公开/公告号CN1954082A
专利类型发明专利
公开/公告日2007-04-25
原文格式PDF
申请/专利权人 肿瘤疗法科学股份有限公司;
申请/专利号CN200580009630.4
申请日2005-01-21
分类号C12Q1/48(20060101);G01N33/574(20060101);
代理机构11105 北京市柳沈律师事务所;
代理人巫肖南;封新琴
地址 日本神奈川县
入库时间 2023-12-17 18:33:38
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2011-08-17
授权
授权
2007-06-13
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-04-25
公开
公开
本申请要求2004-1-23提交的美国临时申请序列号60/538,658的优先权，其全文内容包含在本文中作为参考。
技术领域
本发明涉及转录调节。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的癌症之一，而且它的发病率在日本以及美国正逐渐升高(Akriviadis EA等，BrJ Surg.1998 Oct；85(10)：1319-31)。虽然最近的医学进展已经在诊断方面取得很大进步，很多HCC患者仍然是在晚期才被诊断出，而且他们的疾病依然很难完全治愈。此外，肝硬变或慢性肝炎患者具有高HCC风险，它们可能形成多发肝肿瘤，或者甚至在完全除去原始肿瘤后形成新肿瘤。因此，开发高效化疗药物和预防策略是迫切关心的问题。
结肠直肠癌是发达国家中癌症致死的主要原因。具体地，在美国每年报道有超过130,000例新发结肠直肠癌病例。结肠直肠癌占所有癌症的大约15％。其中，有大约5％与遗传性基因缺陷直接相关。许多患者在癌症开始前就被诊断患有癌前结肠或直肠息肉。虽然许多小结肠直肠息肉是良性的，一些类型会进展成为癌症。最广泛使用的结肠直肠癌的筛选检查是结肠镜检。该方法用于观察可疑的生长物和/或获取组织活检物。通常，组织活检物经过组织学检查并且基于活检细胞的显微镜下外观进行诊断。但是，该方法的限制在于其结果是主观的且不能用于癌前状态的非常早期的检测。敏感的、特异的且方便的用于检测非常早期的结肠直肠癌或前-恶性病变的诊断系统是非常需要的，因为它可能最终消除所述疾病。
发明内容
本发明部分基于ZNFN3A1的甲基转移酶活性的发现，ZNFN3A1是参与癌细胞增殖的一种多肽。此外，ZNFN3A1的甲基转移酶活性在90-kD热休克蛋白质(HSP90)存在时表达。
因此，本发明的特征在于测定甲基转移酶活性的方法，其通过使本发明的多肽与甲基转移酶基质以及辅助因子在适于所述基质甲基化的条件下接触，并检测所述基质的甲基化水平来进行。本发明的多肽是ZNFN3A1多肽或其功能等同物。例如，本发明的多肽可包括氨基酸序列SEQ ID NO：51。可选，本发明的多肽可包括氨基酸序列SEQ ID NO：51，其中一或多个氨基酸被取代，缺失或插入，并且所述多肽具有多肽SEQ ID NO：51的生物活性。多肽SEQ ID No：51的生物活性包括例如促进细胞增殖和靶基因的转录活化。此外，所述多肽包括428个氨基酸的蛋白质，其由SEQ ID NO：50或在例如低度到高度严谨条件下与核苷酸序列SEQ ID NO：50杂交的多核苷酸的开放读框编码并具有SEQ ID NO：50的生物活性。低度严谨条件是例如42℃，2X SSC，0.1％SDS，或优选50℃，2X SSC，0.1％SDS。优选，使用高度严谨条件。高度严谨条件是例如在2X SSC，0.01％SDS中于室温在20min间洗涤3次，然后在1x SSC，0.1％SDS中于37℃在20min间洗涤3次，并在1x SSC，0.1％SDS中于50℃在20 min间洗涤2次。然而，多种因素诸如温度和盐浓度可影响杂交的严谨度，并且本领域技术人员可适宜选择所述因素以获得所需的严谨度。可选，所述多肽进一步与90-kD热休克蛋白接触。甲基化定义为催化甲基基团转移到另外的化合物，例如受体分子。甲基化通过诸如利用放射活性甲基供体的方法检测。所述基质是任何能接受甲基基团的化合物诸如蛋白质，核酸(RNA或DNA)或小分子。例如，所述基质是组蛋白或含有甲基化区的组蛋白的片段。实际上，证实组蛋白H3赖氨酸4可被ZNFN3A1甲基化。因此，组蛋白H3，或其含有赖氨酸4的片段，可用作基质。辅助因子，例如甲基供体是任何可提供甲基基团的化合物。例如，所述辅助因子是S-腺苷-L-甲硫氨酸。适宜的甲基化条件包括例如本领域已知的碱性缓冲液条件诸如Tris-HCl。
本发明还提供鉴定调节(例如增加或降低)甲基转移酶活性的试剂的方法，所述方法通过在受试试剂存在的条件下，使本发明的多肽与甲基转移酶基质以及辅助因子在适宜所述基质的甲基化的条件下进行接触，并测定所述基质的甲基化水平。与正常对照甲基化水平相比甲基化水平的降低表示所述受试试剂是甲基转移酶活性的抑制剂。抑制(例如降低)甲基转移酶活性的化合物可用于治疗、预防或缓解结肠直肠癌或肝细胞癌的症状。例如，所述化合物抑制癌细胞的增殖。可选，与正常对照水平相比水平或活性的增加表示所述受试试剂是甲基转移酶活性的增强物。正常对照水平是指不存在受试化合物的条件下检测到的基质的甲基化水平。
本发明提供筛选用于治疗结肠直肠癌或肝细胞癌的化合物的方法，所述方法通过将多肽与热休克蛋白90A(HSP90A)多肽在存在受试试剂的条件下接触并检测所述多肽与HSP90A之间的结合来进行。将所述多肽与HSP90A在存在受试化合物时的结合与不存在该受试化合物时的结合进行比较。选择降低所述多肽与HSP90A的结合的受试化合物。所述多肽与HSP90A的结合定义为该多肽与bb之间的非共价结合。结合通过本领域已知的方法诸如酵母双杂合子筛选系统测定。
本发明还包括用于缓解结肠直肠癌或肝细胞癌的症状的组合物和方法，其通过使结肠直肠癌细胞或肝细胞癌细胞与如上述鉴定的化合物接触来进行。例如，治疗结肠直肠癌和/或肝细胞癌的方法通过给药哺乳动物例如诊断为患有所述疾病状态的人类患者含有药物有效量的上述鉴定的化合物以及药物载体的组合物来进行。
本发明还提供了利用甲基转移酶多肽，基质、辅助因子以及HSP90A检测化合物的甲基转移酶活性的试剂盒。所述试剂以试剂盒的形式包装在一起。所述试剂包装在分离的容器中，例如本发明的甲基转移酶多肽，基质，辅助因子，对照剂(阳性和/或阴性)，和/或可检测标记。本发明另一实施方案是检测受试化合物对甲基转移酶活性的调节活性，和/或本发明的ZNFN3A1多肽与热休克蛋白90A多肽(HSP90A)的结合的试剂盒。所述试剂盒包括ZNFN3A1多肽或其片段以及HSP90A多肽。在该实施方案的一些方面中，ZNFN3A1是多肽，优选重组多肽，包含具有天然ZNFN3A1的SET结构域的氨基酸序列。此外，本发明提供用于筛选用于治疗结肠直肠癌或肝细胞癌的化合物的试剂盒，所述试剂盒包含以下组分：含有选自氨基酸序列SEQ ID NO：51的连续氨基酸序列、并且氨基酸序列包含NHSCDPN(SEQ ID NO：52)和/或GEELTICY(SEQ ID NO：53)的多肽；以及S-腺苷-L-甲硫氨酸。实施所述测定法的说明(例如书面的、录音带，VCR，CD-ROM等)包含在该试剂盒内。该试剂盒的测定模式是本领域已知的转移酶测定法或结合测定法。
除非另有说明，本文所用的所有技术以及科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员所理解的含义相同。尽管类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于实施或检测本发明，适宜的方法和材料在下文描述。所有公开出版物，专利申请，专利，以及本文所述的其他对比文件的全文都包含在本文作为参考。如有冲突，以本说明书，包括定义为准。此外，所述的材料、方法和实施例仅仅是示例性的并不意图限制本发明。
附图简述
图1A图示了甲基转移酶的SET结构域中的保守序列。
图1B是SDS-PAGE凝胶的照片，显示野生型ZNFN3A1和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)之间的相互作用。相等量的野生型或突变ZNFN3A1(箭头)与[3H]-标记的SAM一起保温(上图)。SAM-结合的ZNFN3A1(箭头)通过荧光图检出(下图)。
