别加入卡那霉素(终浓度50μg/mL)和IPTG(终浓度1mM)，30℃振荡过夜。次日8000r/min离心取上清，加入1/4体积噬菌体沉淀液(200g/L PEG 8000，2.5mol/L NaCl)沉淀噬菌体，冰上静置1h，然后于4℃12000r/min离心20min，用1mL PBS溶液(137mMNaCl，3mM KCl，8mM Na₂HPO4，1mM KH₂PO4，pH7.4)重悬沉淀，8000r/min离心5min后吸取上清，得到的噬菌体于4℃保存。

结果发现，pHGST噬菌粒转化大肠杆菌后经辅助噬菌体KM13超感染，一部分是无外源蛋白组装的噬菌体(bald phage)，其gp3蛋白来源于辅助噬菌体KM13；另外一部分是组装有外源蛋白GST的噬菌体，其部分gp3蛋白来源于噬菌粒pHGST，N末端连接有GST外源蛋白。

实施例3融合表达有外源蛋白的噬菌体的滴度测定

PEG/NaCl沉淀获得丝状噬菌体及其滴度测定是根据常规的操作，参考《分子克隆：实验室指南》。

获得的噬菌体中展示表达有外源蛋白的噬菌体滴度测定参考文献(Kristensen P，Winter G：Proteolytic selection for protein folding usingfilamentous bacteriophages.Fold.Des 1998，3：321-328)。简而言之，取10μl经过适度稀释后的PEG/NaCl沉淀获得的噬菌体，与80μl酶切缓冲溶液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl，1mM CaCl₂，pH7.4)混合，再加入10μl trypsin溶液(1mg/mL)，37℃消化15min后，再参照常规的丝状噬菌体滴度测定步骤测定酶切处理后的噬菌体滴度，所测定的噬菌体滴度即为展示有外源蛋白的噬菌体滴度。

四次实验中PEG/NaCl沉淀获得的pHGST噬菌体测定的噬菌体滴度及其trypsin处理(去除光头噬菌体)以后测定的噬菌体滴度见表1。

表1

 1 2 3 4  cfu/mL 2.2e+12 8.0e+12 8e+11 1.0e+12  trypsin处理  后cfu/mL 1.2e+08 8.8e+07 7.4e+08 9.0e+07

实施例4展示在噬菌体表面的外源蛋白的活性确定

噬菌粒pHGST和pHEN1分别转化TG1，利用KM13超感染扩增获得噬菌体分别为pHGST噬菌体和pHEN1噬菌体。用PBS稀释到1×10⁸/mL的pHGST噬菌体分别与10μl(50％悬浮液)谷胱甘肽琼脂糖4B和琼脂糖4B树脂混合，4℃轻微振荡1小时。离心沉淀的树脂用0.5mL PBS清洗两次后，用0.5mL 100μM还原型谷胱甘肽(溶解于PBS溶液中)竞争性洗脱30min，分别测定洗脱溶液中trypsin酶切处理后的噬菌体滴度。同时，以相同数目的pHEN1噬菌体与谷胱甘肽琼脂糖4B和琼脂糖4B树脂混合作为对照。每个样品测定两次，取其平均值并进行统计学分析。

图1结果显示，无外源蛋白展示的pHEN1噬菌体与树脂介质琼脂糖4B之间(PS)以及与亲和树脂谷胱甘肽琼脂糖4B之间(PG)的结合很弱，而pHGST噬菌体与亲和树脂谷胱甘肽琼脂糖4B之间(GG)显示有很强烈的结合，pHGST噬菌体与pHEN1噬菌体的差别仅在于前者的部分噬菌体组装有外源蛋白GST，说明这种强烈的结合主要来源于组装的GST与谷胱甘肽琼脂糖4B之间，而其余的无外源蛋白展示的噬菌体与亲和树脂的结合很弱。

图1结果同时显示pHGST噬菌体与谷胱甘肽琼脂糖4B之间(GG)的结合远强于pHGST噬菌体与琼脂糖4B介质之间(GS)的结合，说明前者的强烈结合主要来源于pHGST噬菌体与谷胱甘肽琼脂糖4B亲和树脂上的谷胱甘肽配基之间。

综合以上结果可以得出，当pHGST噬菌体与谷胱甘肽琼脂糖4B混合时，主要的结合来自于组装在噬菌体表面的外源蛋白GST与亲和树脂上的谷胱甘肽配基之间，两者之间的结合是特异结合，从而说明表达在噬菌体表面的GST蛋白仍然保持其原来的结构，具有结合谷胱甘肽的活性。

