羟基取代的脱氧安息香衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂的用途

摘要

本发明涉及新型水溶性抗氧化剂，更具体涉及羟基取代的脱氧安息香衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂的用途。本发明的新型水溶性抗氧化剂通过邻苯三酚或间苯二酚与对羟基苯乙酸的反应以及随后的磺化和成盐而制备。本发明的新型水溶性抗氧化剂可以较好地清除羟基自由基和超氧阴离子自由基。

说明书

发明领域

本发明新型水溶性抗氧化剂，更具体地涉及羟基取代的脱氧安息香衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂的用途。

发明背景

随着科学研究的不断发展，人们逐渐认识到自由基与疾病(如炎症、动脉粥样硬化、心肌梗塞、休克、中毒、肿瘤、突变、衰老等)密切相关，因而自由基的研究日益受到人们的重视。在生物体正常的代谢过程中，氧化还原反应是最常见的反应，氧是生物体内的受电子体，在反应过程中，由于其获得的电子数的不同，可以产生不同的自由基，根据氧化性及其程度的不同，一般将自由基分为氧自由基和脂质自由基两类。其中氧自由基是与人体关系最为密切的自由基，它是活性氧衍生物，主要包括超氧阴离子自由基(O₂^-·)、羟基自由基(·OH)等，其中以O₂^-·形成最早，·OH作用最强。超氧阴离子自由基O₂^-·是生物体内一类重要的活性氧自由基，它对生物分子(如脂质、蛋白质、核酸、色素等)的损伤是广泛和多层次的，大量的研究表明，O₂^-·可以使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类发生氧化，与机体的许多功能障碍和疾病的发生(如：吞噬、解毒、炎症、衰老、肿瘤、辐射损伤等)有着密切的关系。此外它还可以经过一系列反应生成其它自由基，从而引发一系列疾病。但在动物生命的氧化代谢中总会不断产生超氧阴离子自由基(O₂^-·)，细胞中的一些膜性结构如线粒体、内质网、过氧化物体、细胞膜等都包含氧化酶系、电子传递酶系或过氧化氢酶系。这些酶系在催化其相应的底物过程中以不同形式释放出自由基，此外空气中紫外线、X射线照射、高温以及空气中烟尘污染也能促使人体中产生O₂^-·自由基。O₂^-·自由基还能诱发诸如冠心病、动脉硬化、肿瘤等多种疾病。·OH带有一个不成对电子，性质极活泼，其反应性和毒性都很强，对生物体的损害也最大，它是造成组织细胞损伤的重要活性氧之一，氧化能力很强，可以发生电子转移，参与夺氢反应和羟基化等反应。它可以引起膜过氧化、蛋白质交联变性、核酸损伤等，氧化糖类、氨基酸和脂类而使它们遭受损伤和破坏。另外，羟基自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关，是公认的毒性最大的自由基之一。这些氧自由基也可以导致细胞结构和功能的破坏。因此，它们是人类衰老和许多疾病如癌症、多发性硬化症、帕金森疾病、自身免疫疾病、局部缺血、贫血症、老年痴呆病和慢性肺炎等的重要诱因。所以，寻找能够有效清除自由基而无毒副作用的物质一直是学者们研究的课题之一。

目前已有的可以用作抗氧化剂的药物主要是一些天然产物如丹参、当归的提取物，但是由于其提取十分麻烦，而且由于其分子结构的限制，水溶性和脂溶性都不理想，导致在临床应用中存在一些弊端，如生物利用度不高，服用量大，制成的片剂或胶囊在体内吸收缓慢，7～14天才能见到有限的效果，因此寻找水溶性好、抗氧化能力强和生物利用度高的抗氧化剂具有重大的现实意义和深远的社会意义。

