含定向纳米结构功能化区的纳米结构组成及其制备和应用方法

摘要

本发明涉及含至少定向纳米结构单元的一种纳米结构组成，其包含至少下述组之一种或多种：多纳米结构单元反应器、多活化结构反应器、多空间结构反应器、高活化结构反应器、多种类功能化反应器、多纳米结构试剂盒。本发明的纳米结构组成，提供了较高的适用性，例如较高的个体灵敏度、总体灵敏度、可集成度、或/和应用自由度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种含定向纳米结构功能化区的纳米结构组成。本发明还涉及包含所述纳米结构组成的制备和应用方法。

背景技术

本发明是国际专利申请PCT/CN2004/000437的继续。在国际专利申请PCT/CN2004/000437中，主要是涉及包含非定向排列纳米凸体的纳米结构组成。而本发明，则是将其扩展到包含定向排列纳米凸体的纳米结构组成。包含定向排列纳米凸体的纳米结构组成，已经公开了越来越多的方案。然而，在适用性方面(例如个别灵敏度、总体灵敏度、可集成度)，有尚待改进之处。而且，提供更多可供选择的纳米结构组成，也是其应用多样性的要求。

发明内容

本发明的主要目的是提高包含定向排列纳米凸体的纳米结构组成的适用性，例如提高检测的个体灵敏度、总体灵敏度、可集成度、或/和应用自由度。本发明的目的，基本上通过各种结构组合来实现。

于是，本发明的第一个方面，提供一种含定向纳米结构功能化区的纳米结构组成，其包含：A.至少一个多纳米结构单元反应器，所述反应器含至少一个包含定向排列纳米凸体和至少一种其它纳米结构单元的定向纳米结构功能化区；B.至少一个多活化结构反应器，所述反应器含至少二个包含不同活化结构的功能化区，且其中至少一个是定向纳米结构功能化区；C.至少一个多空间结构反应器，所述反应器含至少二个包含不同空间结构的功能化区，且其中至少一个是定向纳米结构功能化区；D.至少一个高活化结构反应器，所述反应器含至少一个活化基团密度大于2μmol/μm²的定向纳米结构功能化区；E.至少一个多种类功能化反应器，所述多种类功能化反应器含至少二个包含不同种类功能试剂的功能化区，且其中至少一个是定向纳米结构功能化区；或/和F.至少一个多纳米结构试剂盒，所述多纳米结构试剂盒含至少一个含定向纳米结构功能化区的反应器，和至少一种其它纳米结构反应物，其中：(1).所述定向纳米结构功能化区至少包含功能试剂和载体上的定向排列纳米凸体；(2).所述定向纳米结构功能化区中，所述定向排列纳米凸体的分布密度大于10个/μm²。

本发明的第二个方面，提供一种方法，所述方法包括提供和应用本发明的纳米结构组成。

发明内容的详细描述

术语定义

本发明中，术语“纳米结构”，是指包含有纳米结构单元的结构；术语“纳米结构单元”，是指三维结构中至少一维(例如粒径、管径、线径、等等)为纳米尺寸(优选3nm-300nm)的结构单元，例如纳米粒子、纳米凸体、等等；术语“纳米粒子”，是指粒径为纳米尺寸(优选3nm-300nm)的粒子；术语“纳米凸体”是指固体表面上的纳米凸出物，所述纳米凸出物三维结构中至少一维(例如粒径、管径、线径、等等)为纳米尺寸，例如：固定化纳米粒子、固定化纳米管、固定化纳米纤维、载体表面上的纳米尺寸的刻划凸起物、及纳米粒子在载体上的自组装形成的纳米结构单元、等等。

本发明中，术语“纳米结构组成”，是指含纳米装置的组成，例如分析或分离装置或试剂盒；术语“纳米装置”，是指含纳米反应器的装置，例如，纳米芯片、纳米传感器、纳米酶标板、纳米亲和电泳条、纳米亲和层析柱、纳米平面层析试剂条、等等；术语“纳米反应器”，是指含至少一个纳米结构功能化区的反应器；术语“分析”，是指在体外或体内进行的定性或/和定量分析；“分离”是指一种或多种组分从样品其它组分的分离；术语“纳米结构功能化区”，是指含有功能化纳米结构的功能化区，例如纳米芯片上的含有功能化纳米结构的探针点(纳米探针点)、等等。

本发明中，术语“活化结构”是指载体表面上可有效结合功能试剂的结构，例如化学活化结构、涂料包被、等等。化学活化结构至少含活化基团，还可含偶联基团；术语“活化基团”是指用以提供与功能试剂结合的基团(例如氨基、羧基、等等)的基团(例如氨基酸)或复合基团(例如氨基酸衍生物、合成肽基、合成肽衍生物基)；术语“活化纳米结构”，是指这样一种组成，其含纳米结构和其上固定的活化结构，例如活化纳米粒子、活化纳米凸体、活化纳米结构单元、等等；术语“偶联基团”是指结合(例如硅烷偶联剂与纳米结构表面上羟基反应的共价键合)于纳米结构表面上、用以固定活化基团的基团；术语“偶联化纳米结构”是指纳米结构和其上固定的偶联基团的结构，例如偶联化纳米粒子。

本发明中，术语“活化载体”是指含有载体和载体上的可有效固定功能试剂的活化结构者。术语“化学活化载体”，是指活化结构包含通过共价键直接或间接(例如通过偶联基团)键合的活化基团的活化载体。术语“涂料活化非纳米结构载体”，是指活化结构包含固化涂料的活化载体。术语“多活化载体”是指活化结构包含固化涂料和其它活化结构(例如固化涂料之外的有机基团)的活化载体。术语“活化纳米结构载体”，是指这样一种组成，其至少含载体、载体上固定的纳米结构、和纳米结构上固定的活化结构。本发明中：包含定向纳米结构单元的纳米结构载体，简称定向纳米结构载体；不包含定向纳米结构单元的纳米结构载体，简称非定向纳米结构载体。术语“活化非纳米结构载体”，是指含有非纳米结构载体和非纳米结构载体上的可有效固定功能试剂的活化结构的活化载体。

本发明中，术语“空间结构”是指功能试剂与宏观载体之间的空间关系，其至少包括下列组：非纳米结构、定向纳米结构、非定向纳米结构区、等等。

本发明中，术语“功能试剂”，是指为赋予所述纳米结构以反应活性(例如与目标物反应的活性)的试剂。功能试剂通过相互作用(包括亲和作用、离子交换、亲油作用、等等)捕获目标物，其包括配基(相当于英语中的Ligand)、离子交换剂、等等。离子交换剂例如：二乙氨乙基(DEAE)、二乙基-(2-羟丙基)氨乙基(QAE)、羧甲基(CM)、磺酸丙基(SP)、巯乙基吡啶基(MEP)、-NH₂、-RCOOH、硅氧烷基、硫醇基、烷基。配基例如：抗原、抗体、配体、配体指数增强系统进化技术筛选的适配分子、多肽、多糖、共酶、辅因子、抗生素、类固醇、病毒、细胞等。

