检测肠道重要致病菌的基因芯片及其检测方法和检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测肠道重要致病菌的基因芯片及其检测方法和检测试剂盒，其中基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针至少含有从一种或几种肠道重要致病菌的O－抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因选取的DNA片段和从志贺氏菌和大肠杆菌16S rRNA保守区选取的DNA片段。利用设计的引物将待检测样品基因组DNA进行Multiplex PCR扩增并用上述基因芯片进行杂交，然后使用判读软件Bactarray Analyzer分析鉴定杂交结果。本发明具备极高的灵敏度和特异性，可鉴别到具体的血清型，且其检测和分析方法高效快捷，可用于生命科学、医学检验、食品安全、环境监督、进出口检验检疫、生物恐怖防范、流行病学监控等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因芯片及其检测方法和检测试剂盒，特别涉及一种检测肠道重要致病菌的基因芯片及其检测方法和检测试剂盒。

背景技术

肠道传染病是全球性重要公共卫生问题之一，亚、非、拉地区尤为严重。根据WHO的资料，上述地区5岁以下儿童每年因肠道传染病死亡者约500万以上，发病约7.5亿～10亿人次。即使在经济发达的国家和地区也存在上述问题，例如美国、日本等国出血性大肠杆菌O157:H7肠炎的严重流行即可说明这一事实。1982年美国首次报道了由EHEC O157:H7引起的出血性肠炎暴发。此后，世界各地陆续报道了该菌引起的感染，并有上升趋势。1996年在日本发生的EHEC O157:H7的暴发流行，引起出血性腹泻，先后波及30多个都、府、县，感染近万人，并造成12人死亡，引起了全世界的关注。我国是发展中国家，卫生基础薄弱，经济、文化等尚不发达，加以幅员辽阔，人口众多，各地差别大而发展又不平衡，从而给肠道传染病的预防和控制带来一定困难。根据首都儿科研究所等单位1986～1988年在国内7个示范县及北京市的调查结果估算，我国5岁以下儿童每年发生肠道传染病者约1.7亿人次；又据1987年国内21省(市)腹泻病防治现状入户调查结果推算，全国每年约8.36亿人次发病，其中5岁以下儿童约2.09亿人次，其严重性可见一斑。1989～1991年，在WHO支持下，国家卫生部在山东、云南、福建、甘肃、北京及湖南先后开展了22次城乡入户调查，结果表明5岁以下儿童的年平均发病为0.86～3.9次/人·年，6省(市)的平均水平为2.5次/人·年，其中农村地区为2.9次/人·年。以20世纪90年代后的最近10余年全国甲、乙类传染病的发病数来分析，呼吸道传染病、血源性及性传播疾病、自然疫源性及虫媒传染病的发病数，每年均未超过6位数，唯有肠道传染病每年都以7位数而名列榜首。由于肠道传染病是导致儿童营养不良、生长发育障碍和成人劳动力大量损失的重要因素之一，因而直接危害人民健康和社会经济的可持续发展，必须引起足够的重视(魏承毓，我国肠道传染病的基本状况与防治对策，中国公共卫生2004年1月第20卷第1期)。

肠道致病菌主要包括：大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、气单胞菌、邻单胞菌等。肠道致病菌通过水、食物及日常生活用品传播，大部分为人畜共患，尤其对婴儿和幼畜(禽)常引起严重腹泻。在中国最为常见的是大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌，发病率占小儿腹泻病例的80％，占成人腹泻病例的50％。

近年来流行病调查显示，目前中国最常见且致病性强的15型肠道重要致病菌包括：志贺氏菌的10个血清型——福氏志贺氏菌2a型(ShigellaFlexneri 2a)(O-抗原基因簇序列来自：gb/AY900451)、宋内氏志贺氏菌1型(Shigella sonnei 1)(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF294823)、鲍氏志贺氏菌O7(Shigella boydii O7)(O-抗原基因簇序列来自：专利号03100536.5)、鲍氏志贺氏菌O9(Shigella boydii O9)(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF402315)、鲍氏志贺氏菌O13(Shigella boydii O13)(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号03100537.3)、鲍氏志贺氏菌O16(Shigella boydiiO16)(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019049.8)、鲍氏志贺氏菌O18(Shigella boydii O18)(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019051.5)、痢疾志贺氏菌O4(Shigella dysenteriae O4)(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019052.x)、痢疾志贺氏菌O8(Shigelladysenteriae O8)(O-抗原基因簇序列来自：专利号03100539.X)、痢疾志贺氏菌O10(Shigella dysenteriae O10)(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019186.1)和大肠杆菌的5个血清型——大肠杆菌O55(E.coliO55)(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF461121)、大肠杆菌O111(E.coli O111)(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF078736)、大肠杆菌O114(E.coli O114)(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF573377)、大肠杆菌O128(E.coli O128)(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF217096)、大肠杆菌O157(E.coli O157)(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF061251)。

现在对肠道致病菌的通用检测方法是对O和H(主要是O)抗原的抗血清凝集反应。此方法需经过先培养再分离单菌落，最后用生化鉴定和血清学反应鉴定所感染的细菌种类的过程。此法的缺点在于灵敏性低，耗时长，漏检率高，而且世界上没有任何国家生产全套用于鉴定的抗血清。因此急需发明可更快速、准确、可靠的检测肠道重要致病菌的方法。

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌的主要表面成分，在细胞外膜维持其结构及行使其生物学功能上有着不可缺少的作用，在细菌和外部环境的相互作用中也扮演着非常重要的角色。脂多糖是动物免疫系统对入侵的革兰氏阴性菌的首要识别及攻击目标，同时也在致病性细菌侵染宿主细胞过程中从黏附，侵染到躲避宿主细胞的免疫攻击中起着重要的作用。典型的LPS分子由三个部分共价连接而成：O特异性多糖链、核心多糖、类脂A。O特异性多糖链游离于菌体表面，其基部与核心多糖相连，位于脂多糖分子的最外层。其中O特异性多糖链是引起宿主特异抗体反应的主要表面抗原，又被称为O抗原。O抗原由寡糖重复单位(≤50)组成，每个重复单位通常由三到八个单糖组成，O抗原结构由于构成重复单位的单糖种类、排列顺序、结合方式及多糖链的空间结构不同而不同。这种高度多样性决定了O抗原与宿主之间的特异性。根据O抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。例如，常见的致病菌E.coli(包括Shigella)被分为187个O抗原血清型。

