一种低粘度溶液中单分子示踪方法

摘要

一种低粘度溶液中单分子示踪方法，它以标记了染料的分子为示踪对象，用脱水的琼脂糖凝胶修饰载玻片，对盖玻片和琼脂糖凝胶之间溶液中单分子进行荧光成像。其步骤是：(1)在载波片上形成琼脂糖凝胶薄层；(2)将琼脂糖凝胶脱水干燥；(3)将标记了染料的样品滴到干燥的琼脂糖凝胶上；(4)盖上盖玻片；(5)送显微镜观察，进行单分子荧光成像。本发明方法可实现在低粘度溶液中对单个分子进行动态实时监测，且该方法成本低廉、操作简单、快捷。

说明书

技术领域：

本发明主要涉及一种低粘度溶液中单分子示踪方法。

背景技术：

迄今为止，传统意义上的分析化学所测量的实际上是大量分子的系综平均值，这种系综的统计结果已经不能满足对复杂而非均相的生物体系的分析要求。近年来，一种以单个分子为对象的分析技术已应运而生。单分子水平上的检测技术已经成为传统系综研究手段的有力补充，立足于个体分子，研究宏观体系。与系综方法仅提供体系的平均性质相比，单分子检测技术能探测到物理量的分布和时间轨迹信息，可以研究平衡态下体系的涨落及非平衡态下的反应途径，即可以实现反应中间产物的检测及反应途径的监测，追踪大分子在执行生理功能时的结构变化。单分子荧光成像是单分子检测技术的一种，以其高通量、实时追踪的特点逐渐成为主流的单分子检测技术，尤其在生物大分子相互作用的研究中有广阔的应用前景。

分子的快速扩散是导致追踪、监测单个分子运动行为相对困难的原因之一。解决这个问题常用的方法有：

1、将目标分子固定或部分固定。例如将蛋白质分子包埋到聚丙烯酰胺凝胶中(参考文献：Dickson，R.M.；Norris，D.J.；Tzeng，Y.-L.；Moerner，W.E.Science1996，274-966-969)；将胆固醇氧化酶分子包埋到琼脂糖凝胶中(参考文献：Lu，H.P.；Xun，L.-Y.；Xie，X.S.Science 1998，282，1877-1882)。

2、将单分子置于高粘度溶液中。如甘油水溶液(参考文献：UlrichKubitscheck，Oliver Ku ckmann，Thorsten Kues et al，Biophys.J.2000，78，2170-2179)；用膜联蛋白A5将单个磷脂分子和通道蛋白分子限制在人造磷脂双分子膜内扩散(参考文献：Takehiko Ichikawa，Takaaki Aoki，YukoTakeuchi et al，Langmuir 2006，22，6302-6307)。

这些方法虽然能观察到三维空间内单个分子的运动，但是，分子的运动受到较大的空间位阻，有可能影响生物分子之间的反应活性。

3、使用复杂的设备，提高仪器的性能。如采用滤波式照射(参考文献：Xie，X.S.；Yu，J.；Yang，W.Y.Science 2006，312，228-230.)；采用追踪控制器将扩散粒子限制在共聚焦显微镜的检测区(参考文献：Ha T，Chemla D，Enderle T et al，Appl.Phys.Lett.1997，70，782)；采用快速旋转的激光束绕着分子运动的圆形区扫描(参考文献：Enderlein J，Appl.Phys.B.2000，71，773)。最近，也有使用电场反馈控制使单个分子保持在焦平面内(参考文献：Cohen，A.E.；Moerner，W.E.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 2006，103，4362-4365)。

这些仪器虽然能在一定程度上追踪到单个分子，但是成本高、方法复杂、信噪比不理想，无法追踪到同时反应的多个单分子，会干扰反应过程。

因此，在单分子水平上实时监测生物分子的动态过程，需要寻找更少空间位阻干扰，更简单方便的方法。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提供一种低粘度溶液中单个分子进行实时追踪的方法，以实现在低粘度溶液中对单个分子进行动态实时监测，且所用方法成本低廉、操作简单、快捷。

本发明的技术方案为，所述低粘度溶液中单分子示踪的方法是，以标记了染料的分子为示踪对象，用脱水的琼脂糖凝胶修饰载玻片，对盖玻片和琼脂糖凝胶之间溶液中单分子进行荧光成像。