图1C是存在或不存在重组HSP90A时，ZNFN3A1的SET结构域的体外HMTase测定法的照片。SET7作为对照。
图2A是体外组蛋白H3-K4甲基转移酶测定法的照片。组蛋白H3与野生型或突变ZNFN3A1或SET7在SAM和HSP90A存在的条件下一同保温。
图2B是显示通过将具体的肽加入二甲基化的H3-K4来抑制H3-K4的二甲基化的照片。
图2C是体外组蛋白H3-K9甲基转移酶测定法的照片。SUV39H1作为阳性对照。
图3A是SDS-PAGE凝胶的照片，显示通过CBB-染色检测免疫沉淀的和重组ZNFN3A1蛋白。泳道1.蛋白标记1，泳道2.蛋白标记2，泳道3.免疫沉淀的Flag标记的ZNFN3A1，泳道4.重组ZNFN3A1蛋白，泳道5.白蛋白(1μg)，泳道6.白蛋白(2μg)，泳道7.白蛋白(5μg)。
图3B是照片，显示免疫沉淀的Flag-ZNFN3A1和重组ZNFN3A1蛋白的体外组蛋白H3 HMTase活性。
图3C是照片，通过免疫沉淀的Flag-ZNFN3A1或重组ZNFN3A1蛋白显示二甲基化的(上图)和三甲基化的(下图)组蛋白H3-K4。
图3D是柱图，显示SAHH对ZNFN3A1的HMTase活性的影响。
图4A是柱图，显示HEK293细胞中ZNFN3A1的致癌活性的影响。存活细胞的数目通过Cell Counting Kit-8在转染后第14天测定。*，通过Fisher’s制约付最小有义差测定(Fisher’s protected least-significant test)确定为显著差异(p＜0.05)。
图4B是柱图，显示HCT116细胞中ZNFN3A1的致肿瘤活性的影响。存活细胞的数目通过Cell Counting Kit-8在转染后第14天测定。*，通过Fisher’s制约付最小有义差测定确定为显著差异(p＜0.05)。
图5A是柱图，显示质粒转染后14天通过Cell Counting Kit-8测定的结肠癌细胞系的细胞存活力。细胞利用用于HCT116的含有0.5μg/μl G418的McCoy’s培养基，用于SW948的含有1.0μg/μl G418的L-15培养基进行选择。*，通过Fisher’s制约付最小有义差测定确定为显著差异(p＜0.05)。
图5B是柱图，显示质粒转染后14天通过Cell Counting Kit-8测定的肝癌细胞系的细胞存活力。细胞利用用于HepG2的含有1.0μg/μl G418的DMEM，用于Huh7和Alexander的含有0.8μg/μl G418的DMEM进行选择。*，通过Fisher’s制约付最小有义差测定确定为显著差异(p＜0.05)。
图6A是照片，显示HEK293细胞中ZNFN3A1的内源性表达。Aa在用pcDNA(模拟)或pc-DNA-ZNFN3A1转染的细胞中的时间依赖性表达通过western印迹分析检测。
图6B是照片，显示候选下游基因应答于内源性ZNFN3A1的表达。半定量RT-PCR分析利用来自用pcDNA-ZNFN3A1或模拟转染的HEK293细胞的RNA进行。
图7A图示了Nkx2.8的5’-侧翼区中推定的ZNFN3A1-结合序列。ZNFN3A1对Nkx2.8的HSP90A-依赖性反式活化通过其与推定的结合序列的相互作用表达。
图7B是照片，显示通过ChIP测定法鉴定Nkx2.8启动子区中的ZNFN3A1-结合元件。
图7C是柱图，显示重组GST-ZNFN3A1和含有ZNFN3A1-结合元件(ZBE)的双链DNA探针之间的体外结合测定的结果。
图7D是柱图，显示HCC细胞中，在存在或不存在ZNFN3A1-siRNA的条件下含有Nkx2.8的野生型或突变ZNFN3A1-结合元件(ZBE)的转录测定。
图7E是凝胶照片，显示HEK293细胞中Nkx2.8应答于野生型(泳道2或3)或突变(泳道4或5)ZNFN3A1的外源性表达。加入HSP90A-特异性抑制物，geldanamycin，减小野生型ZNFN3A1(泳道3)导致的Nkx2.8表达的加强。
图7F是柱图，显示基因组中含有整合的Nkx2.8启动子萤光素酶基因的HEK293-Nkx2.8Luc细胞中野生型或突变ZNFN3A1对萤光素酶活性的影响。
图8A是照片，显示肝癌细胞中内源ZNFN3A1和Nkx2.8的ChIP-4区之间的相互作用。
图8B是照片，显示HEK293细胞中，存在ZNFN3A1时二甲基化的组蛋白H3赖氨酸4(H3-K4)和ChIP-4之间的相互作用。
发明详述
本发明部分基于新的组蛋白甲基转移酶ZNFN3A1的发现，其参与癌细胞的增殖。Aa的组蛋白甲基转移酶活性在存在90-kD热休克蛋白(HSP90A)时表达，因此HSP90A在组蛋白甲基转移酶活性中起作用。
ZNFN3A1表达在结肠直肠癌以及肝细胞癌(HCC)中与非癌性肝和结肠直肠组织相比明显升高(WO 03/27143)。ZNFN3A1 cDNA由含有SEQ.ID.NO.：50所示的1284个核苷酸的开放读框的1622个核苷酸组成。该开放读框编码具有锌指基序以及SET结构域的428个氨基酸的蛋白质，如SEQ.ID.NO.：51所示。Aa蛋白质的亚细胞定位在细胞周期进展的过程中改变并随培养的细胞的密度而改变。当细胞处于中到晚S期或在低密度的条件中培养时Aa蛋白质在细胞核中聚集。但是，当细胞在细胞周期的其它阶段或在高密度条件下生长时，ZNFN3A1蛋白质定位在细胞质以及细胞核中。
ZNFN3A1含有两个保守的氨基酸序列“NHSCXXN”(SEQ ID NO：54)和“GEELXXXY”(SEQ ID NO：55)限定的SET结构域。(图1A)编码具有SET结构域的蛋白质的基因根据它们SET结构域的同源性分成四个家族，即SUV39，SET1，SET2和RIZ家族。Aa的SET结构域不含有任何在这些亚家族中保守的前-SET，后-SET，AWS，SANT或C2H2结构域，因此ZNFN3A1可构成SET结构域蛋白质的新的亚家族种类。
ZNFN3A1与RNA螺旋酶KIAA0054直接结合，与RNA聚合酶II形成复合体，其通过所述复合体与EGFR基因的5’侧翼区中的元件“(C)CCCTCC(T)”的直接结合活化包括表皮生长因子受体(EGFR)的下游基因的转录。此外，ZNFN3A1显示与RNA螺旋酶(HELZ)以及90-kD热休克蛋白(HSP90A)结合。
NIH3T3细胞中ZNFN3A1的外源表达导致增加的细胞生长。反之，利用反义S寡核苷酸抑制其表达导致肝癌细胞的明显生长抑制。此外，证实了ZNFN3A1的siRNA也可抑制肝细胞瘤细胞以及结肠直肠腺癌细胞的增殖(WO2004/76623)。这些发现表明ZNFN3A1赋予癌细胞致癌活性，这通过用具有RNA螺旋酶和RNA聚合酶II的复合体对包括EGFR的靶基因进行转录活化来实现，并且抑制所述复合体的活性是治疗结肠直肠癌和肝细胞癌的策略。其它SET结构域蛋白的调节解除已经显示与人肿瘤有关。例如在人白血病中，观察到SET1家族的果蝇trithorax基因的人同源物MLL(10，11)的频繁转位。尽管不清楚MLL功能的丧失或获得是否导致癌发生，MLL通过与Hox启动子序列的直接结合经由SET结构域(12)的甲基化酶活性介导的H3-赖氨酸-4-特异性甲基化来活化Hox基因的转录。MLL2和EZH2，是SET1家族的两个成员，其在胰腺癌、胶质细胞瘤或激素抵抗性转移性前列腺癌中扩增(13-15)。
本发明因此提供了筛选调节ZNFN3A1甲基转移酶活性的化合物的方法。所述方法通过使ZNFN3A1多肽或其具有甲基转移酶活性的功能等同物与一或多种候选化合物接触，并测定接触的ZNFN3A1或其功能等同物的甲基转移酶活性来进行。调节ZNFN3A1或其功能等同物的甲基转移酶活性的化合物由此得以鉴定。
本发明中，术语“功能等同物”的意思是受试蛋白质具有与ZNFN3A1相同或基本相同的甲基转移酶活性。具体地，所述蛋白质催化组蛋白H3或包含赖氨酸4的组蛋白H3片段的甲基化。受试蛋白是否具有靶活性可通过本发明确定。即，甲基转移酶活性可通过使多肽与基质(例如组蛋白H3或其包含赖氨酸4的片段)以及辅助因子(例如S-腺苷-L-甲硫氨酸)在适宜所述基质甲基化的条件下接触并检测所述基质的甲基化水平来确定。