实施例5确定展示在噬菌体表面的外源蛋白的检测下限

利用不同数量的pHGST噬菌体(1×10²～1×10⁶)与10μl(50％悬浮液)谷胱甘肽琼脂糖4B和琼脂糖4B树脂混合，4℃结合1小时后，用0.5mL PBS清洗两次，然后分别用0.1mM的还原型谷胱甘肽竞争性洗脱。

从图2可以看出，随着加入的pHGST噬菌体从1×10⁶减少到1×10²，从亲和树脂谷胱甘肽琼脂糖4B上竞争洗脱下来的噬菌体也逐渐减少，而从非亲和树脂琼脂糖4B上(非特异结合对照)上竞争下来的噬菌体数量变化较小。在加入的噬菌体为1×10⁶和1×10⁵时，从亲和树脂谷胱甘肽琼脂糖4B上特异洗脱的数量与从非亲和树脂琼脂糖4B上非特异洗脱的对照具有显著的差异。而在加入的噬菌体为1×10³时，两者之间的差异已不明显。如果以二倍于非特异洗脱的数量作为检测的最低限，从图中可以得出检测到与谷胱甘肽琼脂糖4B上谷胱甘肽小分子有相互作用的融合有GST的噬菌体所需要的最低数量为1×10⁴，该数量也即噬菌体展示系统应用于展示表达在噬菌体表面的外源蛋白检测时的最低检测限。

实施例6展示在噬菌体表面上的蛋白的数量计算

通过实施例5的结合竞争洗脱后，进行滴度测定，获得的噬菌体侵染细菌的菌落形成单位(cfu)与结合前的展示有外源蛋白GST的噬菌体数量(见表2)的标准曲线见图3。

表2

已知的加入噬菌体cfu  10⁶  10⁵  10⁴  10³  10²获得的噬菌体cfu  1400  590  117  133  63

根据图3，获得标准曲线(或公式)：Y＝640X-2500，其中Y代表获得的噬菌体侵染细菌的菌落形成单位(cfu)，X代表结合前的展示有外源蛋白的噬菌体的数量的对数值。根据标准曲线(或公式)，以及测定的噬菌体菌落形成单位，就可以反向推算出融合有外源蛋白的噬菌体的数量(摩尔数)，同时，每个噬菌体组装展示外源蛋白的数目是确定的，从而可以确定外源融合蛋白的数量(摩尔数)(具体计算参考实施例8)。

图3中可见，当结合前带有外源蛋白的噬菌体低于10⁴时(图中横坐标10³和10²代表的噬菌体数目)，小于系统测定的最低检测限，这时测定值仅仅与系统测定的背景信号相关，因此结合前的噬菌体数与测定的噬菌体菌落形成单位并不成正相关。

实施例7定量检测外源蛋白的亲和物质的量

1×10⁸/mL的pHGST噬菌体与10μl(50％悬浮液)谷胱甘肽琼脂糖4B通过如实施例4所述的结合和洗涤后，利用不同浓度的还原型谷胱甘肽(1×10^-9mol/L～1×10^-3mol/L)竞争洗脱，洗脱获得的噬菌体进行滴度测定。获得的噬菌体侵染细菌的菌落形成单位(cfu)与竞争性洗脱的还原型谷胱甘肽浓度(见表3)的标准曲线见图4。

表3

亲和物质浓度(mol/L)10^-9 10^-8 10^-7 10^-6 10^-5 10^-4 10^-3获得的噬菌体cfu 0.9×10⁴ 0.4×10⁴ 1.2×10⁴ 3.1×10⁴ 4.8×10⁴ 5.8×10⁴ 5.7×10⁴

根据图4，获得标准曲线(或公式)：Y＝14400X+117000，其中Y代表获得的噬菌体侵染细菌的菌落形成单位(cfu)，X代表洗脱的亲和物浓度的对数值。根据标准曲线(或公式)，以及测定的噬菌体菌落形成单位，就可以反向推算出融合在噬菌体外壳的外源蛋白的亲和物质的数量(摩尔数)(具体计算参考实施例9)。利用不同量的pHGST噬菌体(1×10⁹/mL、1×10⁷/mL、1×10⁶/mL)与谷胱甘肽琼脂糖4B结合后，执行同样的操作步骤，然后测定还原型谷胱甘肽洗脱浓度与洗脱噬菌体滴度的相互关系，得出的标准曲线(或公式)与Y＝14400X+117000近似。