王磊教授和Reeves教授在1998年提出了糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因为O-抗原特异基因理论(国际专利申请，WO 98-AU315和WO99-AU385)。根据以上研究理论，我们可针对O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因设计引物，再通过PCR方法筛选出高度特异的基因和寡核苷酸片段，以此达到检测致病菌的目的。PCR技术本身的优越性无可厚非，自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。

但如果反应条件控制不好也容易出现假阴性及交叉污染，然而基因芯片技术的出现解决了这一难题。1997年7月Affymetric，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人发明了以基因芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法(第6,228,575号美国专利)。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的分析检测技术建立了起来，并随着人类基因组计划的开展逐步发展起来。该技术综合运用了分子生物学技术，集成电路制造技术，计算机技术，半导体技术，共聚焦激光扫描技术，荧光标记技术，使检测过程具有敏感性高，特异性强，大规模集成化，自动化，操作简便快捷，效率高等特点，受到科研人员的青睐，并在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌血清型鉴定，不仅可以大大简化技术平台，而且有望实现高准确性，高灵敏度，高通量，可重复性强等优点。

综上所述，有必要发明出一种能够快速、准确、可靠的对肠道重要致病菌进行分型检测的产品及其方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测肠道重要致病菌的基因芯片，以补充现有检测技术的不足。

本发明的另一目的是提供一种利用上述基因芯片进行简便、快捷、高效检测肠道重要致病菌的方法。

本发明的再一目的是提供一种检测肠道重要致病菌的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提出了一种检测肠道重要致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中该基因芯片上的寡核苷酸探针至少含有从一种或几种肠道重要致病菌的O-抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因选取的DNA片段和从志贺氏菌和大肠杆菌16S rRNA保守区选取的DNA片段。

在本发明的较佳实施例中，上述一种或几种肠道重要致病菌选自福氏志贺氏菌2a型、宋内氏志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌O7、鲍氏志贺氏菌O9、鲍氏志贺氏菌O13、鲍氏志贺氏菌O16、鲍氏志贺氏菌O18、痢疾志贺氏菌O4、痢疾志贺氏菌O8、痢疾志贺氏菌O10、大肠杆菌O55、大肠杆菌O111、大肠杆菌O114、大肠杆菌O128和大肠杆菌O157。

在本发明的较佳实施例中，上述一种或几种肠道重要致病菌的O-抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因选取的DNA片段例如选自具有如SEQ ID NO：1-NO：48所示的碱基序列的DNA片段。从志贺氏菌和大肠杆菌16S rRNA保守区选取的DNA片段例如具有如SEQ IDNO：49和NO：50所示的碱基序列。

本发明还提出了一种检测肠道重要致病菌的方法，包括以下步骤：

(1)根据一种或几种肠道重要致病菌的O-抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因和志贺氏菌和大肠杆菌16S rRNA保守区序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；

(2)使用步骤(1)所述的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)将扩增产物与上述基因芯片杂交；

(4)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。

在本发明的较佳实施例中，其中上述步骤(1)中根据一种或几种肠道重要致病菌的O-抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因设计的引物选自例如具有如SEQ ID NO：50-NO：80所示的碱基序列的寡核苷酸片段。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(1)中根据志贺氏菌和大肠杆菌16S rRNA保守区序列设计的引物序列如SEQ ID NO：79和NO：80所示。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(4)中例如使用判读软件Bactarray Analyzer分析鉴定杂交结果，步骤如下：

1)荧光信号的有效性验证

对上述基因芯片上每条特异探针的多个重复点的信号强度进行置信度检验，剔除异常的信号强度，取正常的信号强度的平均值作为每条特异探针的信号强度；

2)归一化

使用特异探针总体荧光强度值作为归一化标准，用每点的荧光强度去除以归一化标准，将每点的绝对荧光强度变为相对荧光强度；

3)对每个特异探针打分

根据相对荧光强度，对每个特异探针给出一个分值，代表样品的DNA片段序列和该特异探针序列的相似程度；

4)应用模式对样品中可能含有的物种进行打分

将某一物种所有相关探针分值的加权平均值作为该物种的分值；

5)判断样品中可能有的物种

经过上述步骤处理，程序给样品中所有可能的物种均给出一个分值，分值最高的即为最有可能存在的物种，分值低于阈值的物种不可能存在。

本发明还提供了一种检测肠道重要致病菌的试剂盒，该试剂盒至少包括基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中，寡核苷酸探针至少含有从一种或几种肠道重要致病菌的O-抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因选取的DNA片段和从志贺氏菌和大肠杆菌16S rRNA保守区选取的DNA片段。

在本发明的一实施例中，上述检测肠道重要致病菌的试剂盒还包括PCR扩增引物，这些PCR扩增引物选自具有如SEQ ID NO：51-NO：82所示的碱基序列的寡核苷酸片段。

在本发明的一实施例中，上述检测肠道重要致病菌的试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件Bactarray Analyzer。

由上述公开的技术方案可见，利用本发明的基因芯片可以达到检测常见肠道重要致病菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，故既适用于常规血清型检测，又适用于实验室研究，将会具有深远意义。

此发明弥补了基因芯片根据O-抗原基因簇上特异序列设计探针检测肠道重要致病菌领域的空白，提供了快速、准确的鉴定重要肠道致病菌的方法。大大缩短了检测时间，简化了检测方法，提高了检测准确性。目前国内针对致病菌检测方面的基因芯片均为对细菌种的鉴别(专利号CN1536090A)，此发明可鉴别到具体的血清型，可更准确的指导医疗用药。此外由于本发明具备极高的灵敏度和特异性，且其检测和分析方法高效快捷，所以可被广泛用于生命科学、医学检验、食品安全、环境监督、进出口检验检疫、生物恐怖防范、流行病学监控等领域。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图。

图2为本发明基因芯片的一个实施例上52条探针的排布示意图。其中0表示50％DMSO，其余的如表1所示。

图3表示鲍氏志贺氏菌O13与本发明基因芯片的一个实施例杂交的扫描结果。

图4表示痢疾志贺氏菌O10与本发明基因芯片的一个实施例杂交的扫描结果。

图5表示大肠杆菌O111与本发明基因芯片的一个实施例杂交的扫描结果。

图6表示大肠杆菌O114与本发明基因芯片的一个实施例杂交的扫描结果。

图7表示大肠杆菌O128与本发明基因芯片的一个实施例杂交的扫描结果。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的检测肠道重要致病菌的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例加以说明，这些实施例是为了说明而不是以任何形式限制本发明。

实施例一探针的设计和制备

1.序列获得：用Artemis软件整理本实验室测得的和从GenBank等公共数据库下载得到的15型肠道重要致病菌的wzx及wzy序列(鲍氏志贺菌O16为orf5)。