制备与给定蛋白在功能上等同的蛋白质的方法是本领域技术人员已知的并包括将突变引入所述蛋白的已知方法。例如，本领域技术人员可制备与人ZNFN3A1蛋白功能上等同的蛋白质，所述制备可通过经由定点诱变将适宜突变引入人ZNFN3A1蛋白质的氨基酸序列来进行(Hashimoto-Gotoh，T.et al.(1995)，Gene 152，271-275；Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)，MethodsEnzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)，Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W，and Fritz HJ.(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)，Methods Enzymol.85，2763-2766)。氨基酸突变也可天然存在。本发明所用的蛋白质包括具有这样的人ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列的那些蛋白质，其中一或多种氨基酸被突变，条件是产生的突变蛋白质与人ZNFN3A1蛋白在功能上等同。所述突变体中待突变的氨基酸的数目通常为10个以下，优选6个以下，更优选3个以下。SET结构域“NHSCXXN”(SEQ ID NO：54)和“GEELXXXY“(SEQ ID NO：55)可在突变蛋白的氨基酸序列中保守以保持甲基转移酶活性(“X”表示任何氨基酸)。
突变的或修饰的蛋白质，其氨基酸序列通过具体氨基酸序列的一或多个氨基酸残基的缺失，添加和/或取代进行修饰的蛋白质，已知可保持原来的生物活性(Mark，D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666，Zoller，M.J.& Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500，Wang，A.et al.，Science 224，1431-1433，Dalbadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
待突变的氨基酸残基优选突变成不同的氨基酸，其中氨基酸侧链的性质是保守的(已知为保守氨基酸取代的过程)。氨基酸侧链的性质的实例是疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，并且所述侧链具有以下共同的功能基团或性质：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含有羟基的侧链(S，T，Y)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和氨基化合物的侧链(D，N，E，Q)；含有碱基的侧链(R，K，H)；以及含有芳香基团的侧链(H，F，Y，W)。括号内的字母是氨基酸的单字母代码。
将一或多个氨基酸残基添加到人ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：51)所得的蛋白质实例是含有人ZNFN3A1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人ZNFN3A1蛋白和其它肽或蛋白的融合物，并且用于本发明。融合蛋白可通过本领域技术人员已知的技术制备，诸如通过将编码本发明的人ZNFN3A1蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白的DNA相连，使得框架匹配，将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达所述载体。对于与本发明的蛋白融合的肽或蛋白质没有限制。
能够作为与本发明蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，FLAG(Hopp，T.P.等，Biotechnology(1988)6，1204-1210)、含6个His(组氨酸)残基的6xHis、10xHis、流感病毒凝激素(HA)、人类c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-标记、HSV-标记、E-标记、SV40 T抗原片段、lck标记、α-微管蛋白片段、B-标记、C蛋白片段等。可以与本发明蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖-结合蛋白)等等。
融合蛋白可通过使商业可得的、编码上述融合肽或蛋白的DNA与编码本发明的蛋白相融合并表达制备的融合DNA来制备。
本领域已知的另一种分离功能等同蛋白的方法是例如，利用杂交技术的方法(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold SpringHarbor Lab.Press，1989)。本领域技术人员可轻易分离与完整或部分ZNFN3A1 DNA序列具有高度同源性的DNA(例如，SEQ ID NO：50)，以及从分离的DNA中分离人ZNFN3A1蛋白的功能等同蛋白。用于本发明的蛋白包括与编码人ZNFN3A1蛋白的完整或部分DNA序列杂交的DNA编码的那些，以及与人ZNFN3A1蛋白在功能上等同的那些。这些蛋白质包括与源自人或小鼠的蛋白质相应的哺乳动物同源物(例如猴，大鼠，兔和牛基因编码的蛋白质)。对于从动物分离与编码人ZNFN3A1蛋白高度同源的cDNA而言，具体优选使用来自骨骼肌、睾丸，HCC或结肠直肠肿瘤的组织。
用于分离编码与人ZNFN3A1蛋白在功能上等同的蛋白质的DNA的杂交条件可由本领域技术人员常规选择。例如，杂交可通过利用“Rapid-hybbuffer”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃预杂交30min以上，加入标记的探针，以及在68℃加热1小时以上来进行。例如可在低度严谨条件下进行以下洗涤步骤。低度严谨条件例如，42℃，2X SSC，0.1％SDS，或优选50℃，2X SSC，0.1％SDS。更优选，使用高度严谨条件。高度严谨条件例如在2XSSC，0.01％SDS中于室温在20min间洗涤3次，然后在1x SSC，0.1％SDS中于37℃在20min间洗涤三次，并在1x SSC，0.1％SDS中于50℃在20min间洗涤两次。然而，多种因素诸如温度和盐浓度可影响杂交严谨度并且本领域技术人员可选择适宜因素以达到需要的严谨度。
也可使用基因扩增法替代杂交，例如聚合酶链反应(PCR)法，其可用于利用基于编码人ZNFN3A1蛋白(SEQ ID NO：51)的DNA(SEQ ID NO：50)的序列信息合成的引物，分离编码与人ZNFN3A1蛋白功能等同的蛋白的DNA。
由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的人ZNFN3A1蛋白的功能等同蛋白质通常与人ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列高度同源。“高度同源性”(也称为“高度同一性”)通常指两种最佳比对的序列(多肽或多核苷酸序列)之间的同一性程度。通常，高度同源性或同一性指40％以上，优选60％以上，更优选80％以上，更优选85％，90％，95％，98％，99％，以上的同源性。两种多肽或多核苷酸序列之间的同源性或同一性程度可通过“Wilbur，W.J.and Lipman，D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80，726-730”中的算法确定。
本发明所用的蛋白质的氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的存在或不存在或形式可不同，根据用于产生它的细胞或宿主或采用的纯化方法而定。但是，只要其与人ZNFN3A1蛋白(SEQ ID NO：51)在功能上等同，就可用于本发明。
