中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白B.b.PGRP及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白B.b.PGRP及其制备方法和应用。主要涉及中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白基因及其编码的蛋白B.b.PGRP，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。本发明通过cDNA文库构建和大规模测序的方法，从中国文昌鱼的消化道中分离得到文昌鱼B.b.pgrp基因，其DNA序列如序列表中1序列所示。该基因编码的蛋白(B.b.PGRP)，其氨基酸序列如序列表中2序列所示。本发明的肽聚糖识别蛋白的粗蛋白初步验证能特异结合细菌表面的生物大分子肽聚糖，并且该融合蛋白对表达菌株有明显的溶菌作用，可用于作为天然的抑菌活性物质以及制备治疗感染性疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白(B.b.pgrp)基因及其编码的蛋白B.b.PGRP，，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。。

背景技术

中国文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)作为在物种进化地位上处于转折地位的原始脊索动物-头索动物，一直以来是研究脊椎动物发育的好材料。近年来，对文昌鱼的免疫的研究引起了广泛的重视，在其中发现了不少具有重要意义的免疫基因。

肽聚糖(peptidoglycan PGN)是几乎所有细菌的细胞壁的主要成分之一，尤其富含于革兰氏阳性菌中，肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein PGRP)就是负责识别这种微生物细胞壁上独有的分子从而起着免疫作用。第一个被发现并被命名的肽聚糖识别蛋白是1996年的Yoshida等人发现的在蚕中的约19Kda的蛋白。这个PGRP被发现是活化昆虫中独有的酚氧化酶原级联反应。接着在蛾、果蝇、蚊等昆虫，以及哺乳动物中的小鼠、大鼠、人、牛、猪、骆驼等动物中也相继被发现并命名。这类蛋白都具有相同的肽聚糖识别的结构域，通过系统发育的同源比较，说明这类蛋白在进化上是保守的。

Choe KM等人发现，果蝇胞外蛋白PGRP-SA参与识别革兰氏阳性菌，并活化Toll通路中的蛋白酶，该酶降解Toll受体spaetzle，从而引起级联反应，启动转录因子Dorsal和Dif，(这同源于哺乳动物的NF-κB)，转录出一系列抗菌肽，如Drosomysin等，从而起到杀菌作用。果蝇的跨膜蛋白PGRP-LC和PGRP-LE却参与了另外一条通路，“Imd”通路，它们识别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的杆菌。这条通路类似哺乳类动物中的TNF通路，引起Rel家族中的成员Relish，转录出Dipterincin等抗菌肽。此外，这个分子也被推测参与吞噬革兰氏阴性菌的作用。除了这些识别受体作用的PGRP，另一类的PGRP被Steiner H等人发现具有酰胺酶作用，果蝇的PGRP-SClB，具有从L-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间切开的酶催化活性，被证实了降低PGN的免疫原型作用，从而在细胞外起到清道夫的作用。

在哺乳动物中，除了S和L外，还有两种PGRP，就是PGRP-Iα和PGRP-Iβ。小鼠PGRP-S在细胞培养状态下抑制革兰氏阳性菌的生长。最高表达量在骨髓，而在多型白细胞和嗜中性粒细胞中的颗粒内起杀菌作用。哺乳动物的PGRP-L主要在肝脏表达，被认为和果蝇的酶类PGRP一样，具有酶活性。PGRP-Iα和PGRP-Iβ主要在食管中表达，被证实位于TLR2、TLR4，及NOD1(nucleotide-binding oligomerization domain)和NOD2等通路的上游。

通过序列同源分析，发现这类蛋白具有类似溶菌酶的性质即具有降解肽聚糖的酶活性位点，提示在对抗外来病原中起着重要作用，成为潜在的抑菌天然活性蛋白，并且具有成为高效天然的抗菌药物的开发价值。在种养殖业、医药卫生等各行业具有广阔的开发前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的天然抗菌蛋白B.b.PGRP和编码该蛋白的基因B.b.pgrp。

本发明的另一目的在于提供该蛋白的生产方法。

本发明的第三个目的在于提供该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。

本发明通过cDNA文库的构建和大规模测序的方法从中国文昌鱼总RNA中分离得到的中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白基因B.b.pgrp，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

本发明所述基因编码的蛋白B.b.PGRP，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；该蛋白等电点为7.60，分子量为27,102道尔顿。