2.探针设计：将获得的基因序列导入OligoArray2.0软件中，设定相应参数(长度为40bp±5bp，Tm值为80℃±2℃)，运行程序在线设计了用于检测肠道重要致病菌15种血清型的寡核苷酸探针共124条。

3.探针选择：通过683次杂交实验进行探针筛选，最终从输出结果中选择得到长度在40bp±5bp，Tm80℃±2℃的特异、灵敏的探针组成本发明基因芯片所需的探针集合。

在本发明的较佳实施例中，选择得到了52条如表1所示的探针。其中SEQ ID NO：1-NO：48的48条探针序列分别选自15种常见肠道重要致病菌(福氏志贺氏菌2a型、宋内氏志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌O7、鲍氏志贺氏菌O9、鲍氏志贺氏菌O13、鲍氏志贺氏菌O16、鲍氏志贺氏菌O18、痢疾志贺氏菌O4、痢疾志贺氏菌O8、痢疾志贺氏菌O10、大肠杆菌O55、大肠杆菌O111、大肠杆菌O114、大肠杆菌O128和大肠杆菌O157)的O-抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因；SEQ ID为NO：49和NO：50的两条探针选自志贺氏菌和大肠杆菌16S rRNA保守区的序列，作为阳性对照；探针编号为n的探针为多聚T片段，用作阴性对照；探针编号为#的探针为荧光探针。

表1：检测肠道重要致病菌的基因芯片上所有探针及其检测作用

  SEQ ID    探针编号     探针序列(5’-3’) 可检测出的肠道重要 致病菌类型  NO：1    1-1     5’-GGGCAGTGTTTCCAAGGTTAAGTAACA     TCAAAGACTTTAA-3’ 福氏志贺氏菌2a型  NO：2    1-2     5’-CGGTTGGATGACAGTAAGTAATATCAT     AAGTCCGGTCATG-3’ 福氏志贺氏菌2a型

  NO：3    2-1  5’-GGCACTGGATTAGGTGTTGCAAATTAT  GTAAAGGCTA-3’  宋内氏志贺氏菌1型  NO：4    2-2  5’-TGATTATCGTCGAGTTGAGTTAGTATTT  ATTGGGGTTGAT-3’  宋内氏志贺氏菌1型  NO：5    2-3  5’-TGGTTCTTTTGGTGTCATTTTGCATTGG  TAAAGATGAGCT-3’  宋内氏志贺氏菌1型  NO：6    3-1  5’-ATTCCACTTCCATCAATCATATCGTTGA  TTATTCCTGCTG-3’  鲍氏志贺氏菌O7  NO：7    3-2  5’-CCCATTGATTTTGCATCAAATAAGTGGC  TTTCTTAAAGGA-3’  鲍氏志贺氏菌O7  NO：8    3-3  5’-CTTGATACTGATAATGGCGTTGAATAA  AGCACTAGTTCCA-3’  鲍氏志贺氏菌O7  NO：9    4-1  5’-TTATCTTGAGTTTAGTCGAATGCAACGA  GTAGTCGCG-3’  鲍氏志贺氏菌O13  NO：10    4-2  5’-TTATTCTCATATTCGAATGTTACTTTTA  CCAGCGCAACTG-3’  鲍氏志贺氏菌O13  NO：11    4-3  5’-GCTGCGGGGAATAGAAATAAGAATCGT  CTGTA TTACTTTA-3’  鲍氏志贺氏菌O13  NO：12    5-1  5’-TTGTATGTAATCGCAAATACTCGCAGT  ACATGTGGA-3’  鲍氏志贺氏菌O16  NO：13    5-2  5’-CCTGAGCGATTAGAACAACTGTATCTC  GAGTCAAGA-3’  鲍氏志贺氏菌O16  NO：14    5-3  5’-GACATGGGAGTGGAATGAAAACTAAA  ATTGCTGAGGCTTT-3’  鲍氏志贺氏菌O16  NO：15    5-4  5’-GTGAGATTGTTGATTGCTTTAGCCGAG  AAGACAAAGATAT-3’  鲍氏志贺氏菌O16  NO：16    6-1  5’-TTTGTCGTGTCTATTGGTATTGTATTCG  GGCAATGG-3’  鲍氏志贺氏菌O18  NO：17    6-2  5’-TGGAGTTCCATTATCCGAGTGGTATTTT  GGTAACAATAAT-3’  鲍氏志贺氏菌O18  NO：18    6-3  5’-TACTCATTAGGCTTGCTATTTACTGGGC  TATTATCAGTTT-3’  鲍氏志贺氏菌O18  NO：19    7-1  5’-TCGCATTGCTTGGTATTAGAGCTGGTAG  TGTTAATT-3’  痢疾志贺氏菌O4  NO：20    7-2  5’-GCAGCTTCTCTTTACATACGTGCATTAT  CAGAAACGGGAA-3’  痢疾志贺氏菌O4  NO：21    7-3  5’-ACTAGTCTAGATAAAATGGCTAGCTCA  GACAATCTTTCTG-3’  痢疾志贺氏菌O4  NO：22    7-4  5’-TGGATATTTAATTCGGCTATTCTCTATA  GCTAGTGAGCCT-3’  痢疾志贺氏菌O4  NO：23    8-1  5’-GAGGGTGTGTATGGTATGATTGATTAC  ATATTGGAGGC-3’  痢疾志贺氏菌O8