通过本领域熟练技术人员公知的方法，本发明蛋白可以作为重组蛋白或天然蛋白制备。重组蛋白可通过将编码本发明蛋白的DNA(例如包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.50的DNA)插入到合适的表达载体中，将载体引入到合适的宿主细胞中，获取提取物，并通过使提取物经层析，例如，离子交换层析、反相层析、凝胶过滤或利用固定了针对本发明蛋白的抗体的柱子的亲和层析，或通过不止一个前述柱子的结合来制备和纯化蛋白。
并且当本发明蛋白作为与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的融合蛋白、或者作为增加了多个组氨酸的重组蛋白在宿主细胞(例如，动物细胞和大肠杆菌(E.coli)内表达时，表达的重组蛋白可利用谷胱甘肽柱或镍柱纯化。
在纯化融合蛋白后，还有可能根据需要用凝血酶或因子-Xa通过切割除去目的蛋白之外的区域。
天然蛋白可通过本领域技术人员已知的方法，例如，通过使亲和柱(该柱结合有下文所述的与ZNFN3A1蛋白结合的抗体)，与表达本发明蛋白的组织或细胞的提取物接触来分离。抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。
本发明中，ZNFN3A1蛋白的甲基转移酶活性可通过本领域已知的方法测定。例如，ZNFN3A1和基质可与标记的甲基供体在适宜的测定条件下保温。组蛋白H3，组蛋白H3肽，以及S-腺苷-[甲基-14C]-L-甲硫氨酸，或S-腺苷-[甲基-3H]-L-甲硫氨酸优选可分别用作基质和甲基供体。放射性标记向组蛋白或组蛋白肽的转移可通过例如SDS-PAGE电泳和荧光照相法来检测。可选，反应后，可通过过滤将组蛋白或组蛋白肽从甲基供体中分离，保留在滤纸上的放射性标记的量可通过闪烁计数法定量。其它可与甲基供体连接的适宜标记诸如发色性和荧光标记，以及检测这些标记向组蛋白和组蛋白肽的转移的方法是本领域已知的。
可选，ZNFN3A1的甲基转移酶活性可利用未标记的甲基供体(例如S-腺苷-L-甲硫氨酸)以及选择性识别甲基化的组蛋白或组蛋白肽的试剂进行测定。例如，在能将基质甲基化的条件下保温ZNFN3A1、待甲基化的基质以及甲基供体之后，可通过免疫学方法检测甲基化的基质。利用识别甲基化的基质的抗体的免疫技术可用于检测。例如，抗甲基化的组蛋白的抗体可购得(abcam Ltd.)。利用识别甲基化的组蛋白的抗体的ELISA或免疫印迹可用于本发明。
除了利用抗体，甲基化的组蛋白可利用以高亲合力选择性结合甲基化的组蛋白的试剂检测。所述试剂是本领域已知的并可通过本领域已知的筛选测定法确定。示例性结合试剂是异染色质蛋白HP1，当其在赖氨酸4甲基化时结合组蛋白H3(H3-K4)。HP1，或其结合片段可被标记，并可检出与甲基化的H3-K4结合的HP1或片段。可选，HP1或片段无需被标记，并可利用抗HP1抗体在ELISA测定法中检出。
本发明中，可采用促进基质甲基化的试剂。例如，Flag标记的ZNFN3A1的H3甲基转移酶活性在存在S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)时明显高于不存在SAHH的情况(图3d)。因此，SAHH或其功能等同物是促进甲基化的优选试剂。所述试剂促进基质甲基化，由此可高度敏感地测定甲基转移酶活性。ZNFN3A1可与基质以及辅助因子在所述促进剂存在的条件下接触。
各种低通量和高通量酶测定法模式是本领域已知的，并可用于检测或测定ZNFN3A1的甲基转移酶活性。对于高通量测定法，组蛋白和组蛋白肽基质可方便地固定于固体支持物上，诸如多孔板，玻片或芯片。反应后，甲基化的产物可通过上述方法在固相支持物上检出。可选，甲基转移酶反应可在溶液中发生，然后组蛋白或组蛋白肽可固定在固相支持物上，并检出甲基化的产物。为了有利于所述测定，该固相支持物可用链霉抗生物素包被而组蛋白可用生物素标记，或固相支持物可用抗组蛋白抗体包被。本领域技术人员可根据所需的筛选通量容量确定适宜的测定模式。
ZNFN3A1或其功能等同物需要热休克蛋白90A(HSP90A)来表达甲基转移酶活性。因此，干扰ZNFN3A1或其功能等同物与HSP90A的结合的化合物可用于调节甲基转移酶活性。可通过以下方法筛选这样的化合物。因此，本发明还提供筛选用于治疗结肠直肠癌或肝细胞癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使选自下组的多肽与热休克蛋白90A多肽(HSP90A)在存在受试化合物的条件下接触：
i.包含氨基酸序列SEQ ID NO：51的多肽；
ii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：51的多肽，其中一或多个氨基酸被取代，缺失或插入，并且所述多肽具有与氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的多肽等同的生物活性；
iii.包含与SEQ ID NO：51具有至少大约80％同源性的氨基酸序列的多肽；和
vi.在严谨条件下与核苷酸序列SEQ ID NO：50组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的多肽等同的生物活性；
b.检测所述多肽与HSP90A之间的结合；
c.比较存在所述受试化合物与不存在所述受试化合物的条件下，所述多肽与HSP90A的结合，和
d.选择降低所述多肽和HSP90A之间的结合的受试化合物。
本发明中，多肽与HSP90A的结合可通过本领域技术人员已知的任何适宜方法检测。例如，所述多肽或HSP90A中的一种可结合于固相支持物，另一种可用检测用标记物质标记。标记物质诸如放射性同位素(例如，3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(例如，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶)，荧光物质(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明)，和生物素/抗生物素蛋白，可用于标记本发明方法的多肽或HSP90A。用于检测标记物质的方法也是已知的。
本发明还包括本发明蛋白的部分肽的用途。部分肽具有特异于ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列，其由至少约400个氨基酸，通常少于约200，并通常少于约100个氨基酸，并且至少约7个氨基酸。优选约8个氨基酸以上，更优选约9个氨基酸以上组成。所述部分肽可用于例如筛选结合ZNFN3A1蛋白质的化合物，筛选ZNFN3A1与其辅助因子诸如SAM之间结合的抑制物。含有SET结构域的部分肽优选用于这些筛选。
用于本发明的部分肽可通过遗传改造，通过肽合成的已知方法，或通过利用适宜的肽酶消化本发明的蛋白来制备。对于肽合成，可使用例如固相合成或液相合成。
SET结构域突变的ZNFN3A1突变体显示细胞增殖的抑制性效应(图4或5)。因此，ZNFN3A1的部分肽优选包括SET结构域“NHSCXXN”(SEQ IDNO：54)和/.和或“GEELXXXY”(SEQ ID NO：55)。
本发明筛选用于治疗或预防HCC或结肠直肠癌的化合物的方法的另一实施方案中，所述方法利用ZNFN3A1与其辅助因子诸如SAM的结合能力。在结合S-腺苷-L-甲硫氨酸的SET结构域中具有突变的蛋白质抑制癌细胞增殖。这些发现提示ZNFN3A1通过其与分子诸如S-腺苷-L-甲硫氨酸的结合发挥细胞增殖功能。因此，抑制ZNFN3A1与其辅助因子之间的结合导致细胞增殖的抑制，抑制所述结合的化合物可作为用于治疗或预防HCC或结肠直肠癌的药物。
所述筛选方法包括以下步骤：
a.在受试化合物存在的条件下，使包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：51的连续氨基酸序列、并且其中氨基酸序列包含NHSCDPN(SEQ ID NO：52)和/或GEELTICY(SEQ ID NO：53)的多肽与S-腺苷-L-甲硫氨酸接触；
b.检测所述多肽与S-腺苷-L-甲硫氨酸之间的结合；
c.比较存在所述受试化合物与不存在所述受试化合物的条件下，所述多肽与S-腺苷-L-甲硫氨酸的结合，和
d.选择降低所述多肽和S-腺苷-L-甲硫氨酸之间的结合的受试化合物。