该蛋白可以通过表达载体pGEX-B.b.pgrp在大肠杆菌以胞内可溶形式表达。

所述表达载体pGEX-B.b.pgrp是建立谷胱甘肽转移酶为融合伴体，中间插入凝血酶识别位点的高效表达载体，该系统使B.b.PGRP在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。

本发明所选择的青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)采集于山东省沙子口水域。

本发明通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码文昌鱼B.b.PGRP的克隆，命名为B.b.pgrp(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码255个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等电点为7.60，分子量为27,102道尔顿，具有保守的PGRP的酰胺酶活性位点。

本发明通过设计了一对引物，将编码新基因B.b.pgrp克隆到原核融合表达载体pGEX-4T(Amersham公司)上，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pGEX-B.b.pgrp)以谷胱甘肽转移酶GST为分子融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，GST的C端有柔链区结构，便于利用体亲和层析进行纯化。GST的C端含有凝血酶酶切位点，利于外源蛋白单体的获得。该融合蛋白编码467个氨基酸，等电点为7.2，分子量为51,804道尔顿。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，B.b.PGRP融合蛋白的表达量较高，大部分处于可溶状态。

本发明还摸索和优化了重组B.b.PGRP蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经GST Sepharose 4B亲和色谱层析，得到较纯的融合蛋白。

本发明的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecularcloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl₂的方法将质粒转化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基培养转化菌株，用Omega公司试剂盒提取质粒。

本发明初步证明了该具有溶菌的活性。融合蛋白通过与金黄色葡萄球菌提取的肽聚糖进行亲和孵育，再用GST蛋白单克隆抗体进行Western-blocking检测结合在不溶的肽聚糖沉淀的结合蛋白的方法，证明了该融合蛋白能特异结合细菌表面的生物大分子肽聚糖。

通过氯仿溶菌的方法初步证明了该融合蛋白具有溶菌活性，方法是按照传统验证噬菌体溶菌酶成功在大肠杆菌表达的溶菌实验。

附图说明

图1为本发明的中国文昌鱼蛋白和其它物种PGRP蛋白的比较结果，其中“*”表示相同；“：”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示完全不同。

图2为文昌鱼消化道总RNA。1：DNAmarker DL2000(Takara)；2：总RNA

图3双链cDNA电泳结果。1：双链cDNA PCR电泳；2：DNA marker widerange(Takara)。

图4为基因B.bpgrp的重组表达质粒pGEX-B.b.pgrp构建图。

图5为重组B.b.PGRP蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。1：低分子量标准蛋白质marker；2：未经诱导的pGEX-B.b.pgrp菌体总蛋白；3：经IPTG诱导的pGEX-B.b.pgrp菌体总蛋白；4：诱导菌超声上清总蛋白；5：穿流峰；6：10mM还原型谷胱甘肽洗脱峰；7：过G-25分子筛后除去谷胱甘肽。

图6为B.b.PGRP1的肽聚糖结合活性：1：蛋白Marker；2：B.b.PGRP1-GST融合蛋白超声上清上样对照，GST单抗检测；3：从肽聚糖上洗脱下来的B.b.PGRP1-GST融合蛋白，GST单抗检测；4：B.b.PGRP1-GST融合洗脱上清，GST单抗检测：5：空载体GST蛋白超声上清上样对照，GST单抗检测；6：从肽聚糖上洗脱下来的空载体GST蛋白，GST单抗检测；7：空载体GST蛋白洗脱上清，GST单抗检测。

图7为B.b.PGRP1的溶菌活性GST：空载蛋白；GST-PGRP：融合蛋白；BEFORE：加1％(v/v)氯仿前；AFTER：加1％(v/v)氯仿十分钟后。

具体实施方式

以下实施将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：中国文昌鱼消化道总RNA的提取和cDNA的合成

总RNA的提取和cDNA合成：收集中国文昌鱼消化道，采用Trizol试剂法(Invitrogen公司)提取消化道总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质，获得中国文昌鱼消化道总RNA，其A₂₆₀/A₂₈₀＝1.96，经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的18s和28s两条带，比值＞1(见图2)，表明总RNA完整性较好、纯度也较高。取1ug总RNA，以SMARTIII olignuclotide

(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N-3′)进行逆转录合成第一链，得到10μl一链cDNA产物。

取2ul cDNA一链产物，以5’PCR Primer(5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)和3’PCR Primer(5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)为引物进行LD-PCR合成二链cDNA。

