人心肌肌钙蛋白Ⅰ亚基核酸适配子及应用

摘要

本发明公开了一种人心肌肌钙蛋白Ⅰ亚基核酸适配子及应用，一种人心肌肌钙蛋白Ⅰ亚基核酸适配子具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列，一种人心肌肌钙蛋白Ⅰ亚基核酸适配子可以在cTnI早期检测和临床心肌损伤的诊断上应用或用于cTnI的分离纯化，本发明人心肌肌钙蛋白Ⅰ亚基核酸适配子是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，成本低；具有比抗体更高的亲和性和特异性；便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感，因此，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术SELEX技术设计和制备一组与人心肌肌钙蛋白I亚基(cTn I)高特异性和高亲和力的人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子及应用。

背景技术

心血管疾病是危害我国人民健康和生命的重大致死性疾病，根据卫生部2000年的统计，在我国城市中，每十万人中就有二百三十五人死于心脑血管疾病，占各类疾病引起的死亡的首位。且每年以2％的速度递增。急性心肌梗死(AMI)则是造成心血管病人死亡的主要原因。WHO建议的AMI诊断标准有三条：(1)缺血性胸痛的临床病史；(2)心电图的动态演变，出现Q波或QS波，持续一天以上；(3)心肌坏死的血清心肌标志物浓度的动态改变。至少符合其中两条即可诊断为AMI。然而大量的临床实践发现，约有25％的AMI病人发病早期没有典型的临床症状，约50％左右的AMI病人缺乏心电图(ECG)的特异改变，在AMI发作的早期漏诊。在这种情况下，心肌损伤生化标志物的检测在诊断AMI时尤为重要。AMI病人在发病的最初2小时内得到溶栓治疗最为有效，延迟治疗会影响治疗效果。因而，研制一种高度灵敏、高特异性、快速的早期心肌损伤血清标志物诊断试剂，是目前提高心肌梗死的早期诊断率与提高治疗效果、降低病死率的迫切需要。

肌钙蛋白(Tn)是心肌与骨骼肌的收缩调节蛋白，cTn是心肌肌钙蛋白，由cTnI、cTnT和cTnC三个亚单位组成。在个体发生的全过程中，无论骨骼肌受到任何病理刺激，均不表达cTnI，所以cTnI具有高度的心肌特异性。cTn是心肌细胞的特异性蛋白，一般在血液中含量极低，几乎测不到，心肌损伤时cTn释放入血，所以cTnT/I检测心肌损伤具有很高敏感性和特异性，是当前心肌损伤特异性最高的生化标志物。肌钙蛋白升高的程度比CK-MB的参考标准还要高5-10倍。cTnI尤其对微小心肌损伤(MMD)的检测有特殊的临床价值。因此用cTnI以诊断心肌梗死和心肌细胞损伤，可以代替CK-MB，是目前诊断AMI新的“金标准”。cTnI的检测除了在急性冠状动脉综合症(包括隐性心绞痛和不稳定心绞痛，急性心肌梗死等)诊断中的重要作用，而且在心肌缺血损伤的临床诊断和预后判断中的应用更为广泛。如心肌炎、心肌创伤、手术期心脏并发症、脓毒血症导致的左心衰竭等等。此外还可用于溶栓治疗效果观察，心肌损伤面积的估计，心脏移植后排异反应观察，某些药物疗效观察等。cTnT试剂盒只有罗氏公司(Roche)一家生产。cTnI比较多，有Beckman、Access、Abbott Axym、Baxter Strautus等公司。通过对以上公司测试仪器和试剂的性能测试分析，发现不同厂家测定cTnI值具有很大的差异，有的相差30倍以上，而且易受不同因素的影响。许多有识之士提出应对cTnI分析法进行标准化，以使cTnI的检测结果具有可比性。于是国际临床医学基金部(IFCC)最近决定建立制定心肌损伤标志物标准的委员会(C-SMCD)，致力于心肌损伤物标准的提议和建立。然而，现有基于抗体的检测技术存在固有的局限性，如：①不同厂家、不同抗体、不同批次生产抗体效价的不同；②抗体在保存、使用时有严格条件，诸如：温度、pH值、渗透压的限制；③在进行反应时，有很多干扰因素的存在。造成cTnI的检测的标准化很难建立。现在，科学家不约而同的把注意力聚焦到分子生物学新技术在临床检测的应用上。