发明概述

本发明的一般目的是提供新型水溶性抗氧化剂，其抗氧化能力强且生物利用度高。

本发明的更具体的目的是提供水溶性的脱氧安息香衍生物，其抗氧化能力强且生物利用度高，因此适合用作抗氧化剂。

本发明的另一目的是提供一种制备上述脱氧安息香衍生物的方法。

本发明的又一目的是提供上述脱氧安息香衍生物作为抗氧化剂的用途。

本发明的这些和其他目的、特征和优点在阅读完本说明书之后将变得更加明了。

发明详述

本发明的脱氧安息香衍生物由如下通式表示：

其中X为氢或羟基，且M为碱金属或碱土金属离子，优选钠离子、钾离子、钙离子、镁离子等。

更具体地说，当上述通式中的X为氢时，本发明的脱氧安息香衍生物为3-磺酸基-2’，4，4’-三羟基脱氧安息香金属盐且对应于下式：

其中M如上所定义。

当上述通式中的X为羟基时，本发明的脱氧安息香衍生物为3-磺酸基-2’，3’，4，4’-四羟基脱氧安息香金属盐且对应于下式：

其中M如上所定义。

本发明的新型抗氧化剂的制备方法包括2’，4，4’-三羟基脱氧安息香(L1)和2’，3’，4，4’-四羟基脱氧安息香(L2)的合成和磺化，由此引入磺酸基，得到水溶性极好的抗氧化剂3-磺酸基-2’，4，4’-三羟基脱氧安息香金属盐(L3)和3-磺酸基-2’，3’，4，4’-四羟基脱氧安息香金属盐(L4)。具体反应过程如下：

具体而言，3-磺酸基-2’，4，4’-三羟基脱氧安息香金属盐(L3)和3-磺酸基-2’，3’，4，4’-四羟基脱氧安息香金属盐(L4)的制备可以按如下方式进行：首先使对羟基苯乙酸与间苯二酚或焦性没食子酸(邻苯三酚)反应，得到2’，4，4’-三羟基脱氧安息香(L1)或2’，3’，4，4’-四羟基脱氧安息香(L2)，然后使L1或L2与浓硫酸反应并加入碱金属或碱土金属化合物使磺基成盐，由此得到L3或L4。在L3或L4的制备中，对羟基苯乙酸和间苯二酚或邻苯三酚基本以化学计量比使用，但对羟基苯乙酸也可以过量使用，例如以1∶1-3∶1的摩尔比使用。在L3或L4的制备中，对羟基苯乙酸与间苯二酚或邻苯三酚的反应通常在作为溶剂和催化剂的BF₃·Et₂O中进行，所述BF₃·Et₂O的用量基于对羟基苯乙酸的重量为10-20倍。该反应通常在惰性气体如氮气、氩气、氦气等，优选氮气保护下于50-100℃，优选70-90℃下进行0.5-8小时，优选1-6小时。在对羟基苯乙酸与间苯二酚或邻苯三酚的反应结束之后，可以按常规后处理方法处理所得反应混合物。例如，可以通过旋转蒸发器回收BF₃·Et₂O，并将残余物倒入冰水中，静置，过滤出沉淀，用碳酸氢钠水溶液洗涤并将洗涤之后的产物用体积比为1∶1的乙醇/水重结晶，由此得到提纯的L1或L2。然后使用浓硫酸将所得L1或L2磺化并加入碱金属或碱土金属化合物成盐，由此得到L3或L4。在所述磺化反应中，浓硫酸的用量范围基于每克L1或L2为2-10ml。在所述成盐步骤中碱金属或碱土金属化合物的实例为碱金属或碱土金属的卤化物，尤其是氯化物，碳酸盐，硝酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐等等，其加入量应使整个体系析出沉淀。

本发明化合物的结构特点是在2’，4，4’-三羟基脱氧安息香(L1)和2’，3’，4，4’-四羟基脱氧安息香(L2)的基础上引入磺酸基，由此提供了两种水溶性好且可以有效清除氧自由基的结构L3和L4。与现有的抗氧化剂比较，本发明化合物具有清除率高和水溶性好等特点。清除率以半数有效清除浓度EC₅₀来衡量，数据列于表1和表2。