  NO：24    8-2  5’-ACTTCAGTTTCTGGGAACGATAAATTC  ACACGTTTGC-3’  痢疾志贺氏菌O8  NO：25    8-3  5’-TTCCTAAATAATCATCCATTTACTGAGG  GTGTGTATGGTA-3’  痢疾志贺氏菌O8  NO：26    8-4  5’-CGCCAATTTATTCTGTGCTATTATCGAA  ATTCACTTCAGT-3’  痢疾志贺氏菌O8  NO：27    9-1  5’-ATGGCACTGATAGTAGCGATAAAACTA  TTTTGATCGGG-3’  痢疾志贺氏菌O10  NO：28    9-2  5’-CGTGCATTAATTGCTATTGTCGTAATTT  CTTTCATTGTGG-3’  痢疾志贺氏菌O10  NO：29    9-3  5’-GGAACACCTTCTTGGGATTATTTTACGC  AACCACTTATTA-3’  痢疾志贺氏菌O10  NO：30    10-1  5′-AGAGTGAGACGAATAATTGGGTGTTAT  ATAAGCTCTC-3′  大肠杆菌O55  NO：31    10-2  5’-GCTTTTGGGGATAACATTATCGATAAT  ACCGACCTTTAGA-3’  大肠杆菌O55  NO：32    10-3  5’-TGAAGCTTTAAAACGTCTAATTATTAGC  GGAACTTTCTTG-3’  大肠杆菌O55  NO：33    11-1  5′-CGGGGATGATATATTATTTGGTTTCACA  GCTTGGTG-3′  大肠杆菌O111  NO：34    11-2  5’-TTACGGTTCTTTATAAGTATTGGTGTGA  TAGGAGCATTGG-3’  大肠杆菌O111  NO：35    11-3  5’-GCTCCTTTCATTGTTGTAAGTTGTTTGT  TACTGTTACA-3’  大肠杆菌O111  NO：36    11-4  5’-TTAAATAACGGCGGACAATATAAGACG  TTATATGGACTTC-3’  大肠杆菌O111  NO：37    12-1  5’-TTATTGTATGCTTGTTAGTGCTTGTGCT  GATTTGTTTTCT-3’  大肠杆菌O114  NO：38    12-2  5’-TGAGATGCTTAAATTAGGTGGATGGAA  TGTTAATGGG-3’  大肠杆菌O114  NO：39    12-3  5’-GTTGTTCATATGCTCAGGGGAAAATCA  GAAGAGTATCTAT-3’  大肠杆菌O114  NO：40    12-4  5’-TGGATGGAATGTTAATGGGTTATTTATT  TCAGAAGCATG-3’  大肠杆菌O114  NO：41    13-1  5′-TCTGATCTTGGATTAAGTAAGATGTACC  CAGCAA-3′  大肠杆菌O128  NO：42    13-2  5’-CGGTGTTTTGCAAGAGATATAAAAGAG  TTAGCTTTAGCAT-3’  大肠杆菌O128  NO：43    13-3  5’-GCTAGGTATTTAGCAAATTCAACAGAT  TTGGCTGACTTTG-3’  大肠杆菌O128  NO：44    14-1  5′-CGATTTCTTTCCGACACCAGAGTTAGAA  AAGGAATT-3′  大肠杆菌O157

  NO：45    14-2   5’-TAGAGCAAGTTGAAAGTGTTCCATATG   TTGTTTCTGAATC-3’  大肠杆菌O157  NO：46    14-3   5’-GTATGCTCGTTGTTTTATCTAAGTTTAG   GACAAGACGGAG-3’  大肠杆菌O157  NO：47    15-1   5’-AACTGAGTTCACTTATGGTTCGAGAAC   CTTTACTCCATTT-3’  鲍氏志贺氏菌O9  NO：48    15-2   5’-GGATTTTAATACAACTGAGTTCACTTAT   GGTTCGAGAACC-3’  鲍氏志贺氏菌O9  NO：49    P-1   5’-CGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGA   TAA-3’  16S rRNA  NO：50    P-2   5’-CGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGA   TAAACTGGAG-3’  16S rRNA    n   5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-   3’  负对照    #   5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_   Cy3-3’  荧光探针

4.探针合成：将表1中的探针5’端延长10个T并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。

实施例二引物的设计和制备

1.序列获得：用Artemis软件整理本实验室测得的和从GenBank等公共数据库下载得到的15型肠道重要致病菌的wzx和wzy序列(鲍氏志贺菌O16为orf5)。

2.设计引物：将获得的基因序列导入引物设计软件Primer Premier5.0软件中，设定相应参数(长度为20bp±2bp，Tm值为50℃±5℃)后运行程序。

3.引物选择：从输出结果中选取Tm值50℃±5℃，长度20bp±2bp，包含基因芯片中所用的探针序列在内的引物。个别探针需手动调节，引物适当加长或缩短几个碱基，使其包含探针、符合Tm值50℃±5℃及其它参数。

在本发明的优选实施例中，为适应Multiplex PCR，经生物信息学初筛并通过大量Multiplex PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物32条。

表2扩增所用全部引物

  SEQ ID    引物编号      引物序列(5’-3’)         扩增作用  NO：51    P-1      5’-GTGTTGACTGCTGGATTTC-3’         鲍氏志贺氏菌O7wzx上游引物  NO：52    P-2      5’-CGATATGATTGATGGAAGTG-3’         鲍氏志贺氏菌O7wzx下游引物  NO：53    P-3      5’-GCGTTGGTTGGTGAAAGAG-3’         鲍氏志贺氏菌O9wzy上游引物  NO：54    P-4      5’-TTCCCACAAATCAAACCA-3’         鲍氏志贺氏菌O9wzy下游引物  NO：55    P-5      5’-AAAGATTGGTAGCGTCGG-3’         鲍氏志贺氏菌O13wzy上游引物  NO：56    P-6      5’-TGAAGCCCTGGTAAAGTGC-3’         鲍氏志贺氏菌O13wzy下游引物  NO：57    P-7      5’-CCATACGGATAATGTTGAG-3’         鲍氏志贺氏菌O16orf5上游引物  NO：58    P-8      5’-TCTTTGTCTTCTCGGCTA-3’         鲍氏志贺氏菌O16orf5下游引物  NO：59    P-9      5’-CAGGGCACAAACTATCT-3’         鲍氏志贺氏菌O18wzx上游引物  NO：60    P-10      5’-TAATTCGGAATGTGCT-3’         鲍氏志贺氏菌O18wzx下游引物  NO：61    P-11      5’-TTTCTGCTTATTCATTATTG-3’         痢疾志贺氏菌O4wzy上游引物  NO：62    P-12      5’-ACTACCAGCTCTAATACC-3’         痢疾志贺氏菌O4wzy下游引物  NO：63    P-13      5’-TTCCCTCTTGTTGTATTGA-3′         痢疾志贺氏菌O8wzy上游引物  NO：64    p-14      5’-ACCTTTATCAATTGCCTCC-3′         痢疾志贺氏菌O8wzy下游引物  NO：65    P-15      5’-CGCTGTTTCTATATTAATTG-3’         痢疾志贺氏菌O10wzy上游引物  NO：66    P-16      5’-AATTGAAGTGACCAGATAAC-3′         痢疾志贺氏菌O10wzy下游引物  NO：67    P-17      5’-TGAGGTTTCACGTTTCTC-3’         宋内氏志贺氏菌1型wzy上游引物  NO：68    P-18      5’-AATAATCCCTAACTGAGCC-3′         宋内氏志贺氏菌1型wzy下游引物  NO：69    P-19      5’-CACTTGTTGGGTATGCTGG-3’         福氏志贺氏菌2a型wzx上游引物  NO：70    P-20      5’-CCGGCAAACAGATTAGAAA-3’         福氏志贺氏菌2a型wzx下游引物  NO：71    P-21      5’-GGGAGGAGTATTATCATTAC-3′         大肠杆菌O55wzy上游引物

