结构仿生的角膜组织工程支架的制备方法

摘要

本发明公开了一种结构仿生的角膜组织工程支架及其制备方法。该方法包括如下步骤：将壳聚糖溶于酸溶液，胶原溶于酸溶液，振荡分散混合各组分；将混合溶液注入模具中风干；用碱溶液处理揭膜后烘干所得制品；使其吸水平衡。制备的角膜组织工程支架内部结构层状有序，与人眼角膜基质层内部结构类似，透光率为91～96％，湿态力学强度为3.9～12.7MPa，含水率为82.5％～143％，性能参数与人眼角膜接近，具有良好的生物活性和生物相容性，可用于医疗领域中作为角膜组织工程支架替代损伤的角膜组织，其制备工艺简单，设备简易，原料价廉易得，具有良好的应用前景和科学意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种组织工程角膜技术，特别是涉及一种结构仿生的角膜组织工程支架及其制备方法。

背景技术

角膜疾患是眼科的常见病和多发病，也是主要的致盲原因之一，仅次于白内障而居第二位，当今世界上眼睛失明的病人中有近1/3是由角膜疾病引起。在我国一些地区，角膜盲居各类致盲原因之首，目前，全国因角膜盲而待手术的患者约20万例，角膜移植术是角膜盲复明的极其重要的治疗方法。但同种异体角膜供体的来源缺乏，限制该技术的临床应用，人工角膜技术的发展为这些角膜盲患者的康复带来了新的希望，而角膜材料的性能对角膜移植手术的成功与否具有非常重要的影响。

传统的人工角膜材料生物相容性差，难以降解，且细胞难以真正黏附、增殖，营养和代谢物质不能及时交换，以及支架与光柱、支架与眼组织的结合部位界面问题比较复杂，炎症的发生率高。目前用组织工程技术构建角膜已成为眼科学界研究的热点。先将角膜细胞在角膜支架上的三维体外培养，然后植入眼内，细胞分化成为新的角膜组织的同时，支架也刚好降解完全。故其寻求的角膜材料不仅要有适宜的力学强度和良好的生物相容性，更要有较好的光学性能和降解性，且降解产物对人体无毒，无刺激性，降解速率要与人角膜组织生长速率相匹配，还要有适宜的吸水率、亲水性等性能。寻找符合角膜组织工程支架要求的材料，并制备出功能和人眼角膜接近，结构能与人眼角膜类似的仿生型角膜组织工程支架是面临的一个难题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种功能和结构仿生的角膜组织工程支架的制备方法。

一种结构仿生的角膜组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)将壳聚糖按10mg/ml浓度(10mg壳聚糖溶于1ml乙酸溶液)溶于0.5％～2％(体积比，下同)乙酸水溶液；

(2)将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液与2～5mg/ml胶原水溶液混合；

(3)将步骤(2)所得的混合液中加入0.1～0.5wt％交联剂交联处理；

(4)将步骤(3)所得的溶液注入模具中室温下自然风干；

(5)在步骤(4)的模具中加入2～5wt％的碱溶液浸泡20～35分钟后揭膜；

(6)烘干步骤(5)的制品，使用前在去离子水中浸泡2～4小时，使其达吸水平衡，得到有序层状的结构仿生的角膜组织工程支架。

所述步骤(2)的胶原为牛的I型胶原。

所述步骤(2)的混合为室温下搅拌1～2小时，并超声波振荡5～10分钟除去气泡。

所述步骤(3)的交联剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

所述步骤(5)的碱溶液为2％～5％的氢氧化钠溶液或氨水。

上述方法制备的结构仿生的角膜组织工程支架，角膜组织工程支架内部结构层状有序，与人眼角膜基质层内部结构类似，透光率为91～96％，湿态力学强度为3.9～12.7MPa，含水率为82.5％～143％，性能参数与人眼角膜接近，具有良好的生物活性和生物相容性。