表1光谱法测定样品清除自由基的半数有效清除浓度

^*黄芩甙，购自陕西赛德高科生物股份有限公司

表2电化学法测定样品清除自由基的半数有效清除浓度

^*购自陕西赛德高科生物股份有限公司

由表1和表2可以看出，本发明的化合物具有较强的抗氧化作用。此外，本发明的化合物是水溶性的(L3和L4在水中的溶解度分别为为6.5g/100g水和11.3g/100g水)，克服了以前的抗氧化剂水溶性差的缺点。

下面通过实施例来对本发明作进一步说明，应当指出的是这些实施例仅用于对本发明进行举例说明，不应该理解为对本发明的限制。

实施例1

抗氧化剂L3的合成

在常温常压下，将7.6g(0.05mol)对羟基苯乙酸和5.5g(0.05mol)间苯二酚置于50mL三口烧瓶中，加入25mL新蒸的BF₃·Et₂O(用作溶剂和催化剂)，在N₂保护下于80℃反应3小时。在旋转蒸发器中回收大部分的BF₃·Et₂O，将残余物倒入400mL冰水中，静置，过滤，沉淀用20mL稀NaHCO₃水溶液分三次洗涤，得棕色粗产品。将粗产品用乙醇/水(体积比为1∶1)150mL重结晶，得9.5g淡黄色固体L1，产率78％。m.p.211.5℃～211.6℃，IR(Kar，ν，cm^-1)：3521.4(-OH)，1645(-CO-)；¹H NMR(MeOD，500MHz，δ，ppm)：4.10(s，J＝6.0Hz，2H，-COCH₂)，6.25(s，1H，HC-3’)，6.36(d，J＝8.765Hz，1H，HC-5’)，6.72(d，J＝8.315Hz，2H，HC-3，HC-5)，7.10(d，J＝8.175Hz，2H，HC-2，HC-6)，7.83(d，J＝8.86Hz 1H，HC-6’)；C₁₄H₁₂O₄的元素分析(％)，计算值：C，68.85；H，4.91；实测值：C，68.87；H，4.93。

在常温常压下，将2.4g(10mmol)上面合成的L1加入10mL浓硫酸中，室温搅拌30分钟，固体逐渐溶解，溶液变成深黄色。取少量反应液滴于水中，无不溶物出现，说明反应已完全。将此反应物缓慢小心倾倒入40mL冰水中，搅拌并过滤。然后在滤液中加入固体NaCl，剧烈搅拌，直到加入的NaCl不再溶解。静置，生成白色絮状沉淀，过滤，用15mL饱和食盐水分三次洗涤。用5％NaCl水溶液(50mL)重结晶，得白色针状晶体3-磺酸基-2’，4，4’-三羟基脱氧安息香钠盐(L3)4.3g(产率88％)。m.p.262.2℃～262.3℃，IR(KBr，ν，cm^-1)：3441.4(-OH)，1635(-CO-)；¹H NMR(D₂O，500MHz，δ，ppm)：4.15(d，J＝6.0Hz，2H，-COCH₂)，6.23(s，1H，HC-3’)，6.36(d，J＝8.765Hz，1H，HC-5’)，6.85(d，J＝8.365Hz，1H，HC-6)，7.16(d，J＝8.5Hz 1H，HC-5)，7.46(s，1H，HC-6’)，7.77(d，J＝8.C₁₄H₁₁O₇ S Na的元素分析(％)，计算值：C，48.55；H，3.18；实测值2Hz，1H，HC-2)；C，48.57；H，3.19。在25℃下在水中的溶解度为6.5g/100g水。

