血管抑制素与内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达产物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种血管抑制素与内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达产物及其制备方法，属于遗传工程，或含肽的医药配制品。本发明是从动物肝组织中提取RNA，并进行RNA的反转录，经ES、AS片段PCR扩增和ES、AS片段回收；通过pGEM－T Easy载体上SacI酶切位点和引物上引入的NdeI、NheI、XholI酶切位点的连接反应，将血管抑制素和内皮抑制素基因连接起来，使其在大肠杆菌中的融合表达产物，不仅具有血管抑制素与内皮抑制素单体的功能，而且具有抗血管生成和抗肿瘤的协同作用。

说明书

技术领域

本发明涉及遗传工程技术，或含肽的医药配制品，具体是一种血管抑制素与内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达产物及其制备方法。    

背景技术

肿瘤是当今世界最难攻克的疾病之一。传统药物治疗主要针对异常增殖的肿瘤细胞，但传统的抗肿瘤药物在杀死肿瘤细胞的同时，使正常细胞也不可避免受到损伤，带来严重的毒副作用。抗肿瘤基因工程新药，内源性血管抑制因子血管抑制素(AS)和内皮抑制素(ES)因为其作用特异、无毒副作用，因此，它在肿瘤治疗中越来越受到重视。近来的研究更表明，两者的联合使用具有协同的抗血管生成和抗肿瘤作用。

中国专利1324818公开了一种“生产内皮抑制素的方法”，其是在编码带有N末端附加氨基酸序列的人内皮抑制素的核苷酸序列，其特征是如果不考虑密码子的简并性，其中所说的核苷酸序列，其中所示的XXX代表编码中性氨基酸的密码子或不存在。因此，该发明在提高表达产率的基础上大大提高了人内皮抑制素蛋白的产率，同时简化了表达产物的纯化步骤集复性后蛋白质活性的保留。从而大大降低了大批量生产用于临床前检验集临床试用所需的人内皮抑制素的生产成本。

中国专利1195375公开了一种“血管抑制素片段和集合血管抑制素及其使用方法”，本发明提供了内皮细胞增殖抑制剂的片段和集合形式及使用它们的方法。内皮细胞增殖抑制剂是源于纤溶酶原的蛋白质，具体说是一种血管抑制素片段。血管抑制素片段通常相应与内皮细胞增值一只剂内的Krinkle结构。血管抑制素也以集合形式制备。血管抑制素片段和血管集合抑制素的内皮细胞抑制活性给出了抑制肿瘤的血管生成和治疗血管生成接到的疾病的方法。

发明内容

本发明就是为了解决目前临床分别单独使用血管抑制素和内皮抑制素单体的问题，而提供一种血管抑制素和内皮抑制素的融合基因，使其在大肠杆菌中成功表达，并具有在抗血管生成和抗肿瘤作用中发挥协同作用的血管抑制素与内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达产物及其制备方法。为肿瘤的治疗提供了一条新的途径。

本发明采用以下技术方案实现的。

一种血管抑制素与内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达产物，该表达产物不仅具有血管抑制素与内皮抑制素单体的功能，而且具有抗血管生成和抗肿瘤的协同作用，其核苷酸序列如图6所示。

一种血管抑制素与内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达产物的制备方法，

a.从动物肝组织中提取RNA，并进行RNA的反转录，分别调取血管抑制素和内皮抑制素全基因序列，进行ES、AS片段PCR扩增和ES、AS片段回收；

b.分别在AS上游引物中引入NdeI酶切位点，ES下游引物中引入XholI酶切位点，通过pGEM-T Easy载体上SacI酶切位点和引物上引入的NdeI、NheI、XholI酶切位点的连接反应，将血管抑制素和内皮抑制素基因连接起来，形成融合基因；

c.通过感受态细胞的制备，质粒、连接产物的转化，完成重组表达质粒pET-42(b)/AS-ES的构建，并在大肠杆菌BL21中表达；

d.表达菌体加入变性液后的变性蛋白按倍比稀释逐步缓慢的加入复性液，经过透析、浓缩后上5倍体积平衡缓冲液平衡肝素亲和柱，用洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白。