本发明中，术语“功能化纳米结构”，是指这样一种组成，其含纳米结构和其上固定的功能试剂，例如功能化纳米粒子、功能化纳米凸体、等等。本发明中，术语“功能化纳米结构载体”，是指这样一种组成，其至少含载体和载体上固定的功能化纳米结构(例如功能化纳米粒子、功能化纳米凸体、等等)；术语“片基”是指其具有固定功能的、一面具有宏观平面的常规载体，例如：分析芯片片基、酶标板片基、电泳胶片、平面层析载体等。

本发明中，术语“分析芯片”简称为“芯片”，包括但不限于英语中的Biochip、Microarray、Bioarray，是指定性和/或定量分析中的一种检测装置，其反应器中微量功能试剂同样品中的目标分子发生反应的结果可以以可寻址的方式进行识别；术语“纳米分析芯片”(简称纳米芯片)，是指这样一种分析芯片，其中至少一个反应器为纳米反应器，纳米反应器中至少有一个纳米探针点。在纳米反应器中，可以是全部探针点都是纳米探针点，也可以是部分探针点是纳米探针点。纳米分析芯片上，可以是仅仅纳米探针点具有纳米结构、而其它区域不具有纳米结构(例如在活化常规片基上固定功能化纳米粒子形成者)，也可以是纳米探针点和至少部分其它区域都具有具有纳米结构(例如在活化纳米凸体片基上固定功能化纳米粒子形成者)。本发明当然适于各种芯片，例如单反应池芯片、多反应池芯片、流动芯片、非流动芯片、等等。

本发明中，术语“多肽”相当于英语中的“polypeptide”，包括天然或合成蛋白质、蛋白质片断、合成肽、等等，免疫检测中通常的目标物和检测中通用的配基、例如抗原、抗体、等等都属于多肽；术语“分子标记物质”是指用以形成或参与形成检出信号、并在标记时具有分子形态的物质，例如芯片检测常用标记物中的罗丹明、CY3、CY5等。

如前面“发明内容”部分所述，本发明第一方面，提供包含定向纳米凸体的纳米结构组成。

本发明的第一种纳米结构组成，特征在于其包含至少一个多纳米结构单元反应器，所述反应器含至少一个包含定向排列纳米凸体和至少一种其它纳米结构单元的定向纳米结构功能化区，其中：(1).所述定向纳米结构功能化区至少包含功能试剂和载体上的定向排列纳米凸体；(2).所述定向纳米结构功能化区中，所述定向排列纳米凸体的分布密度大于10个/μm²。

本发明的第二种纳米结构组成，特征在于其包含至少一个多活化结构反应器，所述反应器含至少二个包含不同活化结构的功能化区，且其中至少一个是定向纳米结构功能化区，其中：(1).所述定向纳米结构功能化区至少包含功能试剂和载体上的定向排列纳米凸体；(2).所述定向纳米结构功能化区中，所述定向排列纳米凸体的分布密度大于10个/μm²。

本发明的第三种纳米结构组成，特征在于其包含至少一个多空间结构反应器，所述反应器含至少二个包含不同空间结构的功能化区，且其中至少一个是定向纳米结构功能化区，其中：(1).所述定向纳米结构功能化区至少包含功能试剂和载体上的定向排列纳米凸体；(2).所述定向纳米结构功能化区中，所述定向排列纳米凸体的分布密度大于10个/μm²。

本发明的第四种纳米结构组成，特征在于其包含至少一个高活化结构反应器，所述反应器含至少一个活化基团密度大于2μmol/μm²的定向纳米结构功能化区，其中：(1).所述定向纳米结构功能化区至少包含功能试剂和载体上的定向排列纳米凸体；(2).所述定向纳米结构功能化区中，所述定向排列纳米凸体的分布密度大于10个/μm²。

本发明的第五种纳米结构组成，特征在于其包含至少一个多种类功能化反应器，所述多种类功能化反应器含至少二个包含不同种类功能试剂的功能化区，且其中至少一个是定向纳米结构功能化区，其中：(1).所述定向纳米结构功能化区至少包含功能试剂和载体上的定向排列纳米凸体；(2).所述定向纳米结构功能化区中，所述定向排列纳米凸体的分布密度大于10个/μm²。

本发明的第六种纳米结构组成，特征在于其包含至少一个多纳米结构试剂盒，所述多纳米结构试剂盒含至少一个含定向纳米结构功能化区的反应器，和至少一种其它纳米结构反应物，其中：(1).所述定向纳米结构功能化区至少包含功能试剂和载体上的定向排列纳米凸体；(2).所述定向纳米结构功能化区中，所述定向排列纳米凸体的分布密度大于10个/μm²。

本发明的第七种纳米结构组成，特征在于其具有至少二种上述本发明的各纳米结构组成的特征。

本发明的第一或第七种纳米结构组成的一项方案，所述纳米结构组成中，所述多纳米结构单元反应器含下述之一种或多种纳米结构单元组合：A.定向排列纳米凸体和定向排列纳米凸体上固定的功能化纳米粒子；B.定向排列纳米凸体上固定的纳米粒子和纳米粒子上固定的功能化纳米粒子；C.定向排列纳米凸体上固定的纳米粒子和纳米粒子上固定的功能化试剂。另一项方案，其中所述功能化纳米粒子在所述定向多纳米结构功能化区中的分布密度大于50个/μm²。另一项方案，其中所述功能化纳米粒子在所述定向多纳米结构功能化区中的分布密度大于100个/μm²。根据纳米粒子大小、功能试剂种类和捕获物种类不同，功能化纳米粒子在所述定向多纳米结构功能化区中的分布密度有不同优选的上限。

本发明的第二或第七种纳米结构组成的一项方案，所述纳米结构组成中所述多活化结构反应器含下述活化结构组合：疏水涂料和共价键活化基团。另一项方案，其中所述疏水涂料的表面疏水角大于60度。另一项方案，其中所述表面疏水角在80-100度之间。另一项方案，其中所述活化基团包括下述一种或多种基团：氨基酸基、合成肽基、氨基、醛基、环氧基、氨基肼、羧甲基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硫醇基。

本发明的第三或第七种纳米结构组成的一项方案，所述纳米结构组成中所述多空间结构反应器含下述之一种或多种功能化区组合：A.功能化非纳米结构区和所述功能化定向纳米结构区；B.功能化非定向纳米结构区和所述功能化定向纳米结构区；C.功能化非纳米结构区、功能化非定向纳米结构区和所述功能化定向纳米结构区。

本发明的第五或第七种纳米结构组成的一项方案，所述纳米结构组成中所述多种类功能化反应器含下述功能试剂组合：抗原和抗体。另一项方案，其中所述抗体在所述定向纳米结构功能化区中，而抗体在其它活化区中。另一项方案，其中所述抗体包括乙肝病毒表面抗体。另一项方案，其中所述抗原包括丙肝病毒抗原或/和爱滋病毒抗原。