实施例2：中国文昌鱼消化道B.b.pgrp基因序列的测定和分析

将二链cDNA连接至pcDNA3.0载体(购自Invitrogen公司)，转化DH5α大肠杆菌(购自Invitrogen公司)，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得了编码全长B.b.pgrp基因的EST序列，基因长度都是765bp，编码255个氨基酸的B.b.PGRP蛋白，是1个新的PGRP蛋白。

用ClustalW分析软件，对已报导的不同物种的PGRP蛋白序列比较，结果如图1所示。

从图1可以看出，PGRP在不同的物种中是较为保守的。

实施例3：重组pGEX-B.b.pgrp表达质粒的构建

依据B.b.pgrp基因的两端序列合成一对引物，上游引物含BamHI切割位点，下游引物含NotI切割位点。

上游引物(P1)：

5’CGCGGATCC CAGCGGTGGCGCAGTGACG3’

      BamH I

下游引物(P2)：

5′CGT GCGGCCGC GCCAACGTATCGTCCCCAGGA3′

        Not I

以含B.b.pgrp基因的pcDNA3.0质粒(购自Invitrogen公司)为模板，P1、P2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在750bp左右。将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pGEX(购自Aersham公司)上，得到重组表达载体pGEX-B.b.pgrp(其构建过程如图4所示)。表达载体pGEX-B.b.pgrp中的外源基因经测序鉴定正确。

实施例4：中国文昌鱼B.b.PGRP融合蛋白的表达

将pGEX-B.b.pgrp转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNATOOLS6.0预测的理论值52kD相符(图5)。

对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索得出。基因工程菌的培养条件为：接单菌落于50ml氨苄抗性LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物10ml接种于1L的氨苄抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6(扩大培养约4h)，加入100mM IPTG至终浓度分别为0.2mM，18℃，250rpm诱导培养16h后离心收集菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下B.b.PGRP融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40％以上，处于可溶状态(图5)。

实施例5：中国重组文昌鱼B.b.PGRP融合蛋白的纯化

将总菌体用50mM Tris.Cl，100mM NaCl(pH8.0)洗涤，再用适量的50mMTris.Cl，100mM NaCl(pH8.0)悬浮，超声处理后，裂解上清液GST Sepharose 4B亲和色谱层析纯化，SDS-PAGE分析融合蛋白的表达和层析的结果。从SDS-PAGE结果可以得出：GST-B.b.PGRP能被亲和柱所吸附，用10mM的还原型谷胱甘肽洗柱时，能把目的蛋白GST-B.b.PGRP洗下。收集得到重组蛋白的洗脱峰。

洗脱液过G25凝胶柱除去蛋白中的还原型谷胱甘肽，得到成分比较单一的蛋白(图5)。

实施例6：B.b.PGRP重组蛋白的结合肽聚糖活性

将得到的表达菌的超声上清与不溶的从金黄色葡萄球菌中提取的肽聚糖在50mMTris.Cl，100mM NaCl(PH8.0)中4℃温和旋转1小时，后8000g离心5分钟，去上清，再用50mM Tris.Cl，100mM NaCl(PH8.0)洗涤四次，尽量去除非特异结合的蛋白，沉淀和上清分别加loading buffer，连同超声上清蛋白上样进行SDS-聚丙烯酰氨电泳，转膜，用GST单抗进行Western-block分析，与对照相比，在肽聚糖上洗脱下来了目的B.b.PGRPl-GST融合蛋白条带，说明该融合蛋白具有结合肽聚糖的活性。

实施例7：B.b.PGRP重组蛋白活性分析

通过氯仿溶菌的方法初步证明了该融合蛋白在表达菌株就具有溶菌活性，方法是按照传统验证噬菌体溶菌酶成功在大肠杆菌表达的溶菌实验。在已经诱导表达的新鲜菌液中加入1％的氯仿，使细菌的细胞壁裂解，融合蛋白释放出来并降解肽聚糖，从而使菌液变澄清，十分钟后稀释10倍测OD₆₀₀的值。肉眼可以看出实验组和对照组(GST空载蛋白)的区别十分明显(图6)。

序列表

<110>中山大学

<120>中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白B.bPGRP基因及其应用

<160>2

<210>1

<211>765

<212>DNA

<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)

<220>

<221>peptide

<222>(1)…(765)