所述融合表达产物的制备方法，

a.PCR扩增ES片段的扩增条件是：

①95℃5min，②94℃30sec→55℃30sec→72℃2min，循环30次，③72℃10min；完成加A的过程；

b.PCR扩增AS片段的扩增条件是：

①95℃5min，②94℃30sec→50℃30sec→72℃4min，循环30次，③72℃10min。

所述融合表达产物的制备方法，其血管抑制素和内皮抑制素基因分别与pGEM-T Easy载体连接的方向是血管抑制素基因在5’端，内皮抑制素基因在3’端。

所述融合表达产物的制备方法，其感受态细胞的制备是取少量菌液，在无抗生素琼脂平板上划线培养；单菌落接种于无抗生素LB培养液试管中，按1∶100吸取菌液接种于100ml无抗生素LB培养液中，振摇，待菌液呈云雾状时将菌液离心，弃上清，无菌CaCl2溶液重复洗涤沉淀，冰浴，离心，弃上清，分装后4℃过夜备用。

所述融合表达产物的制备方法，其质粒、连接产物的转化是将感受态细胞化冻后冰浴，加入质粒或连接产物，混匀，冰浴、水浴再冰浴，加入无抗生素LB，振摇使细菌复苏，离心，去上清，  新鲜LB重悬后，移液至含抗生素的LB平板，培养至菌落出现，再做蓝白斑筛选。

所述融合表达产物的制备方法，用NdeI+XholI双酶切载体pET-42(b)和中间克隆质粒pGEM-T Easy/AS-ES，通过低融点琼脂糖回收酶切载体及融合基因片段AS-ES，用T4连接酶将融合基因片段AS-ES与酶切载体片段连接，完成重组表达质粒pET-42(b)/AS-ES的构建。

所述融合表达产物的制备方法，将重组表达质粒pET-42(b)/AS-ES转化大肠杆菌BL21，挑取阳性单菌落，接种于3ml带卡那霉素抗性的LB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6时，按1∶100比例接种至10ml新鲜带抗性LB培养液中，37℃220rpm振摇至OD₆₀₀＝0.5时，加入终浓度为1mM IPTG继续振摇4h。

本发明的优点在于将血管抑制素和内皮抑制素的基因通过一段Linker连接起来，在大肠杆菌中表达的目的蛋白是血管抑制素和内皮抑制素的融合蛋白。该蛋白在肿瘤治疗的过程中兼具血管抑制素和内皮抑制素的作用，无需同时使用血管抑制素和内皮抑制素单体，就可以表现出两者之间的协同作用，在肿瘤治疗方面具有更好的前景。

附图说明

图1是基因融合示意图；

图2是转化宿主菌BL21(DE3)后提取质粒鉴定结果；

图3是SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况；

图4-1是重组表达蛋白与AS抗体的免疫印记分析；

图4-2是重组表达蛋白与ES抗体的免疫印记分析；

图5-1是对照组；

图5-2给药组(AS-ES)；

图6是核苷酸序列。

图4-1中：1.标准分子量，2.包含体3.IPTG诱导表达前，4.p IPTG诱导表达前；

图4-2中：1.标准分子量，2.IPTG诱导表达，3.IPTG诱导表达前，4.IPTG诱导的pET-42(b)表达。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明：

1.RNA的提取：

在50g-100g的肝组织中加1ml TRIZOL。4℃12000rpm离心10分钟收上清。室温孵育样品5分钟，每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿，摇15秒，室温孵育3分钟，4℃12000rpm离心15分钟收上清。每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇室温孵育10分钟，4℃12000rpm离心10分钟弃上清。

75％乙醇洗沉淀，混匀沉淀，4℃8000rpm离心5分钟。晾干沉淀，将其溶于DEPC水中，-20℃保存。

2.RNA的反转录

按照Invitrogen的反转录试剂盒说明书进行。取3μl肝脏总RNA，2μl下游引物，1μl 10mM dNTP，加DEPC水至12μl，于65℃孵育5分钟后，在冰上迅速冷却，离心甩一下后再加4μl 5×buffer，2μl，0.1M DTT，1μl RNase OUT^TM，轻微混匀，37℃放置2分钟后，加1μl M-MLVRT^α，混匀，37℃放置50分钟，70℃15分钟终止反应。最后加1μl RNaseH 37℃放置20分钟以消化RNA。

3.血管抑制素和内皮抑制素全基因序列扩增引物设计与合成

从Genebank中分别调取血管抑制素和内皮抑制素全基因序列，通过Primer 5.0辅助设计其引物。在AS上游引物中引入NdeI酶切位点，ES下游引物中引入XholI酶切位点，用一段Linker将它们连接起来，Linker中含有一个NheI酶切位点。在AS上游引物、ES下游引物设计中分别含有一段Linker，并都包含有NheI酶切位点，最终通过在该位点的连接反应进行基因拼接，达到基因融合的目的。最终合成的引物见下表：