本发明的第六或第七种纳米结构组成的一项方案，所述纳米结构组成中所述多纳米结构试剂盒中，所述其它纳米结构反应物包括纳米分离物或/和纳米标记物。

本发明的第一至第七种纳米结构组成的一项方案，其中所述定向排列纳米凸体的分布密度大于50个/μm²。根据定向排列纳米凸体大小、复合纳米粒子大小、功能试剂种类和捕获物种类不同，此一分布密度有不同优选的上限。在以下实施例中，个别纳米结构组成所述平均分布密度达到100个/μm²。

本发明的第一至第七种纳米结构组成的一项方案，其中所述纳米凸体包括纳米线、纳米管、纳米锥。

本发明的第一至第七种纳米结构组成的一项方案，其中所述功能试剂包括生物物质。另一项方案，其中所述生物物质包括多肽和核酸。

本发明的第一至第七种纳米结构组成的一项方案，其中所述纳米结构组成包括下述组之一：生物芯片、酶标反应器、分析传感器。另一项方案，其中所述纳米结构组成包括下述组之一：生物芯片试剂盒、酶标反应器试剂盒、分析传感器试剂盒。

在根据本发明第二方面的方法中，其包括提供和应用本发明第一方面的纳米结构组成的步骤。

实施例

以下实施例中，所用功能试剂包括：多肽、抗原、抗体、及其它功能试剂。其中：所用合成多肽包括EBV-VCA-P18抗原(简称EBV抗原；自制，制备方法参考Tranchand-Bunel，D.，Auriault，C.，Diesis，E.，Gras-Masse，H.(1998)Detection of human antibodies using“convergent”combinatorial peptide libraries or“mixotopes”designed form anonvariable antigen：Application to the EBV viral capsid antigen p18，J.Peptide Res.52，1998，495-508)；所用抗原包括：丙肝病毒抗原(HCVAg)，爱滋病毒抗原(HIVAg)，梅毒抗原(均为北京大学人民医院肝病研究所提供)；所用抗体包括抗乙肝病毒表面抗体(HBs Ab，北京大学人民医院肝病研究所提供)和单克隆或多克隆羊抗人二抗(北京生物制品研究所)；所用其它功能试剂包括蛋白质A(上海生物制品研究所)。本实施例的方法也适于其它功能试剂，例如：药物、多糖、维生素、抗生素、生物素、亲和素、功能有机物、单链或多链DNA、RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。

第一部分活化载体和功能化纳米粒子的制备

以下实施例中，所用以下试剂可在市场上购得：

1).涂料：所用涂料选自耐水涂料。耐水涂料选自元素有机漆、优选透明或半透明的元素有机漆。元素有机漆选自含有机硅的聚合物，例如含有机硅的缩合共聚物或/和接枝共聚物的高分子疏水涂料。有机硅单体的例子包括：二甲基硅氧烷、甲基丙烯酸3-(甲基甲硅烷)、含(甲基丙烯酸酰氧)丙基终端的二甲基硅氧烷。3-氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷、等等，也可以适当方式作为合成原料。更具体而言，所用涂料选自以下含有机硅的聚合物组：有机硅树脂A、有机硅树脂B、有机硅树脂GRT-350(均由晨光化工设计院有机硅中心提供)。三种含有机硅的聚合物均为有机硅树脂涂料，有机硅树脂的平均分子量都大于10000、甚至大于30000。按供货方的说明：有机硅树脂A为基于二甲基硅氧烷和甲基丙烯酸3-(甲基甲硅烷基)共聚物的硅氧烷接枝共聚物涂料；有机硅树脂B为基于含(甲基丙烯酸酰氧)丙基终端的二甲基硅氧烷和甲基丙烯酸类单体的硅氧烷接枝共聚物涂料；有机硅树脂GRT-350为以有机硅单体(硅氧烷醇类)为主要原料经水解缩合制得的有机硅树脂。可见，所述活化结构包括固化的涂料涂层。

2).偶联剂：所用偶联剂包括有机硅偶联剂，例如硅烷偶联剂，包括：3-氨丙基三甲氧基硅烷(国泰华荣化工新材料公司)、氨丙基三乙氧基硅烷(国泰华荣化工新材料公司)、3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷(华盛化学有限公司)。

3).活化剂：所用活化剂，包括可至少提供与偶联基团结合的部分活化基团的基础活化剂、和提供基础活化基团上的衍生基团的衍生活化剂(或第二活化剂)。所用基础活化剂为含氨基的硅氧烷、氨基肼(NH₃NH₃)、和氨基酸。氨基酸包括：精氨酸、天冬酰氨、谷氨酰氨、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺。以下实施例中，优选含有肽合成保护基团(例如Fmoc)的活化剂，例如Fmoc-氨基肼和Fmoc-氨基酸。Fmoc氨基肼由成都凯泰新技术有限责任公司提供，氨基酸或Fmoc-氨基酸由成都泰格化工研究所提供。含其它保护基团(例如Boc-、CBZ-、等等)的肽合成试剂，也可用于以下相应实施例的方法。所用衍生活化剂包括不含氨基的多官能团试剂(例如戊二醛、1，4-丁二醇二缩水甘油醚)。

4).纳米结构单元：所用纳米结构单元包括含氧化硅的纳米线基片上的纳米线。所用定向排列的纳米线基片，购自美国Immuna公司(线径80nm，线长400nm-3μm，纳米线在载体上的平均分布密度约50-100纳米线/μm²)。为节约用量，根据实验条件将其切割至较小尺寸。以下实施例中，所用纳米结构单元可以是任何可形成纳米结构的、本身三维中至少一维具有纳米尺寸的结构单元。定向排列的其它形状的纳米结构单元(例如纳米凸体、纳米锥、纳米管、等等)，以及其它材质的纳米结构单元(例如，含有机物或无机物的纳米结构单元)，也可选用于下实施例的方法，制备本发明的纳米结构组成。所述无机物包括无机氧化物、金属(例如金、银)、等等。所述无机氧化物包括金属氧化物。

5).纳米粒子：以下实施例中，所用纳米粒子包括：硅氧化物纳米粒子(氧化硅纳米粒子LUDOXAS-40，粒子平均尺寸25nm，比表面积约135m²/g，Sigma-Aldrich公司)，铝氧化物纳米粒子(MC2R γ-相纳米氧化铝，粒子平均尺寸60nm，比表面积140m²/g，浙江弘晟材料科技股份有限公司)，钛氧化物纳米粒子(氧化钛纳米粒子，粒子平均尺寸＜80nm，比表面积120m²/g，浙江舟山明日纳米材料有限公司)。以下实施例中，所用纳米粒子，还可以是任何其它可固定所述活化结构用以固定功能试剂的纳米粒子，例如含有机物或无机物的纳米粒子。其中，所述含无机物的纳米粒子包括非磁性无机纳米粒子和磁性无机纳米粒子，所述非磁性无机纳米粒子包括非磁性金属纳米粒子和非磁性非金属纳米粒子，所述衍生物包括结合有活化基团或/和包被有机物的衍生物。其中，所述无机非磁性非金属纳米粒子包括金属氧化物(例如，氧化硅粒子、氧化钛粒子、氧化铝粒子)；所述非磁性金属纳米粒子包括金粒子、钒粒子、铅粒子。以下实施例中，优选使用粒径比定向纳米凸体截面直径更小的纳米粒子，更优选使用粒径比定向纳米凸体截面直径小50％以上的纳米粒子。