图4中可见，当外源蛋白的亲和物质的洗脱浓度大于1×10^-4mol/L或小于1×10^-8mol/L时，测定的洗脱的噬菌体菌落形成单位与亲和物质的浓度并不成一定的相关性。因此噬菌体展示系统测定外源蛋白亲和物质的测定范围在1×10^-8mol/L和1×10^-4mol/L之间。

实施例8定量检测噬菌体展示库中特定外源蛋白含量

根据实施例6获得的公式，在需要进行外源蛋白的定量检测时，通过获得结合洗脱步骤后的噬菌体滴度，即可获得外源蛋白的定量结果。

需要检测一种展示表达在噬菌体表面的外源蛋白的量，首先确定一种能与待测外源蛋白相互结合的亲和物质(包括配基、抗体或其相互作用蛋白)，并通过化学交联或物理吸附固定在支持介质上。展示有外源蛋白的噬菌体与其亲和物质结合后，洗涤，然后用游离的亲和物质溶液洗脱。整个操作流程与获得标准曲线的流程一致。如果最终测定的洗脱的噬菌体cfu为1000(Y＝1000)，代入标准曲线(或公式)Y＝640X-2500，得出X值为5.47，其对应的展示有外源蛋白的噬菌体数为10^5.47＝2.9×10^-5，因为展示表达在噬菌体表面的外源蛋白的数目是一定的，对于大分子量蛋白质，每个丝状噬菌体通常展示一个蛋白分子，从而可以推算出展示在噬菌体表面的量为2.9×10⁵，约为4.9×10^-19摩尔。对于如果测定的cfu超过1400(即加入的噬菌体大于标准曲线中的10⁶)，可以通过将获得的噬菌体进行稀释，使得测定的洗脱噬菌体滴度在适合的测定范围内。如果测定的cfu小于117(即加入的噬菌体小于标准曲线中的10⁴)，则不适合于利用噬菌体展示系统中检测展示有外源蛋白的噬菌体数目。

实施例9定量检测外源蛋白的亲和物质的含量

根据实施例7获得的公式，在需要进行外源蛋白的亲和物质的定量检测时，通过获得结合洗脱步骤后的噬菌体滴度，即可获得亲和物质的定量结果。

例如，需要检测某一外源蛋白的亲和物质(包括蛋白配体、抗体或结合蛋白等)的量，首先将外源蛋白展示表达在噬菌体表面，并将亲和物质通过化学交联或物理吸附固定在支持介质上，两者进行充分的结合和洗涤。然后用待测的亲和物质溶液进行洗脱。根据洗脱的噬菌体滴度测定溶液中待测亲和物质的量。如果最终测定的洗脱的噬菌体cfu为20000(Y＝20000)，代入标准曲线(或公式)Y＝14400X+117000，得出X值为-6.74，其对应的亲和物质的浓度为10^(-6.74)＝1.8×10^-7mol/L。适合测定的亲和物质的浓度范围在10^-8～10^-3mol/L，最终测定的亲和物质的浓度需适合这浓度区间。

实施例10展示表达在噬菌体表面的HuR蛋白能与富含AU的mRNA结合

HuR蛋白是基因表达转录后调控蛋白Hu家族的唯一非组织特异因子，它通过与mRNA的富含AU序列的转录后调控元件结合，参与细胞内的转录后调控作用。

采用常规的方法，将HuR基因(Gnebank号：U38175)克隆进入pHEN1噬菌粒后，利用辅助噬菌体KM13超感染确定HuR蛋白能展示表达在丝状噬菌体表面。细胞白介素8(IL-8)(ATCC号：MGC-9211)的3’非翻译区富含AU序列，利用体外转录系统转录出白介素8的3’非翻译区的mRNA。

采用前述相似的方法进行检测。结果发现，展示表达在噬菌体表面的HuR蛋白能与富含AU序列的白介素8非翻译区mRNA结合。两者的结合在一定浓度范围内呈正相关。

由此可见，同样可以利用前面所述方法检测外源的融合蛋白HuR的量，或者与HuR蛋白结合的mRNA的量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                 序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>利用噬菌体展示技术定量检测融合蛋白或融合蛋白的亲和物质的方法

<130>059728

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

catgccatgg ccatgtcccc tatactaggt                 30

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

acgcgtcgac ggatccacgc ggaaccag                   28