用于筛选的多肽可为重组多肽或天然多肽，或可为部分肽，只要其保持与S-腺苷-L-甲硫氨酸结合的能力即可。用于筛选的多肽可为例如纯化的多肽，可溶性蛋白，与载体结合的形式，或与其它多肽融合的融合蛋白。
可以使用任何受试样品，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物以及天然化合物。
用于本发明所述测定法中的受试化合物也可为特异性结合ZNFN3A1或缺乏甲基转移酶活性的抗部分ZNFN3A1肽的抗体。例如，可检测抗体(例如单克隆抗体)阻断ZNFN3A1与其基质S-腺苷-L-甲硫氨酸或HSP90A之间的结合的能力。类似地可检测部分ZNFN3A1肽抑制ZNFN3A1与其基质S-腺苷-L-甲硫氨酸或HSP90A结合的能力，其可用作ZNFN3A1活性的抑制物。所述抗体和部分肽因此可用作ZNFN3A1活性的抑制物。
作为筛选抑制ZNFN3A1与S-腺苷-L-甲硫氨酸的结合的化合物的方法，许多本领域已知的方法可用。所述筛选可作为体外测定系统进行，例如在细胞系统中。更具体地，首先，所述多肽，或S-腺苷-L-甲硫氨酸结合于支持物，并且加入其它成分以及受试样品。然后，保温混合物，洗涤，检测和/或测定其它结合于支持物的成分。
可用于结合蛋白的支持物的实例包括不溶性多糖，诸如琼脂糖，纤维素，和葡聚糖；以及合成树脂，诸如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯以及硅；优选使用由上述物质制备的可购得的珠子以及板(例如多孔板，生物传感器芯片等)。使用珠子时，它们可被填入柱子。
多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸与支持物的结合可根据常规方法进行，诸如化学键合，以及物理吸附。可选，多肽可通过特异性识别它的抗体而与支持物结合。此外，多肽与支持物的结合也可通过抗生物素蛋白和生物素的结合来进行。
多肽与S-腺苷-L-甲硫氨酸之间的结合在缓冲液中进行，例如但不限于磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液，只要所述缓冲液不抑制蛋白之间的结合即可。
本发明中，利用表面胞质团共振现象的生物传感器可用作检测或定量所述多肽与S-腺苷-L-甲硫氨酸之间的结合的装置。当使用所述生物传感器时，多肽与S-腺苷-L-甲硫氨酸之间的相互作用可作为表面胞质团共振信号实时观察到，而这利用仅仅极少量的多肽且无需标记(例如，BIAcore，Pharmacia)。因此，可利用生物传感器诸如BIAcore来评估多肽以及多肽和S-腺苷-L-甲硫氨酸之间的结合。
可选，多肽或多肽和S-腺苷-L-甲硫氨酸可被标记，并且所述标记可用于检测或测定结合的多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸。具体地，预标记多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸之一之后，标记的成分与另一成分在受试化合物存在的条件下接触，洗涤后根据标记检测或测定结合的成分。
标记物质诸如放射性同位素(例如，3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(例如，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶)，荧光物质(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明)，和生物素/抗生物素蛋白，可用于标记本发明方法的多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸。当多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸用放射性同位素标记时，可通过液体闪烁法进行检测或测定。可选，用酶标记的多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸可通过加入酶的基质以利用光度计检测基质的酶促改变诸如颜色的产生来检测或测定。此外，如果荧光物质用作标记，结合的成分可利用荧光光度计检测或测定。
此外，多肽与S-腺苷-L-甲硫氨酸的结合也可利用多肽的抗体检测或测定。例如，使固定在支持物上的S-腺苷-L-甲硫氨酸与受试化合物以及多肽接触之后，保温所述混合物并洗涤，并可利用抗所述多肽的抗体进行检测或测定。
如果在本发明的筛选中使用抗体，所述抗体优选利用上述标记物质之一进行标记，并基于标记物质进行检测或测定。此外，本发明的筛选中与蛋白结合的抗体可利用蛋白G或蛋白A柱进行检测或测定。
通过筛选分离的化合物是抑制ZNFN3A1甲基转移酶的药物的候选物，并可用于治疗或预防HCC或结肠直肠癌。
此外，其中的部分结构抑制ZNFN3A1的甲基转移酶活性的化合物通过添加，缺失和/或取代来转化，并也包含在可通过本发明的筛选方法获得的化合物中。
如上所述，抑制ZNFN3A1的甲基转移酶活性的化合物可为缺乏甲基转移酶活性的部分ZNFN3A1肽或可为抗ZNFN3A1的抗体。本文术语“抗体”指这样的免疫球蛋白分子，其具有仅与用于合成所述抗体的抗原或与其紧密相关的抗原相互作用(即，结合)的具体结构。此外，抗体可为抗体片段或修饰的抗体，只要其结合ZNFN3A1基因编码的蛋白即可。例如，抗体片段可为Fab，F(ab’)2，Fv，或单链Fv(scFv)，其中H和L链的Fv片段通过适宜的接头连接(Huston J.S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883(1988))。更具体地，抗体片段可通过利用酶处理抗体产生，所述酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。可选可构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体并在适宜宿主细胞中进行表达(见例如，Co M.S.et al.J.Immunol.152：2968-2976(1994)；Better M.and Horwitz A.H.Methods Enzymol.178：476-496(1989)；Pluckthun A.and Skerra A.Methods Enzymol.178：497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121：652-663(1986)；Rousseaux J.et al.Methods Enzymol.121：663-669(1986)；Bird R.E.andWalker B.W.Trends Biotechnol.9：132-137(1991))。
可通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)偶联来修饰抗体。本发明提供所述修饰的抗体。所述修饰的抗体可通过对抗体的化学修饰获得。所述修饰方法是本领域常规的。可选，抗体可包括具有源自非人抗体的可变区以及源自人抗体的恒定区的嵌合抗体，或包括源自非人抗体的互补决定区(CDR)，源自人抗体的框架区(FR)以及恒定区的人源化抗体。所述抗体可通过利用已知技术制备。人源化可通过利用相应的人抗体序列取代啮齿类的CDR或CDR序列来进行(见例如，Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))。因此，所述人源化抗体可为嵌合抗体，其中基本上少于完整人可变结构域被非人物种的相应序列取代。
包含人可变区以及人框架和恒定区的完整人抗体也可使用。所述抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法涉及使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(e.g.，Hoogenboom & Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)，类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白位点引入转基因动物来制备，例如其中内源性免疫球蛋白基因被部分或完全失活的小鼠。该方法的描述见于例如美国专利6,150,584，5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。