以下实施例制备的各种偶联化纳米粒子或偶联化定向纳米结构载体，其偶联基团选自：3-氨丙基三甲氧基硅烷基、氨丙基三乙氧基硅烷基、3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷基。以下实施例制备的各种化学活化纳米粒子或化学活化定向纳米结构载体，其活化基团包括氨基、氨基肼基、氨基酸基、等等。当然，本发明中，活化载体上的活化基团也可选自下述一种或多种基团组：醛基、环氧基、羧甲基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硫醇基。

实施例1：活化纳米粒子的制备方法

本发明实施例中，以所用含金属氧化物的纳米粒子为例，活化纳米粒子的制备方法，包括：

1).偶联化：将纳米粒子与偶联剂溶液混合，并进行偶联反应。其反应条件如下：纳米粒子浓度(w/v)1‰-2％；偶联剂浓度(v/v)1-3％；反应介质为含水的醇；反应温度在室温至反应介质沸点以下5℃之间；反应时间0.5-5小时。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需优化条件。先对纳米粒子进行表面处理(例如去离子处理)，可提高偶联反应效率。

2).活化：将上述偶联化纳米粒子与活化剂溶液混合，并进行活化反应。反应条件如下：纳米粒子的浓度(w/v)1‰-2％；活化剂浓度(v/v)在0.5-5％；反应温度在室温至反应介质沸点以下5℃之间；反应时间0.5-15小时；反应介质为DMF。若有必要，可在加入偶联剂前对纳米粒子进行纯化(例如离子交换钝化)。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。若活化剂含保护基团(例如Fmoc)，还要脱去这些保护基团。脱保护方法选自已知的肽合成方法中的脱保护方法。

其中，使用高速离心机分离出在制的纳米粒子。

本发明中，以偶联基团/纳米粒子来表示偶联化纳米粒子，以主要活化基团/偶联化纳米粒子来表示活化纳米粒子。本发明实施例的制备物中：偶联基团为如前述的硅烷偶联基团；纳米粒子包括为如前述的含金属氧化物的纳米粒子；主要活化基团为前述氨基肼基、氨基酸基、合成肽基、或它们各自的衍生物。

本实施例中，所得活化纳米粒子通过元素分析计算活化基团或/和偶联基团在1m²纳米粒子表面上的分布密度。以下实施例中，优选使用具以下特征的活化纳米粒子：1m²纳米粒子表面上固定的偶联基团大于1.85μmol、优选大于2.0μmol、更优选大于2.50μmol，或/和1m²纳米粒子表面上固定的活化基团大于0.5μmol、优选大于1μmol、更优选大于1.5μmol。

实施例2：功能化纳米粒子的制备

本实施例中，功能化纳米粒子的制备方法，包括将功能试剂固定在活化纳米粒子上。固定化反应条件如下：活化纳米粒子浓度(w/v)0.01-3％；功能试剂浓度(w/v)0.1-3.0mg/ml；缓冲液pH5.0-9.5；反应温度20-37℃；反应时间0.5-72小时。通过调节这些参数可获得所需的优化条件。必要时还包括功能化纳米粒子的纯化、或/和钝化。常用钝化剂包括蛋白质和氨基酸。

本发明中，以功能试剂/活化纳米粒子来表示功能化纳米粒子。本实施例制备的功能化纳米粒子包括：抗原/活化纳米粒子、抗体/活化纳米粒子、其它功能试剂/活化纳米粒子。其中：抗原、抗体、其它功能试剂均如上所述；活化纳米粒子选自实施例1制备的活化纳米粒子。表1列出本实施例制备的部分功能化纳米粒子例子。

本发明中，以标记物质/活化纳米粒子/功能试剂为记号来表示纳米标记物。本实施例中，所用活化纳米粒子选自实施例1制备的活化纳米粒子；所用功能试剂包括二抗，和所用抗原、抗体的对应抗原、抗体(配对购买，供双抗原夹心法、双抗体夹心法使用)；所用标记物质包括：荧光物质(例如罗丹明、CY3、CY4)，标记酶(例如辣根过氧化物酶)，染色剂(例如结晶紫)。本实施例的方法也适于其它标记物质，例如化学发光物质、化学发光催化剂、有色金属盐、染料和颜料。

本实施例中，纳米标记物的制备包括两种方法：A).将标记物质固定在功能化纳米粒子上再进行纯化；B).将标记物质固定在功能试剂上，再将纯化的标记物质/功能试剂复合物固定在活化纳米粒子上。所用标记方法和纯化方法，基本上采用公知的制备常规标记物的标记方法和纯化方法。纯化条件可参考公知的常规标记物制备方法中标记物的纯化方法(例如过滤法、层析法、等等)，但优选的方法中包括离心法。标记方法优选的条件包括一个长得多的反应时间(例如大于12小时)。表1列出本实施例制备的部分纳米标记物。

表1

代号               功能化纳米粒子  其它组成    功能试剂    活化纳米粒子1).功能化纳米粒子A1HCVAg精氨酸基/偶联化纳米粒子无A2HIVAg同上无A3梅毒抗原同上无A4HBsAb同上无A5羊抗人二抗同上无A6蛋白质A同上无A7EBV抗原同上无2).纳米标记物A8HCVAg精氨酸基/偶联化纳米粒子罗丹明A9HIVAg同上同上A10HBsAb同上同上A11羊抗人二抗同上同上

实施例3活化定向纳米结构载体的制备

本发明实施例中，活化定向纳米结构载体的制备方法，可用以制备芯片活化纳米结构片基、纳米酶标多孔板活化纳米结构片基、生物传感器活化纳米结构片基、等等。以下实施例中：所用偶联剂和活化剂如前所述；所用偶联化纳米粒子和活化纳米粒子为实施例1制备的偶联化纳米粒子和活化纳米粒子；制备物中的偶联基团为前述偶联基团；制备物中的活化基团为前述活化基团，例如氨基、氨基肼基、各种氨基酸基、等等。以下实施例作进一步的补充。

实施例3.1化学活化定向纳米结构载体的制备

本实施例的方法，制备了以下第一种至第五种活化定向纳米结构载体(见表2)：

1).第一种活化定向纳米结构载体，其组成包含：固相载体、固相载体上定向排列的纳米结构单元、纳米结构单元上固定的偶联化基团、和偶联化基团上固定的活化基团或活化纳米粒子。其制备方法包括：先对定向纳米结构载体进行偶联化，再对偶联化定向纳米结构载体进行引入固定活化基团或/和活化纳米粒子的活化。