引物名称序列  酶切位点AS上游引物AS下游引物ES上游引物ES下游引物5‘----gcaattccatatgaggaagtcctccataatcatt---3’5‘----cagctagccatgtggacaacaggcggaggtgctac---3’5‘-----cagctagccacatgcacagccaccgcgacttc---3’5‘----cgcctcgagttacttggaggcagtcatgaag---3’  NdeI  NheI  NheI  XholI

4.血管抑制素和内皮抑制素基因分别进行PCR扩增

(1)PCR扩增ES片段

40μl反应体系中含Pfu DNA聚合酶混合物20μl，cDNA 2μl，ES上游引物1μl，ES下游引物1μl，ddH₂O16μl。扩增条件是a)95℃5min，b)94℃30sec→55℃30sec→72℃2min，循环30次，c)72℃10min。反应结束后在反应体系中加入1μl Taq DNA聚合酶，继续70℃30min，则完成加A的过程。

(2)PCR扩增AS片段

40μl反应体系中含Pfu DNA聚合酶混合物20μl，cDNA 2μl，AS上游引物1μl，AS下游引物1μl，ddH₂O16μl。扩增条件是a)95℃5min，b)94℃30sec→50℃30sec→72℃4min，循环30次，c)72℃10min。

反应结束后在反应体系中加入1μl Taq DNA聚合酶，继续70℃30min。

5.血管抑制素和内皮抑制素基因片段的回收

按照QIAGEN玻璃奶回收试剂盒的说明操作。进行1％琼脂糖电泳，切下目的条带放入EP管中，加3倍体积的溶胶缓冲液，56℃放置10分钟使胶溶解。再加入10μl玻璃奶，室温下放置5分钟，期间每隔1分钟弹拨一下，使玻璃粉保持悬浮状态。10000rpm离心30秒，弃上清，再加入150μl洗液悬起玻璃粉，吸去管内残余液体，室温干燥。加入20μl Elusion buffer悬起玻璃粉，室温下放置5分钟。10000rpm离心1分钟，移上清至一新离心管中，此为回收的PCR产物。

6.血管抑制素和内皮抑制素基因分别与pGEM-T Easy载体连接

将目的基因片段与pGEM-T Easy按3∶1的比例加入10×T4DNA连接酶Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl，适量去离子水，16℃连接过夜。

7.血管抑制素和内皮抑制素的基因融合

利用pGEM-T Easy载体上SacI酶切位点和引物上引入的NdeI、NheI、XholI酶切位点将血管抑制素和内皮抑制素基因连接起来，形成融合基因，连接方向是血管抑制素基因在5’端，内皮抑制素基因在3’端。基因融合的同时也完成了中间克隆载体的构建。基因融合示意图见图1。

8.感受态细胞的制备

以无菌铂丝蘸取少量菌液(DH-5α或BL21)，在琼脂平板(无抗生素)上划线，37℃培养16h。挑取单菌落接种于无抗生素LB培养液试管中，37℃220rpm振摇14h。按1∶100吸取菌液接种于100ml无抗生素LB培养液中，37℃220rpm振摇1-2h，待菌液呈云雾状时将菌液5000rpm 4℃离心10min，弃上清。用10ml预冷的0.1M无菌CaCl₂溶液洗沉淀，冰浴20-30min，5000rpm 4℃离心10min，弃上清。用约2.8ml 0.1M无菌CaCl₂溶液重悬沉淀，分装后4℃过夜备用。

9.质粒、连接产物的转化

取一管感受态细胞，化冻后置于冰浴，加入1μl质粒或5μl连接产物，轻轻旋转以混匀，冰浴30-50min后，42℃水浴90秒，再次冰浴3min，加入800μl无抗生素LB，120rpm振摇45min使细菌复苏，4000rpm离心10min，去上清，以200μl新鲜LB重悬后，以微量移液器吸取混和物至含抗生素的LB平板，玻棒轻轻涂匀，室温下待液体吸收后，倒置于37℃培养12h以上至菌落出现。

在做蓝白斑筛选时复苏后涂板的菌液中要加入40μl 20mg/ml的X-Gal和4μl 200mg/ml的IPTG，其它步骤同上。

10.质粒的提取及序列测定

从新鲜转化的LB平板上挑选经过酶切鉴定正确的单菌落，接种于含抗性的LB中，37-培养10h以上。取1ml菌液于EP管中，12000rpm离心30秒，弃上清并晾干沉淀。加入100μl溶液I混匀沉淀，再加入200μl溶液II，颠倒混匀，冰浴5分钟后加入溶液III混匀，冰浴10分钟。12000rpm离心10分钟收取上清。分别加入等量的酚：氯仿和等量氯仿进行抽提，12000rpm离心5分钟收取上清。加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，颠倒混匀，-20℃沉淀30分钟。4℃10000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，弃上清，晾干沉淀，加1μl的RNase和20μlTE溶解DNA，37℃孵育30分钟后保存。提取的质粒采用T7和SP6通用引物从正反方向测定核苷酸序列如图6。

