一种辣椒抗疫病育种的分子标记辅助选择方法

摘要

本发明公开了一种辣椒抗疫病育种的分子标记辅助选择方法。该方法是将辣椒抗疫病育种分离世代材料的植株播种于温室，待幼苗长出5～6片真叶时，每个植株分别取1～2片幼叶，提取DNA。以DNA为模板，利用SCAR标记的两条引物进行PCR扩增。在56～58℃的退火温度下，进行PCR扩增，扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离，溴化乙锭染色，观测PCR结果。如果扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带，说明该材料抗疫病；如果扩增不出这条520个碱基对大小的DNA条带，说明该材料对疫病表现感病。本发明可对辣椒抗疫病育种分离世代中的单个植株在任何时期进行辣椒抗疫病性能检测且不影响其正常生长；检测迅速，费用低。

说明书

                         技术领域

本发明属于作物育种和作物分子标记育种技术的领域，特别涉及一种辣椒抗疫病育种的分子标记辅助选择方法。

                         背景技术

辣椒疫病(Phytophthora capsici L)是世界范围内辣椒生产最严重的病害之一。辣椒疫病具有空气传染性和土壤传染性两种性质，但以土壤传播为主，加之发病的突发性强，流行速度极快，因而药剂防治和栽培防治措施效果不佳。培育抗疫病的辣椒品种是解决这一问题最经济有效的途径。国内外已用人工接种鉴定技术筛选出一些抗疫病的辣椒资源，但这些抗性资源的农艺性状及品质性状较差，不能直接作为育种材料来使用，需要将其优良抗性转育到商业品种上。传统的抗性转育方法主要是杂交，这样在导入抗病基因的同时不可避免地引入不良农艺性状及品质性状，育种实践中急需建立一种更为有效的育种选择方法。标记辅助选择技术的建立与发展为解决这一问题提供了有效途径。

国内外众多的研究表明，辣椒抗疫病的遗传呈现出“遗传多样性”的特点，即：一些材料的抗性受单基因控制，一些为寡基因控制，另一些则受多基因控制。辣椒遗传育种者依据所掌握的抗性资源的遗传特性，选择合适的育种技术来开展研究工作。

目前，法国INRA蔬菜育种研究所Lefebvre和Palloix(1996)以来自种内F1杂种Perennial(具水平抗病性、印度辣椒)X Yolo Wonder(感病、美国甜椒)的双单倍体种为材料，研究表明，分布在几个连锁群或处于非连锁状态的13个QTL影响辣椒抗疫病性能；这些QTL的效应不同，有主效、中等效应、微效QTL(数量性状位点)之分。朝鲜Kang等(1997)以近等基因系为材料，应用AFLP技术，发现有5个DNA(脱氧核糖核酸)片段仅出现在抗疫病材料的图谱中。由此可知，Lefebvre和Palloix仅对具水平抗性的材料开展了研究，且研究结果尚不能应用于标记辅助选择中；Kang等仅初步获得了辣椒抗疫病基因的候选AFLP标记。

国外这方面的研究尚处于起始阶段，且目前已有的这些研究尚不够深入、系统。

                         发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种辣椒抗疫病育种的分子标记辅助选择方法，从而实现辣椒抗疫病育种中快速、有效地选择出抗疫病材料的目的。上述分子标记辅助选择方法还可在辣椒抗疫病育种中应用。

本发明在传统的辣椒抗疫病育种分离世代(F₂至F₅世代或BC₁至BC₅世代)的选择中，利用与辣椒抗疫病基因紧密连锁的SCAR(SequencedCharacterized Amplified Regions，序列特征化的扩增区域)标记的两个引物对植株的DNA进行PCR(多聚酶链式反应)检测，该两个引物的序列为：引物1：5′aaa gct gcg gat tta gac ct 3′；引物2：5′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′。PCR反应条件中复性温度为56～58℃。采用琼脂糖凝胶电泳技术分析PCR产物。从抗疫病的材料中均可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带，而从感病的材料则扩增不出这条520个碱基对大小的DNA条带。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种辣椒抗疫病育种的分子标记辅助选择方法，包括如下步骤：

(1)将辣椒抗疫病育种分离世代材料的植株播种于25～30℃、相对湿度50～70％的温室，正常管理，待幼苗长出5～6片真叶时，每个植株分别取1～2片幼叶，按照SDS方法提取基因组DNA。