2).第二种活化定向纳米结构载体，其组成包含：固相载体、固相载体上定向排列的纳米结构单元、纳米结构单元上固定的偶联化纳米粒子、和偶联化纳米粒子上固定的活化基团或/和活化纳米粒子。其制备方法包括：对定向纳米结构载体通过包被偶联化纳米粒子固定偶联化基团，再对偶联化定向纳米结构载体进行引入固定活化基团或/和活化纳米粒子的活化。

3).第三种活化定向纳米结构载体，其组成包含：固相载体、固相载体上定向排列的纳米结构单元、纳米结构单元上固定的纳米粒子、纳米粒子上固定的偶联化基团、和偶联化基团上固定的活化基团或活化纳米粒子。其制备方法包括：对定向纳米结构载体包被纳米粒子，然后进行偶联化，再对偶联化定向纳米结构载体进行引入固定活化基团或/和活化纳米粒子的活化。

4).第四种活化定向纳米结构载体，其组成包含：固相载体、固相载体上定向排列的纳米结构单元、纳米结构单元上固定的活化纳米粒子。其制备方法包括：对定向纳米结构载体包被活化纳米粒子。

5).第五种活化定向纳米结构载体，其组成包含：固相载体、固相载体上定向排列的活化纳米结构单元、活化纳米结构单元上固定的活化纳米粒子。其制备方法包括：对活化定向纳米结构载体(例如第一种活化定向纳米结构载体)包被活化纳米粒子。

其中：固相载体的例子包括：玻片、含金属或半导体膜的玻片、金属片、半导体片、等等；纳米结构单元的例子包括：纳米线、纳米锥、纳米管、等等。上述各制备方法中，关键步骤的反应条件如下：

(1).偶联化、活化：分别参考实施例1中的偶联化、活化方法。

(2).纳米粒子、偶联化纳米粒子、或活化纳米粒子包被：纳米粒子悬浮液中的纳米粒子浓度(w/v浓度)1/1000至1/50000之间；包被温度10-30℃之间；包被时间5小时以上。

(3).活化纳米结构单元上活化纳米粒子的包被，筒述如下：将上述纳米线基片进行活化(例如上述活化)，使其具有活性基团1(例如含-COOH的氨基酸基)；选择具有可与活性基团1反应的活性基团2(例如含-NH₂的氨基酸基)的活化纳米粒子；使活性基团1和活性基团2在优化的条件下(例如活化纳米粒子w/v浓度在1/100至1/10000之间)反应，从而将活化纳米粒子包被至纳米结构载体上。

实施例3.2涂料活化定向纳米结构载体的制备

本发明的第六种活化定向纳米结构载体(见表2)，为涂料活化定向纳米结构载体。其制备方法包括：将洁净的定向纳米结构载体与高分子疏水涂料溶液接触并进行包被，然后对包被物进行固化。其中，包被条件包括：高分子疏水涂料w/v浓度在1/10000至1/100000之间，温度在10-30℃之间，时间在0.5-10小时之间；固化条件包括：温度在40-80℃之间，时间在3-10小时之间。通过调节这些反应条件范围，可获得所需的优化条件。其中所述涂料包括上述涂料。

实施例3.3多活化定向纳米结构载体的制备

本发明的第七种活化定向纳米结构载体(见表2)，为多活化定向纳米结构载体，其中所述活化结构含至少2种活化材料。本实施例的制备物，其表面上分别存在一个或多个涂料活化区域和化学活化区域。其中：所述涂料包括上述涂料；所述化学活化定向纳米结构载体选自实施例3.1的制备物。含其它活化基团(例如氨基、醛基、环氧基、等等)的化学活化定向纳米结构载体，也可用于上述方法制备多活化纳米结构载体。

本实施例中的一种制备方法，其至少包括：1).制备化学活化定向纳米结构载体；2).将适当涂料溶液涂至定向纳米结构载体上的部分区域内并进行包被，然后对包被物进行固化。包被条件和固化条件，与实施例3.1相同。

实施例3.4活化纳米粒子/涂料包被定向纳米结构载体的制备方法

本发明的第八种活化定向纳米结构载体，为活化纳米粒子固定在涂料包被定向纳米结构载体上形成的活化载体。本实施例的一种制备方法，至少包括在实施例3.2制备的涂料活化定向纳米结构载体上，包被活化纳米粒子。包被条件包括：活化纳米粒子w/v浓度在1/1000至1/100000之间；温度在10-30℃之间；时间在10-48小时之间；包被介质为水溶液。通过调节这些反应条件范围，可获得所需的优化条件。其中，活化纳米粒子选自实施例1制备的活化纳米粒子，但也可使用可固定在涂料层上的其它活化纳米粒子。

表2

代号    种    类     定向纳米结构载体                 活化结构    纳米凸体    其它    连接材料    活化材料B1    1    纳米线    偶联化基团    活化基团B2    1    纳米线    偶联化基团    活化纳米粒子B3    2    纳米线    偶联化纳米粒子    活化基团B4    2    纳米线    偶联化纳米粒子    活化纳米粒子B5    3    纳米线    纳米粒子    偶联化基团    活化基团B6    3    纳米线    纳米粒子    偶联化基团    活化纳米粒子B7    4    纳米线    活化纳米粒子B8    5    纳米线    活化基团1    活化纳米粒子2B9    5    纳米线    活化纳米粒子1    活化纳米粒子2

B10 6纳米线涂料B11 7纳米线涂料和活化基团B12 7纳米线涂料和活化纳米粒子B13 8纳米线涂料活化纳米粒子

第二部分纳米结构组成的制备

本发明实施例中，纳米结构组成(例如纳米芯片、纳米酶标反应器、生物传感器、等等)的制备中所用步骤，原则上与相应非纳米结构装置的制备步骤并无本质的不同，都是通过点样或包被，来将探针固定在活化载体上。本发明实施例中，探针包括功能试剂或/和功能化纳米粒子。例如，纳米芯片的制备中，包括用适当的现有手工或机械点样方法，将每种探针点3个样在活化载体上。其中，固定化反应条件如下：功能试剂浓度0.1-2mg/ml；功能化纳米粒子浓度(w/v)0.01-3％；缓冲液pH5.0-9.5；反应温度20-37℃；反应时间0.5-72小时。通过调节这些参数可获得所需的优化条件。必要时还包括纳米结构装置的钝化。常用钝化剂包括蛋白质和氨基酸。须要说明的是，以下各实施例制备的纳米结构组成、尤其是纳米芯片中，并不必要求所有功能化区(例如探针点)均为功能化纳米结构区(例如纳米探针点)，也可含功能化非纳米结构区(例如非纳米探针点)。同样的反应条件，还可用以制备含功能化定向纳米结构载体的纳米酶标反应器、生物传感器、等等。

以下实施例中：所用定向纳米结构载体选自实施例3制备的活化定向纳米结构载体；所用功能化纳米粒子选自实施例2制备的功能化纳米粒子。当然，其它定向纳米结构载体、功能试剂或功能化纳米粒子也可分别用以下实施例的方法制备纳米结构组成。以下实施例制备的纳米结构装置(例如生物芯片)，其纳米结构探针点上功能化纳米粒子的平均分布密度，利用SPA-300HV型扫描探针显微镜及分析软件测定。以下实施例制备的纳米结构组成的功能化定向纳米结构区中，功能化纳米粒子平均分布密度，优选大于50个/μm²、更优选大于100个/μm²。