SELEX技术(系统进化指数富集技术)是90年代初研制的一种新的组合化学技术。其基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列一般长度在20～40bp左右，文库容量在10¹⁴～10¹⁵之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，能与蛋白质、小肽，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的核酸适配子具有许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小可以化学合成，节约成本；b.具有比抗体更高的亲和性和特异性；c.便于标记，在不同部位有选择性的标记；d.稳定性好，重复性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子在临床检测及诊断中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子。

本发明的第二个目的是提供一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子替代抗体在cTnI早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或用于cTnI的分离纯化。

本发明的第三个目的是提供第二种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子。

本发明的第四个目的是提供第二种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子在cTnI早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或用于cTnI的分离纯化。

本发明的技术方案概述如下：

一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子，是具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述结构：

也可以是与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所述的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子的核苷酸序列同源序列占60％以上，使其具有相同功能。

也可以是用SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所述的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子的核苷酸序列杂交的寡核苷酸序列，使其具有相同功能。

也可以是用SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所述的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子的核苷酸序列转录的RNA序列。

所述核苷酸序列的任何位置的A或G或C或T或U被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换后，使其具有相同功能。

所述核苷酸序列的任何位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰，使其具有相同功能。

一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子，在cTnI早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或用于cTnI的分离纯化。

一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子，具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.6所述的核苷酸序列。它们在cTnI早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或用于cTnI的分离纯化。

本发明的优点是：具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：1)本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。因此，SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。

附图说明

图1为检测一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子与cTn I的特异性结合的凝胶阻滞试验图。

图2为一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子检测cTn I狭缝法结果。

图3为一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子检测cTn I印迹法结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子，其特征是具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

SEQ ID No.1所述的核苷酸序列：

cccctgcagg tgattttgct caagtcgaga gcggtgcatc tagggtctct agctcgggaa

agtatcgcta atcaggcgga t  81

SEQ ID No.2所述的核苷酸序列：

cccctgcagg tgattttgct caagtgctta atcgagggta tcgtggggca gttgggaggg 60

agtatcgcta atcaggcgga t  81

SEQ ID No.3所述的核苷酸序列：

cccctgcagg tgattttgct caagtgccgt caacatgtcc tagtaggggt ctcaggggtg 60

agtatcgcta atcaggcgga t 81

本发明中用于SELEX的单链DNA随机库及引物由invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5’CCCCTGCAGGTGATTTT GCTCAA GT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3’，库容量为10¹⁴以上，引物1：5’CCCCT GCAGGTGATTTTGCTCAAGT3’，引物2：5’-biotin-ATCCGCCTGA TTAGCGAT ACT3’，引物3：5’biotin-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT3’，引物4：5’-ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3’。cTn I为实验室原核表达纯化，硝酸纤维素滤膜购于密理博(MilliPore)公司，寡核苷酸的纯化试剂购天为时代公司，PCR试剂盒和T载体购于普洛麦格(Promega)公司。

实施例2

一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子的筛选制备

用PCR制备ssDNA文库

PCR反应体系为：

10×扩增缓冲液  10ul

4种dNTP混合物   各200umol/L

引物1           100pmol  (5’CCCCT GCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3’)

引物2           100pmol  (5’-biotin-ATCCGCCTGA TTAGCGAT ACT3’)

模板DNA         1ug  (5’CCCCTGCAGGTGATTTT GCTCAA GT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3’)

Taq DNA聚合酶  2.5u

Mg²⁺           1.5mmol/L

加双或三蒸水至 100ul

PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸2min，最后72℃延伸7min.