(2)以上述DNA为模板，利用SCAR标记的两条引物进行PCR扩增。所述SCAR标记的两条引物分别为引物1和引物2，所述引物1：5′aaa gct gcggat tta gac ct 3′；引物2：5 ′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′。

(3)在56～58℃的退火温度下，进行PCR扩增，将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离，溴化乙锭(加溴化乙锭至终浓度500ng/mL)染色，在紫外灯下观测PCR结果。

(4)如果可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带，说明该材料抗疫病；如果扩增不出这条520个碱基对大小的DNA条带，说明该材料对疫病表现感病。

为了更好地实现本发明，所述步骤(2)中PCR反应总体积为25微升，含有10m mol/L Tris-HCl(pH8.3)，50m mol/L KCl，1.5m mol/L MgCl₂，0.01％gelitin，20ng基因组DNA，每个引物0.2～0.5u mol/L，0.5 U Taq DNAPolymerase(Taq DNA聚合酶)。

所述步骤(3)中PCR扩增反应参数为：94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环；最后一个循环72℃延长10min。

所述分离世代为F₂至F₅世代或BC₁至BC₅世代。

本发明以来自印度尼西亚的抗疫病辣椒材料PBC 534为母本(P₁)，以来自我国北方地区的对疫病表现感病的保加利亚尖椒为父本(P₂)，将P₁、P₂及P₁×P₂、F₂代材料播种于温室，在5～6叶期接种，接种浓度为10000游动孢子/ml，每株1.5ml。采用BSA(bulked segregant analysis，混合分组分析法)分析原理，采用RAPD技术(DNA随机扩增多态性标记技术)，获得了与辣椒抗疫病基因紧密连锁的标记OPC11₅₀₀，将该标记克隆，序列结果表明，该标记为522bp。根据该序列，设计了SCAR(Sequenced Characterized AmplifiedRegions，序列特征化的扩增区域)标记的两条引物序列分别为：引物1：5′aaagct gcg gat tta gac ct 3′；引物2：5 ′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′，从而将该RAPD标记转化为更为稳定的SCAR标记。

与现有辣椒抗疫病育种技术即人工苗期抗病性鉴定技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明可在试验室对辣椒抗疫病基因进行直接检测，不受环境条件的影响。

(2)利用本发明可对辣椒抗疫病育种分离世代中的单个植株在任何时期进行辣椒抗疫病性能检测，且不影响其正常生长，而传统方法难以达到。

(3)利用本发明进行辣椒抗疫病性能检测，检测迅速，可在1～2天内获得检测结果，而传统方法需要40～50天。

(4)利用本发明进行辣椒抗疫病性能检测，费用低，仅为10～20元/份材料，而传统方法需要100～150元/份材料。

                         附图说明

图1为利用SCAR标记对12个BC₁代株系的检测图。

                         具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

以优质、丰产、感疫病的来源于内蒙古的赤峰牛角椒为母本，以来自亚洲蔬菜发展研究中心的抗疫病材料PBC830为父本，获得杂交组合F₁，用优质、丰产、感疫病的材料赤峰牛角椒为轮回亲本进行回交，获得回交世代BC₁。在对辣椒抗疫病育种分离世代BC₁进行选择时：

(1)将该材料播种于25～30℃、相对湿度50～70％的温室，待幼苗长出5～6片真叶时，每个植株分别取1～2片幼叶，按照王得元等(1998)(江西农业大学学报，1998，20(2)：180-183)改进的SDS方法提取基因组DNA。

(2)以上述基因组DNA为模板，利用SCAR标记的两条引物(引物1：5′aaa gct gcg gat tta gac ct 3′；引物2：5′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′)进行PCR扩增。

PCR反应总体积为25微升，含有10m mol/L Tris-HCl(pH8.3)，50m mol/LKC1，1.5m mol/L MgCl₂，0.01％gelitin，20ng基因组DNA，每个引物0.2～0.5umol/L，0.5 U Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)。

(3)在58℃的退火温度下，进行PCR扩增，反应参数为：94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环；最后一个循环72℃延长10min。PCR扩增反应在PE公司生产的9700型PCR仪上进行。

(4)将上述扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离，溴化乙锭(加溴化乙锭至终浓度500ng/mL)染色。在紫外灯下观测PCR结果。