本发明的作用原理是：人眼角膜主要分为上皮层、基质层和内皮层，基质层占角膜厚度的90％，由胶原纤维束以层状有序结构排布，并富含粘多糖，这种层状结构使得角膜具有高度的透光性。角膜组织工程对支架的要求是透明性好，力学强度适宜，降解速度可控，生物相容性优异等。壳聚糖膜的透明性好，力学强度优良，且在人体内可被溶菌酶缓慢降解，生物相容性良好，且降解产物对人体无毒无刺激性，其分子结构与角膜的粘多糖成分相似，来源广泛，原料丰富，符合角膜组织工程支架和产业化的要求；胶原来源丰富，制备工艺成熟，生物相容性优异，且是人眼角膜的组成成分，胶原分子和壳聚糖分子的相容性良好，故选用胶原与壳聚糖共混，这样可以同时提高壳聚糖的柔韧性，进一步改善壳聚糖的生物相容性。所制得的壳聚糖与胶原复合膜支架能够通过自组装的方式有序排列，呈现和人角膜类似的层状结构，达到结构上的仿生。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明的角膜组织工程支架内部结构层状有序，与人眼角膜基质层内部结构类似，具有良好的生物活性和生物相容性。

(2)本发明的角膜组织工程支架的透光率可达到95％(人眼角膜为95％～98％)，湿态力学强度介于3.9～12.7MPa(人眼角膜约为4.0MPa)，含水率82.5％～143％(人眼角膜为72％～82％)，这些性能参数与人眼角膜接近。

(3)本发明采用的原材料取材广泛，价格低廉，成型工艺简单，成本低，有利于大规模生产。

(4)本发明可以通过调节支架材料各成分的含量及工艺参数，改变支架材料的结构及力学强度。

附图说明

图1是实施例1制备的结构仿生的角膜组织工程支架的扫描电镜图；

图2是实施例2制备的结构仿生的角膜组织工程支架的扫描电镜图；

图3是实施例3制备的结构仿生的角膜组织工程支架的扫描电镜图；

图4是人眼角膜横切面示意图；

图5是人角膜缘上皮细胞在实施例1支架表面生长72小时的光镜照片；

图6是人角膜缘上皮细胞在实施例2支架表面生长72小时的光镜照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但需指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1

结构仿生的角膜组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)将1％壳聚糖溶于0.5％的乙酸水溶液中；

(2)将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液70ml与质量比浓度为0.2％的I型胶原的水溶液60ml混合；并搅拌1.5小时后，超声振荡10分钟除去气泡；

(3)将步骤(2)所得的混合液中加入0.1％～0.2％的交联剂交联处理，交联剂为EDC和NHS，在30分钟内将交联剂滴加完毕，同时用磁力搅拌器搅拌，使得交联剂均匀分散，反应温度为室温，反应时间为2～4小时；

(4)将步骤(3)所得的溶液注入模具中室温下自然风干；

(5)在步骤(4)的模具中加入2％的氢氧化钠溶液浸泡30分钟后揭膜；

(6)烘干步骤(5)制品，使用前在去离子水中浸泡2～4小时，使其达吸水平衡，得到结构仿生的角膜组织工程支架。经检测，该结构仿生的角膜组织工程支架包含如下组分：

壳聚糖                         37.8％

胶原                           16.2％

水                             46.0％

各组分均为重量百分比。

由于壳聚糖分子和胶原分子具有优异的相容性，在溶液中可以达到分子级的均匀分散，随着溶剂的不断挥发，两种分子间的自组装作用使得角膜组织工程支架内部结构层状有序。图4是人眼角膜横切面示意图；可以看出占人眼角膜厚度约90％的基质层结构为规则的层状结构，而这种规则的层状结构保证了角膜优异的透光性。图1是本实施例制备的结构仿生的角膜组织工程支架的扫描电镜图；从图1可以看出本发明制备的结构仿生的角膜组织工程支架具有内部层状结构，该结构与人眼角膜基质层内部结构类似，也具备良好的光学性能。本实施例制备的结构仿生的角膜组织工程支架性能测试情况见表1。图5是人角膜缘上皮细胞在本实施例支架表面生长72小时的光镜照片，如图5所示人角膜缘上皮细胞的粘附和增殖实验结果表明了制得的角膜组织工程支架具有良好的生物活性和生物相容性。

实施例2

结构仿生的角膜组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)将1％壳聚糖溶于2％的乙酸水溶液中；

(2)将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液70ml与质量比浓度为0.5％的I型胶原的水溶液60ml混合；并搅拌1.5小时后，超声振荡10分钟除去气泡；