  NO：72    P-22  5’-ATCAATCTAAAGGTCGGTA-3′  大肠杆菌O55wzy下游引物  NO：73    P-23  5’-TTAATGCGGA GGATCTATT-3′  大肠杆菌O111wzy上游引物  NO：74    P-24  5’-GTAAGCCCGCAAATCAATC-3′  大肠杆菌O111wzy下游引物  NO：75    P-25  5’-ACTTTCCCAAGCCCATTA-3′  大肠杆菌O114wzy上游引物  NO：76    P-26  5’-CAGCACAAGCACTAACAAG-3′  大肠杆菌O114wzy下游引物  NO：77    P-27  5’-ATGATTTCTTACGGAGTGC-3’  大肠杆菌O128wzy上游引物  NO：78    P-28  5’-CTCTAACCTAATCCCTCCC-3’  大肠杆菌O128wzy 下游引物  NO：79    P-29  5’-TTGCTGCTGTAGTTTTATTTCTT-3′  大肠杆菌O157wzy上游引物  NO：80    P-30  5′-TGATGCTTTATTCCCTGTATTCT-3′  大肠杆菌O157wzy下游引物  NO：81    P-31  5′-CACGGGTGAGTAATGTCTGG-3′  16S rRNA上游引物  NO：82    P-32  5′-ATCCACGATTACTAGCGATTCC-3′  16S rRNA下游引物

4.引物合成：将表2中的引物序列送引物合成公司(北京奥科)委托合成，备用。

实施例三芯片点样

将合成好的探针干粉管(由奥科合成)首先进行溶解。步骤如下：12000转/分钟，离心5分钟(注意在离心前不要打开干粉管的盖子)，加入50％DMSO(以1OD加入14μl的比例加入)，用振荡器混匀后快速离心，将管壁上的液体离下。在室温下放置1小时后，取1μl用50％DMSO稀释180倍后测OD，测出该探针(单链)的核酸浓度(ng/μl)，再利用公式将该探针稀释成终浓度为1μg/μl。

公式：

将52条探针加入到384孔板中相应的位置，每孔加入10μl探针。利用自动点样仪将384孔板中的探针点到玻片上，形成我们所设计好的微阵列。该芯片利用的是PerkiElmer公司的SpotArray microarry printing system基因芯片点样仪(型号为SpotArray 72)，使用SpotArray控制软件(tele chemsmp3 stealtypin)完成全部点样。将图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净醛基化玻片(CEL Associates，Inc.)作为固相载体放到芯片点样仪的载物台上，加好探针的384孔板放到样品台处。启动SpotArray控制软件，设置好相应的参数，开始点样，将52条寡核苷酸探针以图2所示的排布规律点到玻片上3mm×3mm的点样区内，构成中低密度DNA微阵列，其中每个探针点为对应表1所示的探针编号的探针(0表示50％DMSO)，玻片上的四个点样区内阵列的排布规律相同，如图1所示其中每个点阵间相距13.5mm，第一个微阵列距玻片顶端11.5mm，第四个微阵列距白色磨边处3 mm。在点样过程中，机臂控制针头，每点一个样品要经上样、预点、正式点样、清洗、干燥几个过程。点好的芯片在室温下过夜干燥，然后45℃烘箱干燥2小时。再利用UVP公司的交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)进行紫外交联，600J两次。交联好的芯片放回洁净的芯片盒中，以备使用。

实施例四检测肠道重要致病菌的基因芯片的操作方法

在利用上述制备好的基因芯片检测肠道重要致病菌的方法中，本发明对检测步骤、检测条件等因素均作了一系列的实验摸索，如Multiplex PCR反应混合物中各成分比例，PCR循环条件，杂交温度，杂交时间等及主要试剂配方，如杂交液，洗液等(配方详见以下实施例)。其中PCR反应混合物中的各个成分，尤其引物间比例，Buffer的选择，Taq酶浓度，荧光素的种类及用量，及模板浓度均为多次对比实验后得到的最优组合。PCR所采用的退火温度、时间及延伸时间，循环数目亦为梯度实验后选出的优良条件。杂交温度经40℃、50℃、60℃三个温度梯度实验，最终选择40℃。杂交时间在经验基础上做了1.5h、8h、14h、16h、18h五个时间梯度实验，最终选择16h。肠道重要致病菌检测芯片的实验流程亦为优化后结果，在保证本发明顺利实现的基础上，本实施例最终选择了一步Multiplex PCR法，大大缩短了检测的时间，简化了检测方法。以下为利用上述制备好的基因芯片检测肠道重要致病菌的较佳实施例，具体说明如下：

1.Multiplex PCR扩增取1μl(100ng/μl)欲检测的基因组DNA(Bastin DA，Reeves PR.Sequenceand analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene1995；164：17-23.)加到Multiplex PCR Mix中混匀(注意：此过程要避光)。Multiplex PCR Mix配方见表3，体系总体积为30μl，其中dNTP Mixture来自上海生工D0056，Taq酶、PCR buffer来自Takara DDR100DM，Cy3-dutp来自Amersham PA53022。

表3.Multiplex PCR Mix配方

      成分    浓度    加样量      灭菌超纯水    ----    5.9μl      10×Buffer    10×    3μl      dNTP    10mM    0.3μl      P₁～P₃₀    约7μM    各0.6μl      P₃₁～P₃₂    约2.4μM    各0.6μl      Taq    5u/μl    0.3μl      Cy3-dutp    1mM    0.3μl

将以上混合液放入到PCR仪中，执行以下程序：

95℃  5min

95℃  30sec

50℃  45sec

72℃  1min返回第二步进行35个循环

72℃  5min

2.杂交

将上述PCR扩增产物取出15μl放到65℃烘箱中烘干(要避光)，烘干后加入40℃预热的杂交液13μl，用移液器将其吹匀后放入PCR仪中98℃变性10min。

将交联好的芯片用灭菌双蒸水冲洗1分钟后吹干，放在避光处备用。打开杂交盒在其暗格中加入50μl灭菌超纯水，放入洗好的芯片，点有探针的那面向上并盖好盖片。(注意：盖片有凸起的一面朝下，使盖片的加样孔朝向操作者，切勿放反)。将变性好的反应液从PCR仪中取出迅速的加入相应的加样孔中，盖好杂交盒的盖子，将杂交盒放到40℃水浴中杂交16小时(注意：杂交过程中要避光)。芯片杂交完毕后，从水浴锅中取出杂交盒，取走盖片，将芯片分别在洗液A中洗3min，洗液B中洗3min，最后在洗液C即95％乙醇中洗1.5min，吹干后放到避光处以备扫描。