当由本发明的方法分离的化合物作为药物给药人类或其它哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、小鸡、猫、绵羊、猪、牛、猴子、狒狒(baboon)、黑猩猩(chimpanzee)时，分离的化合物可以直接给药，或者可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。例如，根据需要，药物可以作为糖衣片剂、胶囊、药酒和微胶囊口服，或者用水或其它任何药学上可接受的液体配制成用于注射的无菌溶液或悬液形式，非口服给予。例如，化合物可以与药学上可接受的载体或介质，具体地，无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、媒介物、保存剂、粘附剂等，以药物实施通常所接受的单位剂量的形式进行混合。这些药剂中活性成分的含量在指定范围内可获得适当的剂量。
能够混合到片剂和胶囊中的添加剂的例子有，粘附剂例如明胶、玉米淀粉、黄芪胶和阿拉伯胶；赋形剂例如微晶纤维素；膨胀剂例如玉米淀粉、明胶和海藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁；甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精；调味剂例如薄荷油、Gaultheria adenothrix油和樱桃。当单位剂量形式为胶囊时，上述成分中还可以包括液体载体，例如油。用于注射的无菌组合物可以利用媒介物例如用于注射的蒸馏水，按照常规的药物实施进行配制。
生理盐水、葡萄糖以及其它等渗液体包括助剂，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，可以用作为注射水溶液。这些可以与合适的增溶剂联合使用，例如醇类，特别是乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，例如Polysorbate 80 (TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可用作油质液体，可以与苯甲酸苄酯或苯甲醇联合用作增溶剂，还可与缓冲液，例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液；镇痛剂，例如盐酸普鲁卡因；稳定剂，例如苯甲醇、酚；以及抗氧化剂一起配制。制备的注射剂可以填充到合适的安瓿中。
可以利用本领域熟练技术人员所公知的方法向患者给药本发明的药物化合物，例如作为动脉注射、静脉注射、经皮注射，并且还可以作为鼻内、经支气管、肌内或口服给药。给药的剂量和方法根据患者的体重和年龄以及给药方法而变化；不过，本领域熟练技术人员能够常规选择它们。如果所述化合物由DNA编码，可将该DNA插入到基因治疗载体中，并给药载体进行治疗。给药的剂量和方法根据患者的体重、年龄和症状变化，但是本领域熟练技术人员能够适当地选择它们。
举例来说，当向标准成年人(体重60kg)口服给药时，虽然就症状而言存在某些差异，但与本发明蛋白结合并调节其活性的化合物的剂量为约0.1mg-100mg每天，优选约0.1mg-50mg每天，更优选约1.0mg-20mg每天。
当以注射形式向标准成年人(体重60kg)肠胃外给药时，虽然就患者、靶器官、症状和给药方法而言存在某些差异，但可以很方便地经静脉内注射约0.01mg-约30mg每天，优选约0.1mg-约20mg每天，更优选约0.1mg-约10mg每天的剂量。在其它动物的情况下，可以按60kg体重的标准换算给药量。
本发明还提供了治疗受试者中的HCC或结肠直肠癌的方法。给药可为对可能患(或易患)或患有与ZNFN3A1的甲基转移酶活性异常相关疾病的受试者预防性或治疗性给药。所述方法包括降低HCC或结肠直肠癌细胞中ZNFN3A1的功能。功能可通过给药通过本发明的筛选方法获得的化合物来抑制。
另一方面，本发明包括药物或治疗组合物，其含有本发明所述的一或多种治疗化合物。可选，本发明还提供本文所述的一或多种治疗性化合物在制备用于治疗和/或预防HCC或结肠直肠癌的药物或治疗组合物中的用途。药物配制剂可包括适于口服，经结肠、经鼻、经局部(包括经颊或舌下)、经阴道或经胃肠外(包括经肌内、皮下和静脉内)给药的那些，以及通过吸入或吹入给药的那些。在适宜的情况下，配制剂可方便地存在离散的剂量单位中并可通过制药领域已知的任何方法制备。所有所述药学方法都包括按需要将活性化合物与液体载体和/或细微切割的固体载体接触，然后如果需要将产物成型成所需配制剂的步骤。
适于口服给药的药物配制剂可方便地作为离散的单位，诸如胶囊，扁囊或片剂存在，每种都含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；或作为溶液，悬液或作为乳液。活性成分也可作为药糖丸或糊剂，并可为纯的形式，即不含载体。用于口服给药的片剂和胶囊可含有常规赋形剂诸如粘合剂，填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。片剂可通过压缩或模制制备，其中可选含有一或多种配方成分。压缩的片剂可通过在适宜的机器中将活性成分压缩成自由流动的形式诸如粉末或颗粒，可选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑性，表面活性或分散剂混合。模制的片剂可通过在适宜的机器中模制利用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物来制备。所述片剂可根据本领域已知的方法包被。口服液体制备物可以为例如含水或油性混悬液，溶液，乳液，糖浆或酏剂，或可作为干的产物在使用前利用水或其他适宜载体溶解。所述液体制备物可含有常规添加剂诸如混悬剂，乳化剂，非水性载体(其可包含食用油)，或防腐剂。片剂可选配制成以缓慢或以受控的方式释放其中的活性成分的形式。
胃肠外给药的配制剂包括含水和不含水的无菌注射溶液，其中含有抗氧化剂、缓冲剂，抑菌剂和使得配制剂与目的受试者的血液等张的溶质；以及含水和不含水的无菌混悬液，其可包含混悬剂以及增稠剂。所述配制剂可存在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并可储存在冷冻-干燥的(冻干的)条件下，仅仅需要在使用前即刻添加无菌液体载体，例如盐水，注射用水。可选，所述配制剂可用于连续输注。即配即用的注射溶液和悬液可由以前描述的无菌粉末，颗粒以及片剂制备。
直肠给药的配制剂可作为栓剂制备，其中的载体为常用载体诸如可可脂或聚乙二醇。局部口内给药的配制剂，例如经颊或经舌下给药的配制剂包括糖锭，其中在加香的基质诸如蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中含有活性成分，所述配制剂还包括锭剂，其中在基质诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中含有活性成分。对于鼻内给药，本发明获得的化合物可用作液体喷雾剂或可分散的粉末或滴剂的形式。滴剂可与含水或非含水基质配制在一起，也包括一或多种分散剂，助溶剂或混悬剂。液体喷雾可常规自压缩的包装递送。
对于通过吸入给药，化合物可方便地自吹入器、雾化器、加压的包装或其他用于递送气溶胶喷雾的方便装置递送。加压的包装可包括适宜的推进剂诸如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他适宜气体。对于加压的气溶胶，剂量单位可通过提供阀来递送计量的量来确定。
可选，对于通过吸入或吹入给药，所述化合物可为干粉组合物，例如该化合物与适宜粉末基质诸如乳糖和淀粉的混合粉末。所述粉末组合物可以单位剂量的形式存在于例如胶囊、药筒、凝胶或发泡的包装中，通过吸入器或吹入器可给药所述组合物。
需要时，可采用上述适于持续释放活性成分的配制剂。所述药物组合物也可含有其他活性成分诸如抗微生物剂，免疫抑制剂或防腐剂。