以下对本发明做出进一步说明。

实施本发明上述方法，可按以下步骤进行：

(1)在载波片上形成琼脂糖凝胶薄层；

(2)将琼脂糖凝胶脱水干燥；

(3)将标记了染料的样品滴到干燥的琼脂糖凝胶上；

(4)盖上盖玻片(参见图1)；

(5)送显微镜观察，进行单分子荧光成像(参见图2)。

本发明所述低粘度溶液最好是1-10cp低粘度溶液。

本发明方法中，如图3至6所示，通过沉降系数、凝胶电泳、光漂白分析和荧光寿命分布，确定观察到的分子是单个分子；如图7所示，对分子进行追踪成像，分析单个分子的运动轨迹；如图8所示，根据分子在焦平面内的停留时间，对比荧光寿命，确定分子是否运动到焦平面之外；如图9所示，根据单分子运动轨迹获得均方位移与时间的关系，以此测单分子的扩散系数；如图10所示，可以分析多个单分子的扩散情况。

与用聚丙烯酰氨凝胶相比，本发明所述用脱水琼脂糖凝胶修饰载玻片，加水溶液后，微孔不会较大程度膨胀，不会给目标分子的运动造成大的空间位阻。

本发明所用载玻片材质可以是玻璃、石英、高分子聚合物、透明陶瓷。所述琼脂糖可以是高熔点、中熔点、低熔点琼脂糖，其浓度在2％-15％之间；浓度过低，凝胶强度不足；浓度过高，难以溶解。

所述染料为Alexa488或可见光激发的有机染料、量子点。

脱水可以在室温下或30℃-50℃烘箱中完成。

样品可以是蛋白质分子或DNA、RNA、糖、氨基酸、药物分子等。

样品浓度为10^-9～10^-15mol/L。样品浓度过低，难以确定为目标分子；浓度过高，导致背景噪音过高，不能区分单个分子。

所用显微镜可以是全内反荧光显微镜、扫描共聚焦荧光显微镜、落射荧光显微镜、微分干涉相差显微镜等。

本发明以脱水的琼脂糖凝胶修饰载玻片，在载玻片表面形成微区；水溶液中运动的单分子在这样的微区中热运动速率降低，可以使用荧光显微镜追踪水溶液中的单个分子，从而提供了一种可行的动态实时监测生物分子相互作用的方法。

由以上可知，本发明为一种低粘度溶液中单个分子进行实时追踪的方法，可实现在低粘度溶液中对单个分子进行动态实时监测，且所述方法成本低廉、操作简单、快捷。

附图说明：

图1为用琼脂糖修饰载玻片的过程示意，其中：步骤(1)为将熔化的琼脂糖2置于载玻片上1，(2)为用玻片4使熔化的琼脂糖形成琼脂糖凝胶薄层3，(3)为移去玻片4，(4)为风干琼脂糖凝胶薄层而使之成为脱水琼脂糖薄层5，(5)是在脱水琼脂糖薄层5上滴加样品溶液6，(6)是加盖玻片7；

图2为单分子扩散成像过程示意图；

图3是对600nM样品测其沉降系数分布，实线为还原态，虚线为非还原态；

图4是对6000nM样品非变性聚丙烯酰氨电泳成像，图中箭头表示电泳方向；

图5、图6分别是测非特异性吸附单个蛋白的光漂白过程和荧光寿命分布；

图7为追踪单个分子的扩散轨迹；

图8为单个分子在焦平面内停留时间分布；

图9为均方位移与时间的关系，据此测扩散系数；

图10为单个分子扩散系数的分布示意图。

在图中：

1-载玻片，    2-熔化的琼脂糖，    3-琼脂糖凝胶薄层，

4-玻片，      5-脱水琼脂糖薄层，  6-样品溶液，

7-盖玻片，    8-物镜，            9-二聚体，

10-单体。

具体实施方式：

滴加5微升标记了Alexa488的牛血清白蛋白(BSA)样品于脱水的琼脂糖凝胶表面，盖上盖玻片，送荧光显微镜观察。对600nM样品测其沉降系数分布，实线为还原态，虚线为非还原态(见图3)；对6000nM样品非变性聚丙烯酰氨电泳成像(见图4)；测非特异性吸附单个蛋白的光漂白过程和荧光寿命分布(见图5、6)。质谱结果表明Alexa488标记在Lys²¹¹(40％的覆盖率)上。对浓度为80pM单个蛋白分子的扩散进行成像追踪，得到单个分子的扩散轨迹(见图7)，根据分子在焦平面内停留时间分布图(见图8)，得出扩散的单个分子在视场内停留2.6±2.6秒。考察了本实验条件下的BSA扩散系数(见图9，斜率即是)，D＝0.73±0.71μm²/s，与文献报道的自由扩散系数相比减小了80倍；分析出多个单分子的扩散情况，见图10。