各溶液的配方如下：

洗液A： 1×SSC，10％SDS

洗液B： 0.05×SSC

洗液C： 95％乙醇

杂交液：10％dextran Sulfate；25％formamide；

        0.1％SDS；6×SSPE

3.扫描

打开AXON公司的扫描仪(Gene Pix 4100A)，并使机器预热15分钟。将芯片放到扫描仪中(点有探针的一面朝下)后盖好扫描仪的盖子，启动Gene Pix Pro 6.0扫描程序。选用532通道，GMT值设定为650进行扫描。分别将扫描的图片保存为.jpg和.gif两种格式。

利用上述制备好的基因芯片分别检测样品为鲍氏志贺氏菌O13、痢疾志贺氏菌O10、大肠杆菌O111、大肠杆菌O114和大肠杆菌O128时的杂交扫描结果分别如图3、图4、图5、图6和图7所示。

4.结果分析

上述肠道重要致病菌检测芯片的检测结果是扫描得到的一张图片，其中每个探针点的亮度代表着该点的杂交结果。对于探针点较少的芯片，检测结果可由肉眼判断。然而，对于数据点较多的芯片使用肉眼判断即不客观也不现实。为了客观、准确的对检测芯片的结果进行分析，本发明提供了一个计算机判读程序——Bactarray Analyzer。

该计算机判读程序Bactarray Analyzer基于Microsoft.NET Framwork开发，是一个界面友好、易于使用的程序。用户只需将芯片扫描仪扫描并套圈得到的荧光数据文件导入分析程序，进行简单设定后点击处理即可获得分析结果。

在芯片杂交完毕之后，荧光标记的目标DNA片段已被固定在芯片的特异探针上。使用芯片扫描仪可以看到探针的荧光图像，荧光的强弱代表着该点杂交情况的优劣，也就是目标DNA序列片段和该点特异探针DNA序列的相似性。在经过套圈分析之后，每个点的荧光强度值被读取并存储为本程序可处理的荧光强度文件。(不同型号的扫描仪命名规则不同，如AXON公司的Genpix Personal 4100A型扫描仪存储为.GPR文件，博奥生物芯片有限公司的晶芯LuxScan-10K/A微阵列芯片扫描仪存储为.LSR文件)本软件的处理均针对荧光强度文件。

由于芯片的杂交过程中受到的影响因素很多，而且实际使用时病人的目标DNA片段的序列和理论上的序列可能存在部分差异。因此，在实际处理时，本软件做了如下处理：

1)荧光信号的有效性验证

对于每条特异探针，芯片上均点了若干重复点。在处理时，软件会先对这些重复点的荧光强度进行置信度检验，剔除荧光素沉积、芯片划伤、探针部分脱落等原因造成的荧光强度异常，然后取剩余正常荧光点的荧光强度的平均值作为该特异探针的荧光信号强度。

2)归一化

在对数据进行进一步处理之前，软件还需要消除由于待测样品中DNA量、荧光素标记情况等带来的总体荧光强度上的差异，即对荧光强度数据的归一化。在实际处理过程中，本软件使用特异探针总体荧光强度值作为归一化标准，即：用每点的荧光强度去除以归一化标准，将每点的绝对荧光强度变为相对荧光强度，从而使不同时间、不同条件下进行的试验具有可比性。

3)对每个特异探针打分

经过上述处理，特异探针的荧光强度已变为可比较的相对荧光强度，但本软件并未简单的断定样品中是否存在该特异序列，而是针对每个特异探针给出一个分值，代表样品的DNA片段序列和该特异探针序列的相似程度。

4)应用模式对样品中可能含有的物种进行打分

这里的“模式”指的是存储物种与其相关的特异探针之间的对应关系的模式文件，该文件按照XML(扩展标记语言)1.0标准编写，不同类型的芯片有各自不同的模式。模式文件中保存了该类型芯片的一些基本信息以及该芯片所能检测的所有物种与其相关特异探针之间的对应关系。在对物种进行打分时，本软件会统计该物种所有相关探针的分值，而该物种的分值为所有相关探针分值的加权平均值。

5)判断样品中可能有的物种

经过上述步骤的处理，程序给样品中所有可能的物种均给出一个分值，分值最高的即为最有可能存在的物种，分值低于阈值的物种不可能存在。

利用上述Bactarray Analyzer软件判读上述杂交结果的具体操作步骤如下：

运行Bactarray Analyzer 1.0程序，并输入用户名、密码。点击工具栏上的“新建项目”按钮新建一个项目，然后按“添加多个文件”导入待分析的.GPR文件。按下Ctrl键，可同时选择并打开多个文件。

在“文件列表”中选中相应的文件，然后点击“阳性对照”、“阴性对照”按钮指定该文件的类型，未指定者默认为待测样品等。一个项目中必须含有一个阳性对照和一个阴性对照两组数据。可按实际需要更改“样本来源”、“样本编号”等字段。点击“处理数据”按钮，软件将会自动生成一个处理过程的记录文件。在“文件列表”页面点击文件名，报告页面会自动切换到该文件的分析结果报告。分析结果报告已被自动保存在本项目所在目录之下。

结果判读：报告给出送检文件名称、样品来源、芯片类型、结果、菌名、分值、特异探针杂交率、对照品情况、出现问题的可能原因分析、荧光强度、软件判读日期、软件操作人等信息。其中，“结果”项即为检测样品中存在的肠道重要致病菌类型。

实施例五：对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测

1、特异性实验

检测范围包括以下三类菌株：

1)属于此10型志贺氏菌及5型大肠杆菌的志贺氏菌19株、大肠杆菌11株；

2)与此10型志贺氏菌及5型大肠杆菌亲缘关系较近的志贺氏菌50株、大肠杆菌30株、沙门氏菌2株；

3)其它常见肠道致病菌：蜡样芽孢杆菌2株、金色葡萄球菌2株、霍乱弧菌DNA2份。

针对每个菌株做3次平行实验。其中对于检测范围内的10型志贺氏菌及5型大肠杆菌应得到的杂交扫描结果为：如图3、图4、图5、图6和图7所示的待检测细菌相应的特异探针、正对照探针和荧光探针得到阳性信号；计算机判读程序——Bactarray Analyzer给出的判读结果为：检测到某一型的细菌。

对于亲缘关系较近的志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌应得到的杂交扫描结果为：只有正对照探针和荧光探针得到阳性信号；计算机判读程序——Bactarray Analyzer给出的判读结果为：检测到细菌但不在检测范围内。