应理解除了上述具体的成分，本发明的配制剂也可包括本领域对于目的配制剂类型常用的其他试剂，例如适于口服给药的那些可包括加香剂。
优选的单位剂量配制剂是含有有效剂量的活性成分的那些，如下所述，或其适宜的部分。
对于每种前述的情形，所述组合物可以约0.1-约250mg/kg每天的剂量口服或经注射给药。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选约5mg-约10g/天，更优选约100mg-约3g/天。片剂或其他以离散单位提供的单位剂量形式可方便地包含在所述剂量有效的量或作为其复数形式，例如含有约5mg-约500mg，通常约100mg-约500mg的单位。
所述药物组合物优选口服或通过注射(经静脉内或皮下)给药，给药受试者的精确的量由主治医师决定。但是，所用的量有赖于多种因素，包括受试者的年龄和性别，被治疗的确切的疾病，以及其严重性。给药途径还有赖于疾病及其严重性。
实施例1：一般方法
体外组蛋白甲基转移酶(HMTase)测定法
293T细胞用表达Flag标记的ZNFN3A1(pFLAG-CMV-ZNFN3A1)、SET7蛋白或模拟的质粒转染，利用抗Flag抗体通过免疫沉淀纯化标记的蛋白。体外HMTase测定法根据方案(1)稍加改动进行。简言之，免疫沉淀的蛋白与作为基质25μg游离组蛋白(H3，H2B，H2A和H4的混合物；Roche)，作为甲基供体的2.5μCi S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸，在40μl甲基化酶活性缓冲液混合物(50mM Tris-HCl pH 8.5，20mM KCl，10mM MgCl2，10mM β-巯基乙醇，250mM蔗糖)中在37 ℃保温60min。为测定组蛋白H3甲基转移酶活性，将免疫沉淀的蛋白质与1μg重组组蛋白H3(Upstate)基质和2μCiS-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸(SAM)(Amersham Biosciences)甲基供体在20μl甲基化酶活性缓冲液混合物(50mM Tris-HCl pH 8.5，100mM NaCl，10mM DTT)中、30℃保温1小时。蛋白质通过18％SDS-PAGE分离并通过考马斯染色和荧光照相法显示。
体外组蛋白H3甲基转移酶(HMTase)测定法
H3-K4特异性甲基转移酶活性通过对与存在20μM未标记的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和2μgHSP90A的条件下与免疫沉淀物在30℃保温1hr的重组Xenopus H3蛋白(UBI)进行western印记分析来检测，其中利用抗单甲基化的(Abcam；ab8895)，二-甲基化的(Abcam；ab7766)，三-甲基化的(Abcam；ab8580)H3-K4，总H3(Abcam；ab1791)，和三-甲基化的H3-K9(UBI；07523)的抗体进行。用表达Flag标记的野生型ZNFN3A1，突变ZNFN3A1，SET7/9，SUV39H1，或模拟的质粒转染的细胞的裂解物利用抗Flag抗体(Sigma)免疫沉淀。利用对于二-甲基化的H3-K4(Abcam；ab7768，ARTK-Me2-QTAR-GGC)和二-甲基化的 H3-K9(Abcam；ab1772，QTARK-Me2-ST-GGC)的肽进行竞争实验。重组ZNFN3A1在具有表达GST-融合的ZNFN3A1的质粒的大肠杆菌细胞或具有表达HA标记的ZNFN3A1的质粒的Sf9细胞中表达。H3-甲基转移酶活性也在存在或不存在0.04USAHH(Sigma)时利用纯化自Sf9细胞的免疫沉淀的ZNFN3A1蛋白或重组ZNFN3A1分析。
集落形成测定
野生型ZNFN3A1和突变ZNFN3A1(ΔEEL和ΔNHSC)的整个编码序列被克隆入p3xFLAG-CMV-10(SIGMA)的适宜克隆位点。被设计为表达野生型ZNFN3A1(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1)或突变ZNFN3A1(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔEEL，p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔNHSC)的有义链的质粒，或对照质粒(p3xFLAG-CMV-10)利用FuGENE6试剂根据提供商(Roche)的建议转染入HEK293，结肠直肠癌细胞或肝癌细胞。转染的细胞保持在补充有最佳浓度的遗传霉素的培养基中。细胞存活力利用CellCounting Kit-8根据生产商的方案(DOJINDO)进行测定。
通过cDNA微阵列鉴定下游基因
不表达ZNFN3A1的HEK293细胞利用pcDNA-ZNFN3A1或模拟载体转染。转染后18小时提取RNA，用Cy3或Cy5染料标记，并共杂交到含有前述的13,824个基因的内部cDNA微阵列载片上(2，3)。数据标准化之后，进一步分析信号高于截留值的基因。
染色质免疫沉淀(ChIP)测定法
HEK293，HepG2和Huh7细胞利用pFLAG-CMV-ZNFN3A1转染然后在1％甲醛中固定。利用ChIP测定试剂盒根据生产商(Promega)的说明对固定的染色质样品进行免疫沉淀。来自HEK293细胞的DNA利用抗Flag抗体和抗二甲基化的组蛋白H3抗体沉淀，来自HepG2和Huh7细胞的DNA利用抗-ZNFN3A1沉淀。用于ChIP测定法的引物组显示于表1。
表1用于ChIP测定法的引物 SEQ ID No；
萤光素酶测定法.
Nkx2.8启动子的片段通过PCR利用以下引物组扩增：5’-AGCGGGCCTGGTACCAAATTTGTG-3’(SEQ ID NO；46)和5’-CCGGGATGC标记CGCATTTACAGC-3’(SEQ ID NO；47)，并将产物克隆入pGL3碱性载体(pGL3-Nkx2.8-wtZBE)。利用QuickChange定点诱变试剂盒、根据提供商的推荐(Stratagene)，将突变报道质粒(pGL3-Nkx2.8-mutZBE)通过取代pGL3-Nkx2.8-wtZBE中的ZNFN3A1-结合序列(CCCTCCT被取代为CCGACCT以及GAGGGG被取代为GTCGGG)来制备。利用Dual-Luciferase Reporter Assay System(双-荧光素酶报道测定系统)根据生产商的指示(Promega)进行荧光素酶测定。
HEK293-Nkx2.8Luc细胞的建立
利用FuGENE6试剂、根据提供商(Roche)的建议，HEK293-Nkx2.8Luc细胞的适宜转化体通过将pGL3-Nkx2.8-wtZBE和pcDNA(+)3.1质粒(10∶1)转染入HEK293细胞来建立。转染的细胞保持载补充有0.9μg/μl遗传霉素的培养基中，转染后2周选出单个集落。
细胞系
人胚胎肾293(HEK293)和人宫颈癌(HeLa)细胞获自IWAKI。人肝细胞瘤细胞系HepG2，人宫颈癌细胞系HeLa，和人结肠癌细胞系HCT116获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。另一种人肝细胞瘤细胞系Huh7获自Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB)，而SNU423和SNU475获自韩国细胞系文库(Korea cell-line bank)。所有细胞系在适宜培养基中以单层生长。
RT-PCR
标准RT-PCR在20μl PCR缓冲液(TAKARA)中进行，并在94℃扩增4min以变性，然后以94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s在Gene Amp PCRsystem 9700(Perkin-Elmer)中进行30个循环。用于RT-PCR试验的引物序列显示于表2。
表2 用于RT-PCR的引物 SEQ ID No；
ZNFN3A1突变形式的Western印迹分析
用表达Flag标记的ZNFN3A1的野生型和各种突变形式的质粒转染的细胞利用ZNFN3A1抗体和抗-Flag抗体进行免疫印迹。表达ZNFN3A1的突变形式的质粒被克隆入p3xFLAG-CMV-10载体，其中利用表3所示的引物组扩增PCR产物。