实施例2

抗氧化剂L4的合成

在常温常压下，称取7.6g(0.05mol)对羟基苯乙酸和6.3g(0.05mol)焦性没食子酸(邻苯三酚)置于50mL三口烧瓶中，加入25mL新蒸的BF₃·Et₂O(用作溶剂和催化剂)，在N₂保护下于80℃反应3小时。减压蒸馏，回收大部分的BF₃·Et₂O，将残余物倒入500mL冰水中，静置，过滤，沉淀用15mL稀NaHCO₃水溶液分三次洗涤，得棕色粗产品，产率92.4％。粗产品用乙醇/水(体积比1∶1)100mL重结晶，得到9.6g淡黄色固体L2，产率73.5％。m.p.190.9～192.2℃；UV(5％的NaOH水溶液，λ，nm)：320(π→π*B带)，412(π→π*R带)；IR(KBr，ν，cm^-1)：3433.6(-OH)，1643.5(-CO-)，1610.8(ph-)；¹H NMR(DMSO-d₆，500MHz，δ，ppm)：4.13(s，2H，-COCH₂-)，6.41(d，1H，J＝8.85Hz，H5)，6.70(d，2H，J＝8.05Hz，H3’和H5’)，7.07(d，2H，J＝8.30Hz，H2’和H6’)，9.49(d，1H，J＝8.90Hz，H6)，8.65(s，1H，-OH)，9.30(s，1H，-OH)，10.14(s，1H，-OH)，12.60(s，1H，-OH)；ESI(-)-MSm/z：261[M+1]，260[M+]。

在常温常压下，将2.6g(10mmol)上面合成的L2加入10mL浓硫酸中，室温搅拌30分钟，固体逐渐溶解，溶液变成深黄色。取少量反应液滴于水中，无不溶物出现，说明反应已完全。将此反应物缓慢小心倾倒入40mL冰水中，搅拌并过滤。然后在滤液中加入固体NaCl，剧烈搅拌，直到加入的NaCl不再溶解。静置，生成白色絮状沉淀，过滤，10mL饱和食盐水分三次洗涤。用5％NaCl水溶液(70mL)重结晶，得白色针状晶体(L4)4.3g(产率78％)。m.p.＞260℃(分解)，UV(H₂O，λ，nm)：224(π→π*E₂带)，287(π→π*B带)，416(π→π*R带)；IR(KBr，ν，cm^-1)：3441.4(-OH)，1642.5(-CO-)；¹H NMR(D₂O，500MHz，δ，ppm)：4.03(s，2H，-COCH₂-)，6.82(d，1H，J＝8.80Hz，H5)，7.10(d，1H，J＝7.45Hz，H2’)，7.24(d，1H，J＝8.96Hz，H6’)；C₁₄H₁₁O₈SNa的元素分析(％)，实测值：C 47.73，H 3.12，O36.36；计算值：C 47.71，H 3.10，O 36.39。在25℃下在水中的溶解度为11.3g/100g水。

实施例3

L3和L4对羟基自由基的清除

一、荧光光谱法

通用程序

在5ml比色管中，加入0.1ml 20mM的H₂O₂溶液、0.1ml 2mM的对苯二甲酸(TA)溶液以及一定体积的0.3mM的样品溶液，定容至5ml，迅速放置于紫外灯下，以254nm紫外光照射20分钟，准确计时，迅速测定溶液的荧光强度。

荧光条件：激发波长(Ex)312nm，发射波长(Em)427nm，高灵敏度；狭缝：EX＝5nm，EM＝5nm。

原理

H₂O₂在紫外光照射下会发生分解反应，生成羟基自由基(·OH)，它容易进攻芳环化合物-对苯二甲酸(TA)，生成具有荧光的羟基-对苯二甲酸(反应1)，而在实验条件下，TA的荧光很弱，基本可以忽略。因此，通过监测产物的荧光强度就可以确定体系中·OH的相对含量。当体系中有样品存在时，H₂O₂产生的部分·OH与样品反应，生成无荧光物质(反应2)。