<400>1

  1  ATG GAG ACG AAA GGA CTA GTC ATC CTT TTG TGC CTG CTG CCA TAC GCG GCT GCC CAG CGG      60

  1  M   E   T   K   G   L   V   I   L   L   C   L   L   P   Y   A   A   A   Q   R        20

 61  TGG CGC AGT GAC GGC CGC TGC GGC CCG AAC TAC CCC TCC CCT GAC GCC AAC CCG GGC GAG     120

 21  W   R   S   D   G   R   C   G   P   N   Y   P   S   P   D   A   N   P   G   E        40

121  TGT AAC CCG CAC GCC GTG GAC CAC TGC TGC TCG GAG TGG GGC TGG TGT GGC CGG GAG ACC     180

 41  C   N   P   H   A   V   D   H   C    C   S  E   W   G    W   C   G  R   E   T        60

181  ACA CAC TGT ACC TGC TCT CGC TGC GTG GAC TAT TCC GCG GGT GGT GGC TCT TCG GGA GGC     240

 61  T   H   C   T   C   S   R   C   V   D   Y   S   A   G   G   G   S   S   G   G        80

241  TCG ACA GTC GTC GTC AGC AGC TCG GGA ACT TGT CCC AGG ATC GTG TCC AAG TCG GAA TGG     300

 81  S   T   V   V   V   S   S   S   G   T   C   P   R   I   V   S   K   S   E   W       100

301  GGT TCC CGG GCC ACC AAC TAT AAC GTG TTT CTC AGC CTG CCG GTC CCA AAG GTT GTG ATC     360

101  G   S   R   A   T   N   Y   N   V   F   L   S   L   P   V   P   K   V   V   I       120

361  CAC CAC TCG GCG GGC GCC ACG TGC AGT ACC CAG TCG TCC TGT TCT CTA CAG GTC AGG AAC     420

121 H   H   S   A   G   A   T   C   S   T   Q   S   S   C   S   L   Q   V   R   N       140

421 ATC CAG AAC TAC CAC ATG GAC GGC AGA GGC TAC AGC GAC ATC GGC TAC AAC TTC CTG GTC     480

141 I   Q   N   Y   H   M   D   G   R   G   Y   S   D   I   G   Y   N   F   L   V       160

481 GGT AAC GAT GGC AAC GTG TAC GAA GGG CGC GGC TGG GAC AGG AGA GGT GCG CAT GCG CTT     540

161 G   N   D   G   N   V   Y   E   G   R   G   W   D   R   R   G   A   H   A   L       180

541 AAC GTC AAC ACC GAG TCC ATC GGG ATC TGC TTC ATG GGA GAC TTC ACC AGT CAG AAG CCG     600

181 N   V   N   T   E   S   I   G   I   C   F   M   G   D   F   T   S   Q   K   P       200

601 ACC GCC TCC GCC ATC GCC GCC GCC AAG AGC CTC ATC TCA TGC GGG GTG TCC CTG GGC AAG     660

201 T   A   S   A   I   A   A   A   K   S   L   I   S   C   G   V   S   L   G   K       220

661 ATC AGG TCG GGC TAC TCC CTG TAC GGA CAT CGT GAC GTC GGC TCC ACA GCC TGC CCT GGG     720

221 I   R   S   G   Y   S   L   Y   G   H   R   D   V   G   S   T   A   C   P   G       240

721 AAC CTG CTC TAT GAT GAC ATC AAG TCC TGG GGA CGA TAC GTT GGC TGA                     768

241 N   L   L   Y   D   D   I   K   S   W   G   R   Y   V   G     *                     256

<210>2

<211>255

<212>PRT

<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)

<220>

<221>peptide

<222>(1)…(255)

<400>2

1   METKGLVILL CLLPYAAAQR WRSDGRCGPN YPSPDANPGE CNPHAVDHCC

51  SEWGWCGRET THCTCSRCVD YSAGGGSSGG STVVVSSSGT CPRIVSKSEW

101 GSRATNYNVF LSLPVPKVVI HHSAGATCST QSSCSLQVRN IQNYHMDGRG

151 YSDIGYNFLV GNDGNVYEGR GWDRRGAHAL NVNTESIGIC FMGDFTSQKP

201 TASAIAAAKS LISCGVSLGK IRSGYSLYGH RDVGSTACPG NLLYDDIKSW

251 GRYVG^*