其它常见肠道致病菌应得到的杂交扫描结果为：只有荧光探针得到阳性信号；计算机判读程序——Bactarray Analyzer给出的判读结果为：未检测到志贺氏菌和大肠杆菌。

检测结果：均得到正确的检测结果。

2、灵敏度实验

检测范围包括：检测范围内的10种志贺氏菌的19株不同时间和地点分离到的分离株，及检测范围内的5种大肠杆菌的11株分离株。针对每个菌株做3次平行实验。将欲检测的模板以10ng、50ng、100ng及500ng四个梯度加入到PCR体系中进行反应并最终得到软件判读结果。能够得到正确且稳定的检测结果的最低模板量即为其灵敏度的值。

检测结果：此型芯片以DNA为起始检测标本的检测灵敏度为50ng。

综上所述，本发明根据肠道重要致病菌的O-抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因设计出特异的核苷酸探针，并固定在芯片载体上制成基因芯片。同时针对肠道重要致病菌的O-抗原基因簇上的寡糖单位处理酶基因或糖基转移酶基因设计引物，对待检测样品的基因组DNA进行PCR扩增，然后将扩增产物与上述基因芯片进行杂交反应，最后利用基因芯片信号分析设备及软件，就可以检测出样品中存在的致病菌情况。本发明的优点在于：继承和发展了传统的血清学检测方法，并且弥补了传统检测的不足，使检测过程变得快速、灵敏且准确率高。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

               序列表

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>检测肠道重要致病菌的基因芯片及其检测方法和检测试剂盒

<130>5P99011-CN

<160>82

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌2a型(Shigella Flexneri 2a)

<400>1

gggcagtgtt tccaaggtta agtaacatca aagactttaa                           40

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌2a型(Shigella Flexneri 2a)

<400>2

cggttggatg acagtaagta atatcataag tccggtcatg                           40

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>宋内氏志贺氏菌1型(Shigella sonnei)

<400>3

ggcactggat taggtgttgc aaattatgta aaggcta                              37

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>宋内氏志贺氏菌1型(Shigella sonnei)

<400>4

tgattatcgt cgagttgagt tagtatttat tggggttgat                           40

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>宋内氏志贺氏菌1型(Shigella sonnei)

<400>5

tggttctttt ggtgtcattt tgcattggta aagatgagct                           40

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O7(Shigella boydii O7)

<400>6

attccacttc catcaatcat atcgttgatt attcctgctg                           40

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O7(Shigella boydii O7)

<400>7

cccattgatt ttgcatcaaa taagtggctt tcttaaagga                           40

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O7(Shigella boydii O7)

<400>8

cttgatactg ataatggcgt tgaataaagc actagttcca                           40

<210>9

<211>37

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O13(Shigella boydii O13)

<400>9

ttatcttgag tttagtcgaa tgcaacgagt agtcgcg                              37

<210>10

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O13(Shigella boydii O13)

<400>10

ttattctcat attcgaatgt tacttttacc agcgcaactg                           40

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O13(Shigella boydii O13)

<400>11

gctgcgggga atagaaataa gaatcgtctg tattacttta                           40

<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O16(Shigella boydii O16)

<400>12

ttgtatgtaa tcgcaaatac tcgcagtaca tgtgga                               36

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O16(Shigella boydii O16)

<400>13

cctgagcgat tagaacaact gtatctcgag tcaaga                               36

<210>14

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O16(Shigella boydii O16)

<400>14

gacatgggag tggaatgaaa actaaaattg ctgaggcttt                           40

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O16(Shigella boydii O16)

<400>15

gtgagattgt tgattgcttt agccgagaag acaaagatat                           40

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O18(Shigella boydii O18)

<400>16

tttgtcgtgt ctattggtat tgtattcggg caatgg                                36

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O18(Shigella boydii O18)

<400>17

tggagttcca ttatccgagt ggtattttgg taacaataat                            40

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O18(Shigella boydii O18)

<400>18

tactcattag gcttgctatt tactgggcta ttatcagttt                            40

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O4(Shigella dysenteriae O4)

<400>19

tcgcattgct tggtattaga gctggtagtg ttaatt                                36

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O4(Shigella dysenteriae O4)

<400>20

gcagcttctc tttacatacg tgcattatca gaaacgggaa                            40

<210>21

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O4(Shigella dysenteriae O4)

<400>21

actagtctag ataaaatggc tagctcagac aatctttctg                            40

<210>22

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O4(Shigella dysenteriae O4)

<400>22

tggatattta attcggctat tctctatagc tagtgagcct                            40

<210>23

<211>38

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O8(Shigella dysenteriae O8)

<400>23

gagggtgtgt atggtatgat tgattacata ttggaggc                              38

<210>24

<211>37

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O8(Shigella dysenteriae O8)

<400>24

acttcagttt ctgggaacga taaattcaca cgtttgc                               37

<210>25

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O8(Shigella dysenteriae O8)

<400>25

ttcctaaata atcatccatt tactgagggt gtgtatggta                            40

<210>26

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O8(Shigella dysenteriae O8)

<400>26

cgccaattta ttctgtgcta ttatcgaaat tcacttcagt                            40

<210>27

<211>38

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O10(Shigella dysenteriae O10)

<400>27

atggcactga tagtagcgat aaaactattt tgatcggg                             38

<210>28

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O10(Shigella dysenteriae O10)

<400>28

cgtgcattaa ttgctattgt cgtaatttct ttcattgtgg                           40

<210>29

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O10(Shigella dysenteriae O10)

<400>29

ggaacacctt cttgggatta ttttacgcaa ccacttatta                           40

<210>30

<211>37

<212>DNA

<213>大肠杆菌O55(E.coli O55)

<400>30

agagtgagac gaataattgg gtgttatata agctctc                              37

<210>31

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O55(E.coli O55)

<400>31

gcttttgggg ataacattat cgataatacc gacctttaga                           40

<210>32

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O55(E.coli O55)

<400>32

tgaagcttta aaacgtctaa ttattagcgg aactttcttg                           40

<210>33

<211>36

<212>DNA

<213>大肠杆菌O111(E.coli O111)

<400>33

cggggatgat atattatttg gtttcacagc ttggtg                               36

<210>34

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O111(E.coli O111)

<400>34

ttacggttct ttataagtat tggtgtgata ggagcattgg                           40

<210>35

<211>38

<212>DNA

<213>大肠杆菌O111(E.coli O111)

<400>35

gctcctttca ttgttgtaag ttgtttgtta ctgttaca                             38

<210>36

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O111(E.coli O111)