(3)将步骤(2)所得的溶液注入模具中室温下自然风干；

(4)在步骤(3)的模具中加入氨水溶液浸泡30分钟后揭膜；

(5)烘干步骤(4)制品，使用前在去离子水中浸泡2～4小时，使其达吸水平衡，得到结构仿生的角膜组织工程支架。经检测，该结构仿生的角膜组织工程支架包含如下组分：

壳聚糖                     18.5％

胶原                       27.8％

水                         53.7％

各组分均为重量百分比。

图2是本实施例制备的结构仿生的角膜组织工程支架的扫描电镜图；从图2可以看出本发明制备的结构仿生的角膜组织工程支架具有内部层状结构，该结构与人眼角膜基质层内部结构类似，也具备良好的光学性能。本实施例制备的结构仿生的角膜组织工程支架性能测试情况见表1。图6是人角膜缘上皮细胞在本实施例支架表面生长72小时的光镜照片，如图6所示人角膜缘上皮细胞的粘附和增殖实验结果表明了制得的角膜组织工程支架具有良好的生物活性和生物相容性。

实施例3

结构仿生的角膜组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)将1％壳聚糖溶于1％的乙酸水溶液中；

(2)将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液70ml与质量比浓度为0.25％的I型胶原的水溶液60ml混合；并搅拌1.5小时后，超声振荡10分钟除去气泡；

(3)将步骤(2)所得的溶液注入模具中室温下自然风干；

(4)在步骤(3)的模具中加入2％的氢氧化钠碱溶液浸泡30分钟后揭膜；

(5)烘干步骤(4)制品，使用前在去离子水中浸泡2～4小时，使其达吸水平衡，得到结构仿生的角膜组织工程支架。经检测，该结构仿生的角膜组织工程支架包含如下组分：

壳聚糖                  16.5％

胶原                    24.7％

水                      58.8％

各组分均为重量百分比。图3是本实施例制备的结构仿生的角膜组织工程支架的扫描电镜图；从图3可以看出本发明制备的结构仿生的角膜组织工程支架具有内部层状结构，该结构与人眼角膜基质层内部结构类似，也具备良好的光学性能。本实施例制备的结构仿生的角膜组织工程支架性能测试情况见表1。

测量上述各实施例制得的功能与结构仿生的角膜组织工程支架的光学、力学指标与人眼角膜参数比较如表一所示：

                                          表一

  角膜支架性能参数  支架透光率  湿态拉伸强度  含水率  接触角  实施例1  96％  8.8MPa  85％  90.8°  实施例2  93％  3.9MPa  113％  76°  实施例3  91％  6.4MPa  146％  78.5°  人眼角膜值  95％～98％  约4.0MPa  72％～82％  ---  现有专利   (CN1382425A)   92％～96％   3.8～4.2MPa   65％～76％   ---

备注：

1、透光率的测定设备是上海棱光技术有限公司的Spectrumentlab 22 PC分光光度计，测试了吸水平衡后的角膜组织工程支架在不同波长的可见光条件下的光透光率情况；

2、湿态拉伸强度是采用日本岛津公司的AG-I型电子万能试验机，对吸水平衡后的角膜组织工程支架进行测试，温度25℃，拉伸速率10mm/min；

3、含水率是根据吸水平衡前后的角膜组织工程支架的水份增重量与吸水平衡前干燥过的支架干重的比率；

4、接触角是采德国Dataphysics公司的OCA15型表面接触角测定仪测试未含水角膜支架材料在滴水100s时的接触角大小。

表一的数据可以看出，本研究的支架性能和现有技术(CN1382425A)相比，支架的透光，率比较接近，均可以满足组织工程角膜对支架的光学性能要求，而本专利的支架的湿态拉伸强度和含水量要优于以前，这对临床应用有着极为重要的意义，可以较好满足临床手术操作对材料力学的要求；

另外，本支架的内部结构呈现与人眼角膜基质类似的规则的层状结构，达到了某种程度上的结构仿生。该结构一方面起到光栅的作用，使得透过支架可见光的同向光线相互加强，散射光线相互抵消，保证了支架的透光率，另一方面，分子的规则排列，使得支架的力学强度较高，可以满足临床对组织工程角膜支架的力学性能要求。