中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究

摘要

文昌鱼在进化上具有重要地位，为揭示免疫系统的起源和进化以及低等生物的免疫系统的研究提供了一个很好的模型。肽聚糖识别蛋白(PGRP)是肽聚糖识别蛋白是存在于昆虫、软体动物、棘皮动物、脊椎动物中的重要天然免疫分子，都具有一个或两个的肽聚糖识别的结构域，在进化上是保守的，跟噬菌体的T7溶菌酶具有同源性。昆虫有19个PGRP，分为长型和短型，起到识别、信号传导和效应分子的作用，如活化昆虫中的toll通路和imd通路引起下游抗菌肽的表达。哺乳动物有4个PGRP，都是分泌型的，非跨膜分子，与TLR识别并引起的细胞免疫通路无很大的关系，而是直接识别细菌和行使着效应分子的功能，其中PGLYRP—2行使酰氨酶的功能，而PGLYRP-1、PGLYRP—3、PGLYRP—4则可以通过与细菌细胞壁的相互作用来起到杀菌的功能，但是直接杀菌的活性仍然在研究中。因此低等和高等的生物类群中该蛋白的功能差异性较大，但对于该基因家族功能的进化并不是很清楚。本文对文昌鱼肽聚糖识别蛋白进行了克隆表达、细胞定位和初步功能研究，为肽聚糖识别蛋白功能进化提供了线索。 本论文构建了中国文昌鱼PGRP1、2、3真核转染载体，并将其转染到哺乳动物细胞中进行定位，对其细胞表达定位进行了分析，在转染了pEGFP—N1-PGRP1融合表达载体的Hela细胞中，其绿色荧光都分布在细胞核的一极，而转染pEGFP—N1-PGRP2、pEGFP—N1-PGRP3融合表达载体的Hela细胞中，绿色荧光没有很集中且特异的细胞定位，在细胞核与细胞质中均匀弥散地分布。因此并没有为这三个蛋白在信号通路作用方面提供明显指示性的信息。 本论文在大肠杆菌表达系统中，分别表达和纯化了中国文昌鱼pGEX—PGRP1、2、3融合蛋白和pTRX—PGRP1融合蛋白，并对这些蛋白的功能进行了研究。本文通过检测表达菌菌液的OD值、检测菌液上清中核酸物质含量以及用电镜观察表达菌的细胞壁情况等方法，发现了中国文昌鱼pGEX—PGRP1、pTRX—PGRP1和pGEX—PGRP3融合蛋白具有不同程度的从大肠杆菌内部破坏细菌细胞壁的能力；通过抑菌圈和测细菌生长曲线等体外实验发现，中国文昌鱼PGRP并没有特别明显的直接杀菌或者抑制细菌生长的功能；通过高效液相色谱、质谱等分析手段，发现了pTRX—PGRP1融合蛋白对金黄色葡萄球菌来源的PGN具有切割能力，同时也可以增强金黄色葡萄球菌来源的PGN的水解。 本论文还探索了Bac—To—Bac杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达出中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白(PGRP2)，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。 总之，通过对三个中国文昌鱼PGRP的细胞定位、原核表达及功能研究，为肽聚糖识别蛋白的功能进化提供了一定的线索。同时在昆虫表达系统中表达出中国文昌鱼PGRP2，也为进一步进行功能蛋白的研究奠定了基础。 另外，本文对中国文昌鱼PGRPI具有切割PGN的酶活的活性机制和作用位点是否与高等动物相似仍需进一步探讨。另外，因为缺乏培养文昌鱼细胞的能力，PGRP在文昌鱼细胞中是否具有像昆虫中信号通路识别分子功能尚未确定。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章概述

1.1文昌鱼概况

1.2天然免疫识别与肽聚糖PGN

1.3 PGRP研究现状

1.4本论文的研究目的及意义

1.5本文的技术路线

第二章中国文昌鱼PGRP1、2、3的真核细胞定位

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论与小结

第二章中国文昌鱼PGRP1、2、3的原核表达及纯化

第一节中国文昌鱼pTRX-B.b.PGRP1原核表达与纯化

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.1.3结果与讨论

3.1.4小结

第二节中国文昌鱼pGEX-B.b.PGRPs原核表达与纯化

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.2.3结果与讨论

3.2.4小结

第四章中国文昌鱼PGRP蛋白杀伤细菌和抑制细菌生长的功能研究

第一节中国文昌鱼PGRP蛋白溶解细菌细胞壁的试验

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.1.3实验结果

4.1.4讨论与小结

第二节中国文昌鱼PGRP蛋白对细菌生长抑制作用实验

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.2.3实验结果

4.2.4讨论与小结

第五章中国文昌鱼PGRP酶活性试验的探索

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3实验结果

5.4讨论与小结

第六章BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统的探索和中国文昌鱼PGRP真核表达

6.1实验材料

6.2实验方法

6.3实验结果

6.4讨论与小结

总结与展望

参考文献

附 录

攻读硕士阶段参与的课题研究

致 谢