以下实施例对上述制备方法作进一步的说明。

实施例4.第一种纳米结构组成的制备

本实施例中，定向多纳米结构单元功能化区(例如，纳米芯片上的多纳米结构单元探针点)的制备，包括将功能化纳米粒子或功能试剂在活化定向纳米结构载体上进行固定化反应。固定化反应条件如前所述。其中，所用功能化纳米粒子和活化定向纳米结构载体，选自以上实施例的制备物。表3列出本实施例制备的部分纳米芯片例子。

本实施例制备的第一种多纳米结构单元反应器，其含定向排列纳米凸体和定向排列纳米凸体上固定的功能化纳米粒子。例如，表3中的C1-C4。其中，定向多纳米结构单元功能化区，为在活化定向纳米结构载体上固定功能化纳米粒子而形成。所用活化定向纳米结构载体包含定向纳米结构载体和活化结构(例如表2中的B1或B10)。

本实施例制备的第二种多纳米结构单元反应器，其含定向排列纳米凸体上固定的纳米粒子和纳米粒子上固定的功能化纳米粒子。例如，表3中的C5-C8。其中，定向多纳米结构单元功能化区为在活化定向纳米结构载体上固定功能化纳米粒子而形成。所用活化定向纳米结构载体包含定向纳米结构载体、纳米粒子和活化结构(例如表2中的B2-B9之一或B13)。

本实施例制备的第三种多纳米结构单元反应器，其含定向排列纳米凸体上固定的纳米粒子和纳米粒子上固定的功能化试剂例如，表3中的C9-C12。其中，定向多纳米结构单元功能化区为在活化定向纳米结构载体上固定功能试剂而形成。所用活化定向纳米结构载体包含定向纳米结构载体、纳米粒子和活化结构(例如表2中的B2-B9之一或B13)。

表3

代号    类    型    探针^*    活化载体^**C1    1    A1、A2、A3    B1或B10C2    1    A1、A2、A3、A7    B1C3    1    A1、A2、A3、A4    B1C4    1    A1、A2、A4、A6、A7    B1C5    2    A1、A2、A3    B2-B9之一或B13C6    2    A1、A2、A3、A4    B2-B9之一或B13C7    2    A1、A2、A4、A7    B2-B9之一或B13C8    2    A1、A2、A4、A6、A7    B2-B9之一或B13

 C9 3 HCVAg、HIVAg、梅毒抗原B2-B9之一或B12 C10 3 HCVAg、HIVAg、梅毒抗原、HBsAbB2-B9之一或B13 C11 3 HCVAg、HIVAg、梅毒抗原、HBs Ab、EBV抗原B2-B9之一或B13 C12 3 HCVAg、HIVAg、梅毒抗原、HBsAb、蛋白质A、EBV-VCA-P18抗原B2-B9之一或B13

^*：参考表1；^**：参考表2

实施例5.第二种纳米结构组成的制备

本实施例中，多活化结构反应器(例如微阵列芯片)的制备，包括将二种或二种以上功能化纳米粒子或功能试剂，固定在多活化定向纳米结构载体上。固定化反应条件如前所述。其中：所用多活化定向纳米结构载体为上述第七种活化定向纳米结构载体，选自实施例3.3(例如表2中的B11或B12)；所用功能化纳米粒子选自实施例1的制备物(例如表1中的A1-A7)。本发明实施例中，一个优选的点样方案为：抗体探针固定在含有机硅包被的活化区，而抗原探针固定在含活化基团的活化区。

实施例6.第三种纳米结构组成的制备

本发明实施例中，多空间结构反应器(例如，纳米芯片上的一个纳米反应器)的制备，包括将功能化纳米粒子或/和功能试剂，固定在活化多空间结构载体上。固定化反应条件如前所述。其中：所用功能化纳米粒子选自以上实施例的制备物(例如表1中的A1-A7)；所用活化多空间结构载体，包含分布有定向纳米凸体的活化纳米结构区和未分布有有意义的纳米凸体的活化非纳米结构区。例如，利用前述实施例中活化定向纳米结构载体的制备方法，对一个既含定向纳米结构区又含非纳米结构区的载体进行涂料包被，既可获此活化多空间结构载体。利用优选的化学活化方法，也可获此活化多空间结构载体。表4列出本实施例制备的部分纳米芯片例子。

本实施例制备的第一种多空间结构反应器，其含至少一个功能化非纳米结构区和至少一个所述功能化定向纳米结构区，为在活化多空间结构载体上固定功能试剂而形成。例如，表4中的D1-D4。本实施例优选的方案之一，是在活化定向纳米结构区中固定用于双抗体(或双抗原)夹心法的探针，而在活化非纳米结构区中固定用于间接法的探针。

本实施例制备的第二种多空间结构反应器，其含至少一个功能化非定向纳米结构区和至少一个所述功能化定向纳米结构区，为在活化多空间结构载体上固定功能化纳米粒子而形成。例如，表4中的D5-D8。本实施例优选的方案之一，是在活化定向纳米结构区中固定用于双抗体(或双抗原)夹心法的功能化纳米粒子探针，而在活化非纳米结构区中固定用于间接法的功能化纳米粒子探针。

本实施例制备的第三种多空间结构反应器，其含至少一个功能化非纳米结构区、至少一个功能化非定向纳米结构区和至少一个所述功能化定向纳米结构区，为在活化多空间结构载体上固定功能试剂和功能化纳米粒子而形成。例如，表4中的D9-D12。本实施例化选的方案之一，是在活化定向纳米结构区中固定用于双抗体(或双抗原)夹心法的功能化纳米粒子探针，而在活化非纳米结构区中固定用于间接法的功能化纳米粒子探针和功能试剂探针。

表4

代号  类  型  活化定向纳米结  构区中固定的探  针    活化非纳米结构区中固定的探针  第一种第二种D1  1  HCVAg、HIVAg  HCVAg、HIVAg-D2  1  HCVAg、HIVAg  梅毒抗原-D3  1  HBsAb  HCVAg、HIVAg、  梅毒抗原-D4  1  HBsAb  HCVAg、HIVAg、  梅毒抗原、EBV抗  原-D5  2  A1、A2  A1、A2D6  2  A1、A2  A3D7  2  A4  A1、A2、A3D8  2  A4  A1、A2、A3、A7D9  3  A1、A2  A1、A2HCVAg、HIVAgD10  3  A1、A2  A3HCVAg、HIVAgD11  3  A4  A1、A2、A3HCVAg、HIVAgD12  3  A4  A1、A2、A3EBV-抗原