<400>36

ttaaataacg gcggacaata taagacgtta tatggacttc                           40

<210>37

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O114(E.coli O114)

<400>37

ttattgtatg cttgttagtg cttgtgctga tttgttttct                           40

<210>38

<211>37

<212>DNA

<213>大肠杆菌O114(E.coli O114)

<400>38

tgagatgctt aaattaggtg gatggaatgt taatggg                              37

<210>39

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O114(E.coli O114)

<400>39

gttgttcata tgctcagggg aaaatcagaa gagtatctat                           40

<210>40

<211>39

<212>DNA

<213>大肠杆菌O114(E.coli O114)

<400>40

tggatggaat gttaatgggt tatttatttc agaagcatg                            39

<210>41

<211>34

<212>DNA

<213>大肠杆菌O128(E.coli O128)

<400>41

tctgatcttg gattaagtaa gatgtaccca gcaa                                 34

<210>42

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O128(E.coli O128)

<400>42

cggtgttttg caagagatat aaaagagtta gctttagcat                           40

<210>43

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O128(E.coli O128)

<400>43

gctaggtatt tagcaaattc aacagatttg gctgactttg                           40

<210>44

<211>36

<212>DNA

<213>大肠杆菌O157(E.coli O157)

<400>44

cgatttcttt ccgacaccag agttagaaaa ggaatt                               36

<210>45

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O157(E.coli O157)

<400>45

tagagcaagt tgaaagtgtt ccatatgttg tttctgaatc                           40

<210>46

<211>40

<212>DNA

<213>大肠杆菌O157(E.coli O157)

<400>46

gtatgctcgt tgttttatct aagtttagga caagacggag                           40

<210>47

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O9(Shigella boydii O9)

<400>47

aactgagttc acttatggtt cgagaacctt tactccattt                           40

<210>48

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O9(Shigella boydii 09)

<400>48

ggattttaat acaactgagt tcacttatgg ttcgagaacc                           40

<210>49

<211>30

<212>DNA

<213>志贺氏菌和大肠杆菌

<400>49

cgggaactca aaggagactg ccagtgataa                                      30

<210>50

<211>37

<212>DNA

<213>志贺氏菌和大肠杆菌

<400>50

cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggag                              37

<210>51

<211>19

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O7(Shigella boydii O7)

<400>51

gtgttgactg ctggatttc                                                  19

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O7(Shigella boydii O7)

<400>52

cgatatgatt gatggaagtg                                                 20

<210>53

<211>19

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O9(Shigella boydii O9)

<400>53

gcgttggttg gtgaaagag                                                  19

<210>54

<211>18

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O9(Shigella boydii O9)

<400>54

ttcccacaaa tcaaacca                                                   18

<210>55

<211>18

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O13(Shigella boydii O13)

<400>55

aaagattggt agcgtcgg                                                   18

<210>56

<211>19

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O13(Shigella boydii O13)

<400>56

tgaagccctg gtaaagtgc                                                  19

<210>57

<211>19

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O16(Shigella boydii O16)

<400>57

ccatacggat aatgttgag                                                  19

<210>58

<211>18

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O16(Shigella boydii O16)

<400>58

tctttgtctt ctcggcta                                                   18

<210>59

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<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O18(Shigella boydii O18)

<400>59

cagggcacaa ac tatct                                                   17

<210>60

<211>16

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌O18(Shigella boydii O18)

<400>60

taattcggaa tgtgct                                                     16

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<211>20

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O4(Shigella dysenteriae O4)

<400>61

tttctgctta ttcattattg                                                 20

<210>62

<211>18

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O4(Shigella dysenteriae O4)

<400>62

actaccagct ctaatacc                                                   18

<210>63

<211>19

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O8(Shigella dysenteriae O8)

<400>63

ttccctcttg ttgtattga                                                  19

<210>64

<211>19

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O8(Shigella dysenteriae O8)

<400>64

acctttatca attgcctcc                                                  19

<210>65

<211>20

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O10(Shigella dysenteriae O10)

<400>65

cgctgtttct atattaattg                                                 20

<210>66

<211>20

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌O10(Shigella dysenteriae O10)

<400>66

aattgaagtg accagataac                                             20

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<211>18

<212>DNA

<213>宋内氏志贺氏菌1型(Shigella sonnei)

<400>67

tgaggtttca cgtttctc                                               18

<210>68

<211>19

<212>DNA

<213>宋内氏志贺氏菌1型(Shigella sonnei)

<400>68

aataatccct aactgagcc                                              19

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<211>19

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌2a型(Shigella Flexneri 2a)

<400>69

cacttgttgg gtatgctgg                                              19

<210>70

<211>19

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌2a型(Shigella Flexneri 2a)

<400>70

ccggcaaaca gattagaaa                                              19

<210>71

<211>20

<212>DNA

<213>大肠杆菌O55(E.coli O55)

<400>71

ggaggagta ttatcattac                                              20

<210>72

<211>19

<212>DNA

<213>大肠杆菌O55(E.coli O55)

<400>72

atcaatctaa aggtcggta                                              19

<210>73

<211>19

<212>DNA

<213>大肠杆菌O111(E.coli O111)

<400>73

ttaatgcgga ggatctatt                                              19

<210>74

<211>19

<212>DNA

<213>大肠杆菌O111(E.coli O111)

<400>74

gtaagcccgc aaatcaatc                                              19

<210>75

<211>18

<212>DNA

<213>大肠杆菌O114(E.coli O114)

<400>75

actttcccaa gcccatta                                               18

<210>76

<211>19

<212>DNA

<213>大肠杆菌O114(E.coli O114)

<400>76

cagcacaagc actaacaag                                              19

<210>77

<211>19

<212>DNA

<213>大肠杆菌O128(E.coli O128)

<400>77

atgatttctt acggagtgc                                              19

<210>78

<211>19

<212>DNA

<213>大肠杆菌O128(E.coli O128)

<400>78

ctctaaccta atccctccc                                                  19

<210>79

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<212>DNA

<213>大肠杆菌O157(E.coli O157)

<400>79

ttgctgctgt agttttattt ctt                                             23

<210>80

<211>23

<212>DNA

<213>大肠杆菌O157(E.coli O157)

<400>80

tgatgcttta ttccctgtat tct                                             23

<210>81

<211>20

<212>DNA

<213>志贺氏菌和大肠杆菌

<400>81

cacgggtgag taatgtctgg                                                 20

<210>82

<211>22

<212>DNA

<213>志贺氏菌和大肠杆菌

<400>82

atccacgatt actagcgatt cc                                              22