将PCR扩增得到3’端带有生物素的dsDNA文库，dsDNA产物经分离纯化，与链亲和素磁珠结合；然后用0.15mol/L的NaOH使dsDNA变性解链，磁分离；液体经乙醇沉淀，溶于TE缓冲液中。98℃加热2min，冰上1min，室温5min，测定吸光度(A)值，作为筛选的ssDNA文库。

100pmol随机ssDNA文库和5nmol(tRNA+鲑鱼精DNA)加入20ul对照His-磁珠(0.1mg)反筛去除与背景结合的ssDNA。在100ul结合buffer 25℃结合40min，磁分离；然后转移液体与His-cTnI磁珠(0.1mg)37℃结合40min，用冲洗缓冲液洗6次，洗去未结合的ssDNA，再加洗脱缓冲液于80℃作用10min，洗脱下与cTnI蛋白结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。将ssDNA溶解于20ul TE缓冲液中，将ssDNA用经PCR扩增成dsDNA。经生物素-链亲和素磁珠分离ssDNA，用作下一轮筛选的ssDNA文库，重复筛选20轮。

实施例3

凝胶阻滞试验检测一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子与cTn I的结合

将获得的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子(序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列)95℃变性5min，迅速冰水浴5min，加入结合缓冲液10μl，加入不同量cTnI(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7μg)，37℃30min(水浴)。上样到5％聚丙烯酰胺凝胶，电泳，银染观察结果。如图1一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子与cTnI结合后发生凝胶滞后现象。无蛋白的无凝胶滞后现象。

不同量0μg，0.1μg，0.2μg，0.3μg，0.4μg，0.5μg，0.6μg，0.7μg的cTn I与筛选的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子100pmol孵育后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染结果显示：0μg蛋白处，一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子没有与蛋白作用，泳动较快，无凝胶滞后现象。而有蛋白的泳道，一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子与cTn I结合后发生凝胶滞后现象，表明筛选得到的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子与cTn I有特异性结合。(图1中，1为复合物，2为自由适配子)(也可以用上述方法检测序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所述的核苷酸序列与cTn I的结合。)

实施例4

狭缝硝酸纤维素膜过滤法测定cTn I

将不同量(0，0.01，0.04，0.06μg)的cTn I与5’标记生物素的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子(序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列)混合，37℃水浴1h。将cTn I和标记核酸适配子的混合物加到孔径0.45μm硝酸纤维素膜膜上。洗去未结合的核酸适配子，加辣根过氧化酶标记的链亲和素于膜上，37℃温育30min。洗涤后，用发光显迹液发光，暗室内用X光片曝光，X光片显影定影。结果如图2：没有蛋白的没有显迹，有cTn I的显示明显的条带。

如图所示从左到右的cTn I量为0μg，0.02μg，0.04μg，0.06μg，在0μg狭缝处没有显示条带，在0.012μg，0.04μg，0.06μg处有cTn I的狭缝处显示明显的条带，表明筛选到的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子与cTn I特异结合，可用于cTn I的检测。(也可以用上述方法检测序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所述的核苷酸序列与cTn I的结合。)

实施例5

印迹法检测cTn I

将cTn I样品(0.01，0.02，0.03，0.04μg)与加样缓冲液混合，采用Bio-rad的mini-YE电泳系统分析，分离胶浓度12％，浓缩胶5％的SDS-PAGE上电泳，将胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上。用5’标记生物素的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子(序列表中SEQID No.1所述的核苷酸序列)与膜孵育，洗涤后用辣根过氧化酶标记的链亲和素孵育，洗涤后用发光显迹液发光，暗室内用X光片曝光，X光片显影定影。结果如图3：显示明显的条带，表明一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子可替代抗体用于cTn I的检测。(也可以用上述方法检测序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所述的核苷酸序列与cTn I的结合。)

实施例6

一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子，具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列或序列表中SEQ ID No.6所述的核苷酸序列。

SEQ ID No.4所述的核苷酸序列

cgagagcggt gcatctaggg tctctagctc gggaa 35

SEQ ID No.5所述的核苷酸序列

gcttaatcga gggtatcgtg gggcagttgg gaggg 35

SEQ ID No.6所述的核苷酸序列

gccgtcaaca tgtcctagta ggggtctcag gggtg 35

SEQ ID No.4所述的核苷酸序列与SEQ ID No.1所述的核苷酸序列第36至60的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.5所述的核苷酸序列与SEQ ID No.2所述的核苷酸序列第36至60的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.6所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3所述的核苷酸序列第36至60的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子具有相同的功能。