^*：探针代号参考表1

实施例7.第四种纳米结构组成的制备

本实施例中，高活化结构反应器中，定向纳米结构功能化区含密度大于0.5μmol/μm²的活化基团，为在含活化纳米粒子的活化定向纳米结构载体上，固定功能试剂或/和功能化纳米粒子而形成。所用含活化纳米粒子的活化定向纳米结构载体，选自上述实施例的制备物。其中，活化纳米粒子具有下述特征：1m²纳米粒子表面上固定的活化基团大于0.5μmol、优选大于1μmol、更优选大于1.5μmol。实际上，在不含活化纳米粒子的活化定向纳米结构载体上，也应当有这么一个活化基团密度，小于这个密度时，定向纳米结构功能化区的灵敏度的提高，明显不如大于这个密度时的提高。

实施例8.第五种纳米结构组成的制备

本实施例中，多种类功能化反应器所含至少二种功能试剂，可以是下列之一的组合：核酸和多肽、细胞和多肽、抗原和抗体、等等。其制备方法，包括将探针抗原和探针抗体固定在活化定向纳米结构载体上。固定化反应条件如前所述。其中所用活化定向纳米结构载体，选自前述实施例中制备的活化定向纳米结构载体(例如表2中的B1-B12)。其中所用探针抗原和探针抗体组合包括：A.包含乙肝病毒表面抗体和丙肝病毒抗原；B.包含乙肝病毒表面抗体、丙肝病毒抗原、和爱滋病毒抗原；C.包含乙肝病毒表面抗体、丙肝病毒抗原、爱滋病毒抗原、和肿瘤标记物抗原。探针抗原包括抗原或/和抗原包被纳米粒子。探针抗体包括抗体或/和抗体包被纳米粒子。例如，表3及表4中的某些纳米芯片反应器。此外，该组成配套的标记物，不应与任何探针或目标物发生非特异的抗原-抗体反应。优选的标记物为以下标记物组合之一：A、特异性标记抗体和特异性标记抗原；B、不同结构特异性标记抗抗体；C、种属特异性标记抗抗体和特异性标记抗体或/和特异性标记抗原；D、结构特异性标记抗抗体和特异性标记抗体或/和特异性标记抗原；E、基于上述组合的各种衍生组合

实施例9.第六种纳米结构组成的制备

本发明的第六种纳米结构组成，其特征为，含至少一个多纳米结构试剂盒。本发明实施例中，所制备的纳米结构的组合包括：A.第一种纳米结构组合，含至少一个含定向纳米结构功能化区的反应器和至少一种纳米标记物；B.第二种纳米结构组合，含至少一个含定向纳米结构功能化区的反应器和至少一种纳米分离物；C.第三种纳米结构组合，含至少一个含定向纳米结构功能化区的反应器、至少一种纳米标记物、和至少一种纳米分离物。本发明实施例中：所用含至少一个含定向纳米结构功能化区的反应器、纳米标记物、纳米分离物，均选自本发明上述实施例的制备物。

实施例10.第七种纳米结构组成的制备

本实施例制备的第七种纳米结构组成，包含下述组之一：A、至少一个多纳米结构单元/多活化结构反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同活化结构、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区；B、至少一个多纳米结构单元/多空间结构反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同空间结构、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区；C、至少一个多纳米结构单元/多种类功能化反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同种类功能试剂、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区；D、至少一个多纳米结构单元反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物；E、至少一个多活化结构/多空间结构反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同空间结构、至少二个功能化区包含不同活化结构；F、至少一个多活化结构/多种类功能化反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同种类功能试剂、至少二个功能化区包含不同活化结构；G、至少一个多活化结构反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物；H、至少一个多空间结构/多种类功能化反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同种类功能试剂、至少二个功能化区包含不同空间结构；I、至少一个多空间结构反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物；J、至少一个多种类功能化反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物；K、至少一个多纳米结构单元/多活化结构/多空间结构反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同空间结构、至少二个功能化区包含不同活化结构、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区；L、至少一个多纳米结构单元/多活化结构/多种类功能化反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同种类功能试剂、至少二个功能化区包含不同活化结构、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区；M、至少一个多纳米结构单元/多活化结构反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同活化结构、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区；N、至少一个多活化结构/多空间结构/多种类功能化反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同种类功能试剂、至少二个功能化区包含不同空间结构、至少二个功能化区包含不同活化结构；O、至少一个多活化结构/多空间结构反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同空间结构、至少二个功能化区包含不同活化结构；P、至少一个多空间结构/多种类功能化反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同种类功能试剂、至少二个功能化区包含不同空间结构；Q、至少一个多纳米结构单元/多活化结构/多空间结构/多种类功能化反应器，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同种类功能试剂、至少二个功能化区包含不同空间结构、至少二个功能化区包含不同活化结构、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区；S、至少一个多纳米结构单元/多活化结构/多空间结构反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同空间结构、至少二个功能化区包含不同活化结构、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区；T、至少一个多纳米结构单元/多活化结构/多空间结构/多种类功能化反应器和至少一种纳米分离物或/和纳米标记物，该反应器含至少二个功能化区，其中：至少二个功能化区包含不同种类功能试剂、至少二个功能化区包含不同空间结构、至少二个功能化区包含不同活化结构、和至少一个功能化区是定向多纳米结构单元功能化区。

本实施例制备的反应器，均含至少二个功能化区。本实施例中，有不同功能化区的反应器的制备方法，分别参考上述各实施例中相应反应器的制备方法。

第三部分纳米结构组成的应用

以下实施例中，样品分别为：HCV抗体阳性血清，HIV₁₊₂抗体阳性人血清，HBSAg阳性血清，EBV抗体阳性血清，梅毒抗体阳性血清，和阴性血清(HCV抗体、HIV₁₊₂抗体、HBsAg和梅毒抗体都为阴性的血清)。所有的样品均经使用经典的ELISA方法在血清10倍稀释反应条件下预先检测。以下实施例中，所用活化玻片为根据已知方法自制的活化玻片。

本发明的纳米结构组成(装置或试剂盒)，可以按公知的相应装置或试剂盒的应用方法去应用。例如，芯片测试方法如下：(1).非流动芯片的测试：将适当稀释的测试样品5μl分别加入相应芯片的反应池中，37℃反应30分钟后用洗涤液冲洗，再加入5μl适当浓度的标记物，在37℃反应30分钟后用洗涤液冲洗，然后干燥再进行扫描。扫描仪为共聚焦激光扫描仪(Afymetrix公司GMS 418芯片扫描仪)，扫描激发光波长532nm，发射光波长570nm，激光强度35/50-55/70，读取的信号经处理软件(JAGUARII)处理，然后取平均值后得到结果。(2).流动芯片的测试：将适当稀释的测试样品加热至37℃，以流速10-50μl/min加入芯片反应器，加样时间60分钟，然后加入洗液洗涤，再加入5-10μl适当浓度的标记物进行标记，最后洗涤、干燥，再按与非流动芯片的测试相同的方法进行扫描。本发明实施例中，阳性样品的可测最低限度，通过阳性样品稀释至判定阴、阳性的临界浓度来表示。以下实施例中，除非特别说明处(例如实施例15和16)，芯片测试时使用的标记物为常规标记物，例如：罗丹明标记二抗、罗丹明标记对应抗原、罗丹明标记对应抗体、罗丹明标记对应抗原和对应抗体。

