采用分子信标为底物检测尿嘧啶DNA糖苷酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种采用分子信标为底物检测尿嘧啶DNA糖苷酶活性的方法，利用UDG能切断分子信标中的尿嘧啶(U)碱基与糖基之间的N－糖苷键，再用碱处理缺碱基位点的底物就能使产物释放荧光信号的特性，根据检测到的荧光信号强度来确定UDG的活性。首先设计反应底物分子信标，根据最低自由能原理确定分子信标的一级结构顺序，再把一个脱氧尿嘧啶碱基插入到茎环结构的分子信标茎上。这样分子信标底物UDG在37℃保温一段时间后，再用适当浓度的碱处理反应混合液就可使分子信标茎环分离，释放荧光。荧光信号可在荧光检测仪上直接检测出来，无需分离产物。本发明不仅能够很灵敏的检测出纯的UDG，而且还能检测出粗抽提液中UDG的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用分子信标为底物检测尿嘧啶DNA糖苷酶活性的方法，可以很灵敏的检测到纯的尿嘧啶DNA糖苷酶活性及粗抽提液中尿嘧啶DNA糖苷酶活性，并可对其含量进行定量分析，属于蛋白定性和定量检测领域。

背景技术

尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil DNA Glycosylase，UDG)能切断DNA中错误插入的尿嘧啶(U)碱基与糖基之间的N-糖苷键，移去尿嘧啶，留下无碱基位点，该位点能被其它酶(如DNA聚合酶和DNA连接酶)识别和修复。因此，UDG能够减少由胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)配对向腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对的颠换率，防止和修复DNA中的错配，是生物体减少突变的自我保护机制之一。另外，UDG也是防止PCR家阳性反应的工具酶。UDG通过打断核算链上dUTP的核干键，使含dUTP的核酸不能作为模板被扩增。

尿嘧啶DNA糖苷酶活性测定通常采用20世纪80年代初建立的同位素法，即使用同位素标记核酸探针为底物，反应产物在尿素变性胶上电泳分离后，通过检测仪测定产物放射性的强度来确定产物相对量。同位素的放射性很强，对人体伤害很大。后来又出现了电泳成像分析测定UDG活性的新方法[陈朝银等，尿嘧啶DNA糖苷酶活性的电泳凝胶成像分析测定.科技通报，2004，20(2)：]以dU-ung为底物，通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析，测定底物dU-ung的残留量以测定UDG酶活性。但该方法的产物也需要电泳分析鉴定，这样整个操作过程很烦琐，且上述方法的灵敏度均很低。无污染的、灵敏的、不需要分离就可以检测UDG的技术是核酸检测领域的发展方向。

分子信标(molecular beacon)为快速灵敏的检测UDG提供了可能[Tan，W.，X.Fang，J.Li，and X.Liu.Molecular beacons：a novel DNA probe for nucleicacid and protein studies.Chemistry 2000.6(7)：1107-1111.]。分子信标是一种短的寡核苷酸单链构成的茎环结构。寡核苷酸链一端为荧光基团标记，另一端为淬灭基团标记。由于两端的核苷酸序列互补，其荧光基团和淬灭基团相互靠近发生能量共振，被激发后荧光基团产生的光子被淬灭基团淬灭。如果被检测的UDG分子作用于尿嘧啶碱基与糖基之间的N-糖苷键，移去尿嘧啶，再用碱处理无碱基的位点，分子信标的茎环结构就会遭到破坏，从而增加了荧光基团与淬灭基团之间的空间距离，不能产生荧光能量共振转移，就能够检测被激发后荧光基团产生的荧光信号。目前尚未有采用荧光法对尿嘧啶DNA糖苷酶活性进行检测的公开文献报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种采用分子信标为底物检测尿嘧啶DNA糖苷酶活性的方法，无需分离产物直接检测产物的荧光信号，从而实现检测方便，灵敏度高，特异性强。

为实现这一目的，本发明利用UDG能切断分子信标中的尿嘧啶(U)碱基与糖基之间的N-糖苷键，再用碱处理缺碱基位点的底物就能使产物释放荧光信号的特性，根据检测到的荧光信号强度来确定UDG的活性。首先设计反应底物分子信标，根据最低自由能原理确定分子信标的一级结构顺序，再把一个脱氧尿嘧啶碱基插入到茎环结构的分子信标茎上。这样分子信标底物UDG在37℃保温一段时间后，再用适当浓度的碱处理反应混合液就可使分子信标茎环分离，释放荧光。基于这一原理实现了对多种形式UDG的检测。

荧光信号可在荧光检测仪上直接检测出来，无需分离产物。该方法不仅能够很灵敏的检测出纯的UDG，而且还能检测出粗抽提液中UDG的含量。

本发明方法的具体步骤如下：

1、分子信标的设计和合成：

首先设计反应底物分子信标，根据最低自由能原理确定分子信标的一级结构顺序，再把一个脱氧尿嘧啶碱基插入到茎环结构的分子信标茎上，分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，且5-9对序列为互补配对；