(5)利用该SCAR标记对12 BC₁代植株进行了PCR检测，结果发现，抗疫病的材料中均可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带，而感病的材料按照王得元等(广东农业科学，2001，(2)：37-39)的方法进行苗期人工接种辣椒疫霉菌抗性鉴定后植株死亡，扩增不出这条520个碱基对大小的DNA条带；PCR检测中，如图1为利用SCAR标记对12个BC₁代株系的检测图。其中M：100bp DNA ladder(自上到下各条带分子量分别为900、700、600、500、400、300bp)；涌道1～12代表12个单株，左边涌道1～12为复性温度58℃，右边涌道1～11为复性温度56℃。

(6)将抗病的单株种植到田间，正常管理，按单株采收种子。

(7)将种子播种于温室中，按照上述(1)至(4)步骤进行操作，选择可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带的植株和不能扩增出这条520个碱基对大小的DNA条带的植株，进行种植，正常管理，按单株采收种子。

(8)将可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带的单株的种子和不能扩增出这条520个碱基对大小的DNA条带的单株的种子播种于温室，按照王得元等(广东农业科学，2001，(2)：37-39)的方法进行苗期人工接种辣椒疫霉菌抗性鉴定。结果发现，可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带的株系的发病率为5％，表现为抗病；而不能扩增出这条520个碱基对大小的DNA条带的株系的发病率为90％，表现为感病。

将抗病的辣椒株系种植到田间，以进行品质、丰产等其他重要性状的选择。这样减少了人力、物力和土地。

实施例2

以优质、丰产、感疫病的来源于我国北方地区的保加利亚尖椒为母本，以来自印度尼西亚的抗疫病辣椒材料PBC 534为父本，获得杂交组合F₁，F₁自交获得世代F₂。在对辣椒抗疫病育种分离世代F₂进行选择时：

(1)将该材料播种于25～30℃、相对湿度50～70％的温室，待幼苗长出5～6片真叶时，每个植株分别取1～2片幼叶，按照王得元等(1998)(江西农业大学学报，1998，20(2)：180-183)改进的SDS方法提取基因组DNA。

(2)以上述基因组DNA为模板，利用SCAR标记的两条引物(引物1：5′aaa gct gcg gat tta gac ct 3′；引物2：5′aaa gct gcg gtt gaa tcg g 3′)进行PCR扩增。

PCR反应总体积为25微升，含有10m mol/L Tris-HCl(pH8.3)，50m mol/LKC1，1.5m mol/L MgCl₂，0.01％gelitin，20ng基因组DNA，每个引物0.2～0.5u mol/L，0.5 U Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)。

(3)在58℃的退火温度下，进行PCR扩增，反应参数为：94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环；最后一个循环72℃延长10min。PCR扩增反应在PE公司生产的9700型PCR仪上进行。

(4)将上述扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离，溴化乙锭(加溴化乙锭至终浓度500ng/mL)染色。在紫外灯下观测PCR结果。

(5)利用该SCAR标记对F₂代植株进行了PCR检测，结果发现，抗疫病的材料中均可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带，而感病的材料按照王得元等(广东农业科学，2001，(2)：37-39)的方法进行苗期人工接种辣椒疫霉菌抗性鉴定后植株死亡，扩增不出这条520个碱基对大小的DNA条带。

(6)将抗病的单株种植到田间，正常管理，按单株采收种子，获得F₃世代。

(7)将种子播种于温室中，按照上述(1)至(4)步骤进行操作，选择可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带的植株和不能扩增出这条520个碱基对大小的DNA条带的植株，进行种植，正常管理，按单株采收种子。

(8)将可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带的单株的种子和不能扩增出这条520个碱基对大小的DNA条带的单株的种子播种于温室，按照王得元等(广东农业科学，2001，(2)：37-39)的方法进行苗期人工接种辣椒疫霉菌抗性鉴定。结果发现，可扩增出一条520个碱基对大小的DNA条带的株系的发病率为8％，表现为抗病；而不能扩增出这条520个碱基对大小的DNA条带的株系的发病率为85％，表现为感病。

将抗病的辣椒株系种植到田间，以进行品质、丰产等其他重要性状的选择。这样减少了人力、物力和土地。

利用本发明进行辣椒抗疫病标记辅助选择，从DNA提取到检测结果出来需要1～2天，花费较低。

                      SEQUENCE LISTING

<110>广东省农业科学院蔬菜研究所

<120>一种辣椒抗疫病育种的分子标记辅助选择方法

<130>26

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>利用SCAR标记的引物1

<400>1

 aaagctgcgg atttagacct                                       20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>利用SCAR标记的引物2

<400>2

aaagctgcgg ttgaatcgg                                         19