以下实施例中，以纳米芯片的比较为例，给出一些对比研究来加以进一步的说明。

实施例10：本发明的第一种纳米结构组成的应用

本实施例中，所用芯片分别为：选自实施例4(例如表3)制备的第一种、第二种、第三种多纳米结构单元反应器；和含单纳米结构单元反应器的对照芯片1和对照芯片2。其中：对照芯片1含定向排列纳米凸体和定向排列纳米凸体上固定的功能试剂，为使用相同活化定向纳米结构载体、使用相同功能试剂在相同点样条件下所制备；对照芯片2含活化玻片上非定向排列的功能化纳米粒子，为使用有相同活化结构的活化玻片、使用含相同功能试剂的功能化纳米粒子、在相同点样条件下所制备。

本实施例中，本发明的纳米结构芯片与各对照芯片比较：1).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-0.2mg/ml)下，使用相同阳性样品时在相同扫描条件下的平均信号读数高50％以上。2).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-1.0mg/ml)下，可检出的阳性样品最低浓度分别要低1倍以上。这说明，本发明的优选的纳米结构单元的复合，具有明显提高反应灵敏度的作用。其它本发明的第一种纳米结构组成(例如纳米酶标板A20、纳米传感器)，也应当有与本发明的纳米结构芯片相同的结果。

实施例11：本发明的第二种纳米结构组成的应用

本实施例中，所用芯片分别为：选自实施例5制备的含多活化结构反应器的芯片和对照芯片。其中，对照芯片含单活化结构反应器，其活化结构为与多活化结构反应器的芯片中相同的活化基团，为使用相同功能试剂在相同点样条件下所制备。

本实施例中，本发明的纳米结构芯片与对照芯片比较：1).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-0.2mg/ml)下，使用相同弱阳性样品时，在相同扫描条件下HBsAb探针的捕获物的平均标记信号读数，在含有机硅包被活化定向纳米凸体的功能区上比之含氨基化活化定向纳米凸体的功能区上高50％以上，而HCVAg探针的捕获物的平均标记信号读数在两个功能区上则相差不明显；2).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-1.0mg/ml)下，HBsAb探针可检出的阳性样品最低浓度，在含有机硅包被活化定向纳米凸体的功能区上比之含氨基化活化定向纳米凸体的功能区上要低50％以上，而HCVAg探针可检出的阳性样品最低浓度在两个功能区上则相差不明显。这说明，本发明的活化结构单元的复合，具有明显提高反应总灵敏度的作用。

实施例12：本发明的第三种纳米结构组成的应用

本实施例中，所用芯片分别为：实施例6制备的多空间结构单元反应器、和含单空间结构单元反应器的对照芯片1、对照芯片2和对照芯片3。其中：含多空间结构单元反应器的芯片选自表4；对照芯片1仅含功能化非纳米结构区(探针点)，为使用含相同活化结构的活化玻片、使用相同功能试剂、在相同点样条件下所制备；对照芯片2仅含功能化非定向纳米结构区(探针点)，为使用含相同活化结构的活化玻片、使用含相同功能试剂的功能化纳米粒子、在相同点样条件下所制备；对照芯片3仅含功能化定向纳米结构区(探针点)，为使用含相同活化结构的活化定向纳米结构载体、使用相同功能试剂、在相同点样条件下所制备。

本实施例中，本发明的芯片与各对照芯片比较：1).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-0.2mg/ml)下，使用阴性样品时，在相同扫描条件下探针(例如抗原探针)的捕获物的平均标记信号读数，在功能化定向纳米结构区上比之功能化非定向纳米结构区和功能化非纳米结构区上，分别高50％、80％以上，而HBsAd探针的阴性样品捕获物的平均标记信号读数在三个功能区上则相差不明显。从而，本发明的多空间结构单元反应器，可针对不同功能试剂、不同探针检测方法(例如夹心法、间接法、等等)及不同样品，而更灵活地提供优选方案，从总体上提高的灵敏度。这也说明，本发明的优选的空间结构的复合，具有明显提高反应总灵敏度的作用。

实施例13：本发明的第四种纳米结构组成的应用

本实施例中，所用芯片分别为：选自实施例7的含至少一个高活化结构反应器的芯片和对照芯片。其中，对照芯片的不同之处，在于活化基团密度小于0.5μmol/μm²。

本实施例中，本发明的纳米结构芯片与对照纳米芯片比较：1).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-0.2mg/ml)下，使用相同阳性样品时在相同扫描条件下的平均信号读数高200％以上。2).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-1.0mg/ml)下，可检出的阳性样品最低浓度分别要低3倍以上。从而本发明的纳米结构芯片，具有明显提高的反应灵敏度。

实施例14：本发明的第五种纳米结构组成的应用

本实施例中，所用芯片分别为：选自实施例8的含多种类功能化反应器的芯片和对照芯片。其中，对照芯片含单种类功能化反应器，一种为抗原芯片，一种为抗体芯片，其它结构相同。

本实施例中，本发明的第四种纳米结构组成(例如本发明的纳米结构芯片)与对照组成(例如对照芯片)比较，在一个反应器上就可获得在二个对照芯片反应器获得的结果。这也说明，本发明的优选的探针种类的复合，具有明显提高的集成度。

实施例15：本发明的第六种纳米结构组成的应用

以芯片试剂盒的比较为例。本实施例中，所用芯片试剂盒分别为：选自实施例9制备的多纳米结构试剂盒，和作为对照的单纳米结构试剂盒。单纳米结构试剂盒分别为含纳米芯片和常规标记物的对照试剂盒1和含常规芯片和纳米标记物的对照试剂盒2，其中纳米芯片和纳米标记物分别与多纳米结构试剂盒中的纳米芯片和纳米标记物相同。

本实施例中，本发明的芯片试剂盒与各对照芯片试剂盒比较：1).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-0.2mg/ml)下，使用相同阳性样品时在相同扫描条件下的平均信号读数高75％以上。2).在优选的功能试剂浓度(例如点样时功能试剂浓度0.1-1.0mg/ml)下，可检出的阳性样品最低浓度分别要低1倍以上。这说明，本发明的优选的功能化纳米结构的复合，具有明显提高反应灵敏度的作用。其它本发明的纳米结构组成(例如纳米酶标板试剂盒、纳米传感器试剂盒)，也应当有与本发明的芯片试剂盒相同的结果。

实施例16：本发明的第七种纳米结构组成的应用

本实施例中，所用纳米结构组成分别为：复合度更高的纳米结构组成、和对照纳米结构组成。其中：复合度更高的纳米结构组成选自实施例10的制备物，对照纳米结构组成选自实施例4-9中的相应纳米结构组成。本实施例中，复合度更高的纳米结构组成与对照纳米结构组成比较，提供了更多的供优选的条件，从而有更高的应用自由度。