2、被检测UDG样品的制备：

针对不同的检测水平制备不同的UDG样品，即制备电泳纯的UDG酶用于检测纯酶活性，或者先构建UDG的突变体菌株，将菌体裂解后的上清液作为样品用于检测粗抽提液中UDG的活性及含量。

3、UDG酶切反应：

在含有5微升的10xUDG缓冲液的反应混合液中，加入5皮摩尔量的分子信标，再加入2微升的UDG，加水补齐到50微升作为反应体系；共做10个不同UDG浓度的反应体系，另外有一个对照管，即反应体系中不加UDG酶；样品混合后置于37℃暗处温浴30分钟，再分别向反应体系中加入终浓度为0.1M的氢氧化钠，在85℃温育15分钟，最后将反应混合物转移到检测板并用Tris-Cl调节其PH值到7.0，在荧光检测仪上直接读出荧光强度；在检测粗抽提液中UDG活性时需要加入外源ssDNA(10-20微克)来保护分子信标底物。

4、荧光数值分析：

根据所测荧光强度与被检测产物分子含量的线性关系，得到对应某个荧光强度下的产物的分子含量，从而得到被检测样品UDG酶的活性，并且针对不同水平的被检测样品，根据不同的荧光值反映出不同的特性而进行定性分析。

本发明的原理为分子信标茎中含有一个脱氧尿嘧啶碱基，能够被UDG切除。含有脱碱基位点的分子信标底物很不稳定，经碱处理后分子信标底物在含尿嘧啶碱基处断开从而使得底物的荧光信号放出。

本发明通过用分子信标做底物实现了快速，灵敏，安全的UDG活性检测，与以往UDG活性检测方法相比有如下优点：(1)用荧光标记的分子信标代替同位素标记的底物大大减少了对实验者的伤害；(2)反应产物的荧光信号可以直接测的，无需电泳分离鉴定，大大节约了实验时间；(3)该方法不仅能够很灵敏的检测出纯的UDG，而且还能检测粗抽提液中UDG的活性、含量(需要适量的外源ssDNA保护核算酶对分子信标底物的降解)，这是以往凝胶电泳分离分析产物的方法所不能实现的。

附图说明

图1为本发明含尿嘧啶碱基分子信标的检测UDH酶切反应的原理图。

图2为纯的UDG酶浓度与荧光信号强度的比例关系曲线。

图2中，(A)为产物荧光信号强度与反应体系中UDG酶含量的关系图；(B)为分子信标为底物时，UDG催化的酶促反应动力学图。

图3为突变体粗抽提液中加入UDG后荧光信号增强曲线。

图3中，(A)为外源ssDNA对核酸酶酶切分子信标底物的保护作用图；(B)为产物的荧光信号强度与粗抽提液中UDG酶含量的关系图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

图1是本发明的原理图。如图1所示，分子信标底物与UDG在37度保温30分钟后，底物中的尿嘧啶碱基会被移去，产生无碱基位点的底物。该底物再与碱在85度保温15分钟就会在无碱基位点处断裂，这样的分子信标很不稳定，茎环很易分离从而释放荧光信号。通过荧光信号的强度来确定产物的量，进而定出UDG酶的活性。

实施例1纯的UDG活性检测

1、分子信标的设计和合成：

参照以往检测UDG活性的寡核苷酸底物，再根据能量最低的原理确定分子信标得一级序列，分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团如FAM和荧光淬灭基团DABCYL标记，且7对序列为互补配对形成茎结构，如5’(7-FAM)-GACCTGC和GCAGGTC-(DABCYL)3’。分子信标序列为5’(6-FAM)-GACCTGCUCAGTACGAGAGGACCGCAGGTC-3’

2、被检测UDG样品的制备：

带有Pdest17-UDG的蛋白表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在37度的含有50ug/ul卡那得LB培养基中生长。当OD600值为0.8的时候，加入IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)到浓度为1Mm，进行诱导。诱导6小时后，收集菌体，加入裂解液进行裂解。之后将裂解液于12000转/分的速度下离心45分钟，收集上清。上清也加入到事先用裂解缓冲液平衡后的Ni-NTA树脂柱中。装有Ni-NTA树脂的柱子经过洗涤缓冲液洗涤，直到洗涤液的OD280值小于0.001，再用5ml的洗脱缓冲液洗脱下目标蛋白。参照[Liu，X.and J.Liu.Cloning，expression，and characterization of uracil-DNA glycosylase of Chlamydia pneumoniae inEscherichia coli.Protein Expr Purif2004(35)：46-53]。

3、UDG酶切反应：

针对检测纯的UDG活性，制备电泳纯的UDG酶。

在含有5微升的10xUDG缓冲液的反应混合液中，加入5皮摩尔量的分子信标，再加入2微升的UDG，加水补齐到50微升。共做10个不同UDG浓度的反应体系。另外做一个对照管，即反应体系中不加UDG酶。样品混合后置于37℃暗处温浴30分钟，再分别向反应体系中加入终浓度为0.1M的氢氧化钠，混合物在85℃温育15分钟。最后将反应混合物转移到检测板并用Tris-Cl调节其PH值到7.0，在荧光检测仪上直接读出荧光强度。