11.重组表达质粒pET-42(b)/AS-ES的构建

用NdeI+XholI双酶切载体pET-42(b)和中间克隆质粒pGEM-TEasy/AS-ES，通过低融点琼脂糖回收酶切载体及融合基因片段AS-ES，用T4连接酶将融合基因片段AS-ES与酶切载体片段连接(方法见前)，得到重组表达质粒pET-42(b)/AS-ES。

重组表达质粒在转化宿主菌BL21(DE3)后提取质粒，进行NdeI+XholI双酶切，可以鉴定目的基因是否插入。鉴定结果见图2：

12.目的蛋白在大肠杆菌BL21中的表达

重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，挑取阳性单菌落，接种于3ml带卡那霉素抗性的LB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6时，按1∶100比例接种至10ml新鲜带抗性LB培养液中，37℃220rpm振摇至OD₆₀₀＝0.5时，加入终浓度为1mM IPTG继续振摇4h。

表达菌体进性超声波破碎，12000rpm离心10分钟，收集菌体沉淀和上清，分别加入等量1×与2×样品缓冲液，进行12％的SDS-PAGE凝胶电泳(浓缩胶80V，分离胶100V)，经考马斯亮蓝R250染色、脱色后，分析目的蛋白的表达形式。SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况见图3：

13.包涵体的洗涤

将包涵体以TE重悬，振摇洗涤4h，12000rpm离心10分钟弃上清，沉淀再以2％Triton-x100重悬，静置2h，12000rpm离心10分钟弃上清，沉淀再以4M尿素重悬，静置2h，12000rpm离心10分钟弃上清。

14.包涵体的变、复性

称量包涵体质量，按1g∶10ml加入变性液(8M尿素+5mM EDTA+100mM2-巯基乙醇+500mM NaCl+50mM TrisCl，)，混匀后，室温静置2-3h，12000rpm 4℃离心15min，弃沉淀。用变性剂将变性蛋白的浓度调至0.3mg/ml以下，按倍比稀释逐步缓慢的加入复性液，直至溶液中尿素浓度为1M。

15.肝素亲和层析

复性后的样品经过透析、浓缩后可以上柱。用5倍体积平衡缓冲液平衡肝素亲和柱。将制备好的样品上柱。用10mM TrisCl洗柱直至A₂₈₀不再检测出蛋白。用洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白峰。

16.重组表达蛋白的免疫印迹分析

诱导后的全菌体进行12％SDS-PAGE电泳，恒流80mA转膜3h，通过预染Marker观察是否转膜完全。电转后的硝酸纤维素滤膜4℃封闭过夜，加入I抗，室温下孵育2h，PBST洗3遍，每次10min，加入II抗，室温下孵育2h，PBST洗5遍，每次10min。在10ml的10mM Tris-Cl溶液中溶解6mg的二氨基联苯胺，加入100ul 3％NiCl和10ul H₂O₂，混匀后立即使用，于室温轻轻摇动，至蛋白带颜色明显终止反应。结果见图4-1，4-2。

17.重组表达蛋白的生物学活性检测

应用鸡胚尿囊膜对重组蛋白生物学活性进行检测。选4日龄鸡胚，照检后划出气室、胎位，于鸡胚胎面之卵壳上划一三角形，碘酒消毒卵壳，用蛋钻于壳上开一三角形裂痕，不可损伤壳膜，并于气室中央开一小孔。用针头去除卵壳，造成卵窗，勿损及壳膜。在卵窗处壳膜中央滴一滴灭菌生理盐水，然后用针尖循卵壳膜纤维方向划破一隙，不可损伤下面的绒毛尿囊膜。然后以吸耳球紧按气室小孔向外吸气，使造成负压，盐水小滴即自裂隙沿绒毛尿囊膜及壳膜之间渗入，从而使绒毛尿囊膜下陷，因此在绒毛尿囊膜上造成人工气室，加入接种物，将鸡胚轻轻地旋转使接种物扩散到人工气室之下的整个绒毛尿囊膜，用消毒胶布封窗口，然后将接种鸡胚放置于水平位置使人工气室朝上，于37℃温箱培养。结果见图5-1、5-2。