其中所述UDG缓冲液的组分为：20毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)pH8.0，50毫摩尔氯化钠，1毫摩尔乙二胺四乙酸，1毫摩尔二硫苏糖醇，100微克每毫升小牛血清蛋白。

4、荧光数值分析：

分子信标释放的荧光信号与UDG浓度的对应关系如图2所示，其中，分子信标释放的荧光信号取决于体系中UDG酶的活力。图2中，(A)图是用不同浓度(320皮克、240皮克、160皮克、80皮克、60皮克、50皮克、40皮克、30皮克、20皮克、10皮克)的UDG与分子信标底物保温产生荧光信号的强度；(B)图表明了UDG酶切反应的动力学关系。根据图A中的最适酶量，在8组反应体系中加入不同浓度的底物，测定反应最初2分钟的产物量，计算反应的最大速率，从而得出反应的动力学常数及UDG的相对比活。

实施例2粗抽提液中UDG活性的检测

1、分子信标的设计和合成：

与实施例1相同，底物仍然是上述的分子信标。

2、UDG突变菌株的构建及粗抽提液的制备：

a、UDG突变菌株引物的设计：

首先设计构建突变体菌株的引物，该引物中需要有20nt的寡核苷酸与不含UDG编码序列的Pet28A质粒模版相匹配，另外还需要40nt的寡核苷酸序列能够与E.coli DY329菌株中UDG编码基因相邻序列同源。综上因素，设计引物序列如下：正向引物(5'-ttaagctagg cggattgaag attcgcagga gagcgagatgggcagcagccatcatcatca tcatca-3’)反向引物(5'-agccgggtgg caactctgcc atccggcatttccccgcaaa tttggtatct gcgctctgct gaagcc)。

先通过PCR反应从模板质粒上扩增出sec-kana片断，纯化PCR产物。参照[Roden，L.C.，B.Go.ttgens，and E.S.Mutasa-Gottgens.Protocol：precisionengineering of plant gene loci by homologous recombination cloning in Escherichiacoli.Plant Methods 2005(1)：1-6]，通过电转化的方法将PCR产物与DY329菌株同源重组。将重组产物在有kana抗性的培养基上32度过夜培养，选择阳性克隆即为构建成功的菌株。

b.UDG突变体菌株粗抽提液的制备：

带有Pdest17-UDG的蛋白表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在37度的含有50ug/ul卡那得LB培养基中生长。当OD600值为0.8的时候，加入IPTG(异丙基硫代-B-D半乳糖苷)到浓度为1Mm，进行诱导。诱导6小时后，收集菌体，加入裂解液进行裂解。之后将裂解液于12000转/分的速度下离心45分钟，收集上清，即为粗抽提掖。参照[Liu，X.and J.Liu.Cloning，expression，andcharacterization of uracil-DNA glycosylase of Chlamydia pneumoniae in Escherichiacoli.Protein Expr Purif 2004(35)：46-53]。

3、粗抽提液酶切反应：

考虑到粗抽提液中核酸内切酶的影响，需要在反映体系中加入外源的ssDNA来保护反应底物。首先摸索了50微升的反映体系中含有5皮摩尔的底物及3微克的粗抽提液中应加入多少量的ssDNA。共做了12管含有不同ssDNA量的对照实验。即在5微升10xUDG反应缓冲液中加入5皮摩尔底物，3微克粗抽提液，不同量的ssDNA(0、1微克、2微克、4微克、6微克、8微克、10微克、12微克、14微克、16微克、18微克、20微克)，加水补齐到50微升。反映混合物在37度保温30分钟后再加终浓度为0.1M的氢氧化钠在85度保温15分钟，样品转移到检测板调节PH值后就可测量荧光信号强度。根据这组数据得出15微克的ssDNA即可在这样的反应体系中很好的保护底物。

确定好反应的影响参数之后，在5微升10xUDG反应缓冲液中加入5皮摩尔底物，3微克粗抽提液，15微克ssDNA，不同量纯的UDG(0.02纳克、0.04纳克、0.1纳克、0.15纳克、0.2纳克、0.4纳克、0.6纳克、1.5纳克、3纳克、6纳克)，加水补齐到50微升。其余操作同上，最后测得荧光信号并进行分析。

4、荧光数值分析：

本实施例中分子信标释放的荧光信号与UDG活性的对应关系如图3所示，图3中，(A)图是用不同量(0、1微克、2微克、4微克、6微克、8微克、10微克、12微克、14微克、16微克、18微克、20微克)的ssDNA对分子信标底物在粗抽提液中的保护作用；(B)图表明了在粗抽提液中不同浓度的UDG与荧光信号强度的关系。

以上实施例1、2证明，本发明采用分子信标作为检测UDG活性的底物，可以实现快速，灵敏，无污染等目的。同时本发明还能够检测粗抽提液中UDG的活性，并对其定量。