SEQ ID
表3 用于构建突变型ZNFN3A1的引物 No；
实施例2：测定ZNFN3A1的甲基转移酶活性
制备含有ZNFN3A1的野生型SET结构域的蛋白质以及缺乏两个区域之一的两种形式的突变蛋白，通过暴露于UV照射将等量的每种蛋白与[3H]-标记的SAM交联。如图1b所示，野生型SET结构域能与[3H]-标记的SAM反应而没有突变体可与之反应，表明SET结构域可与甲基供体的反应。野生型SET和对照重组SET蛋白与[3H]-标记的SAM以及作为基质的组蛋白混合物进一步保温，在SDS-PAGE上分离标记的蛋白之后进行测定。如所预期的那样，通过对照SET7检测到对应[3H]-标记的组蛋白H3蛋白的强带(图1c，泳道3)。当基质与ZNFN3A1的野生型SET一同保温时，检测到对应标记的组蛋白H3的弱带，利用模拟进行观察时没有发现这条带(图1c，泳道1和2)。
由于酵母双杂交子筛选将HSP90A鉴定为ZNFN3A1的相互反应蛋白，假设HSP90A可支持SET的蛋白折叠。为了检测该假设，将SAM和组蛋白与野生型SET以及重组HSP90A蛋白一同保温，导致对组蛋白H3的甲基转移酶活性增加(图1c，泳道4和5)。这些数据证实ZNFN3A1通过修饰染色质结构以及相关的RNA聚合酶II活性调节下游基因的表达。
实施例3：ZNFN3A1的组蛋白H3甲基转移酶活性
由于含有SET结构域的蛋白在组蛋白组蛋白H3赖氨酸4(H3-K4)或赖氨酸9(H3-K9)的甲基化中起重要作用，我们研究了ZNFN3A1是否具有使H3-K4或H3-K9甲基化的能力。我们将重组组蛋白H3在存在SAM和HSP90A的条件下与野生型和突变ZNFN3A1和SET7在体外一同保温。与以前的报道一致(26)，SET增强H3-K4的单和二甲基化，但不诱导其三甲基化(图2a，泳道2)。另一方面，野生型ZNFN3A1不导致单甲基化。但是，其可导致H3-K4的二和三甲基化(图2a，泳道3)。甲基化可通过加入二甲基化的H3-K4肽完全抑制，但不受加入二甲基化的H3-K9肽的影响(图2b)。利用H3-K9的试验表明H3-K9既不被野生型也不被突变ZNFN3A1甲基化(图2c)，提示ZNFN3A1具有H3-K4-特异性甲基转移酶活性。
实施例4：重组ZNFN3A1.的组蛋白H3-K4甲基转移酶活性
此外，野生型和突变ZNFN3A1的整个编码区被克隆进pGEX6P-1载体的适宜克隆位点中，并在DH10B细胞中表达。重组GST-ZNFN3A1融合蛋白利用Sepharose 4B珠(Amersham)纯化，并利用Precision蛋白酶(Amersham)根据供应商的方案(图3a，泳道4)进一步分离重组ZNFN3A1。重组ZNFN3A1在体外也显示对组蛋白H3的HMTase活性(图3b)。利用抗二甲基化的和抗三甲基化的H3-K4抗体进行的Western印迹分析证实重组ZNFN3A1诱导组蛋白H3-K4的二-甲基化和三-甲基化(图3c，分别示于上图和下图)。由于S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)水解从SAM催化获得的SAH并抑制甲基化和增强甲基转移酶活性(4)，我们研究了SAHH是否影响ZNFN3A1的组蛋白H3甲基转移酶活性。Flag-标记的ZNFN3A1的H3甲基转移酶活性在存在SAHH时明显高于缺乏SAHH的情况(图3d)。
实施例5：ZNFN3A1的HMTase活性与癌细胞增殖之间的关系
为了分析HMTase活性对细胞生长的影响，我们通过转染表达ZNFN3A1的野生型(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1)或HMTase-无活性突变形式(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔEEL，p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔNHSC)的质粒或对照质粒(p3xFLAG-CMV)来进行集落形成试验。在不表达内源ZNFN3A1的HEK293中，野生型ZNFN3A1的转导产生的集落明显多于对照或突变ZNFN3A1，其反映了ZNFN3A1的致癌活性(图4a)。一致地，在HCT116结肠癌细胞中利用p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1转染与对照相比增加了集落的数目(图4b)。另一方面，利用p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔEEL转染导致与p3xFLAG-CMV相比HCT116细胞的生长降低，提示突变ZNFN3A1可影响内源ZNFN3A1的功能。此外，我们还研究了突变形式的质粒在各种结肠直肠癌细胞系以及肝癌细胞系中的生长抑制作用(图5)。结果显示，无HMTase活性的ZNFN3A1(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔEEL，p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔNHSC)的转导与对照相比明显降低癌细胞的生长，提示ZNFN3A1的HMTase活性与结肠癌和肝癌细胞的增殖有关。
实施例6：鉴定受ZNFN3A1调控的基因
为了鉴定受ZNFN3A1调节的下游基因，将pcDNA-ZNFN3A1转染入通过RT-PCR显示为具有不可检测的ZNFN3A1表达水平的HEK293细胞，并利用含有13,824个基因的cDNA微阵列监测基因表达中的改变。早在12小时的免疫印迹分析显示ZNFN3A1的时间依赖型诱导(图6a)，因此转染后18小时从利用pcDNA-ZNFN3A1转染的细胞以及pcDNA-模拟转染的细胞提取RNA。表达图谱分析鉴定了具有改变的表达的81种基因，其中包括与模拟转染的细胞相比在pcDNA-ZNFN3A1转染的细胞中上调超过3倍的62种基因，以及下调超过3倍的19种基因(表5)。在62种上调的基因中，发现癌基因的组诸如Myc，Crk，JunD，Maf和Wnt10B，参与细胞周期调节的基因(cyclin G1，Cdk2和Topoisomerase II)，以及同源框基因(Nkx2.5，Nkx2.8and LIM homeobox protein 2)通过导入ZNFN3A1上调。与细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E相关地，cdk2在S期进展中起重要作用(5，6)，并且细胞周期蛋白E/cdk2复合体的扩增显示与多种肿瘤包括CRC和HCC的肿瘤进展有关(7，8)。已知同源框基因是发育中形态改变以及肿瘤生成的重要因素(9)。因此ZNFN3A1的表达升高通过这些下游基因的活化在人癌形成中起重要作用。
选择11种上调的基因，其中包括Nkx2.8，C/EBPδ，Nkx2.5，Wnt10B，PIK3CB，NEURL，PSMD9，ECEL1，CRKL，APS，和Seb4D，利用获自ZNFN3A1和模拟转染的细胞的RNA进行RT-PCR。用于半定量RT-PCR的引物组显示于表2。
预期地，结果支持了这些基因的表达通过ZNFN3A1得以增强(图6b)。在Nkx2.8的转录起始位点上游的1.5kb区中搜索推定的ZNFN3A1结合序列。鉴定了两种序列(图7a)。随后利用pFLAG-ZNFN3A1转染的细胞以及抗FlagM2抗体的染色质免疫沉淀(ChIP)测定法证实了含有这些序列的一段基因组片段(ChIP-4)与ZNFN3A1结合，其他不具有ZNFN3A1结合序列的片段(ChIP-1，-2，和-3)不与ZNFN3A1结合(图7b)。ChIP-4片段含有两个推定的结合序列(CCCTCCT和GAGGGG)，它们位于5’侧翼区的-510 bp到-467 bp中(图7a)。制备含有该ZNFN3A1结合元件(ZBE)的双链寡核苷酸探针，进行体外结合测定，利用重组GST，GST-ZNFN3A1，和GST-wtTcf4作为对照(图7c)。用于体外结合测定法的探针显示于表4。
表4 用于体内结合测定法的寡核苷酸 SEQ ID NO；
结果表明含有野生型Tcf4-结合基序(wtTBM)的寡核苷酸探针与GST-wtTcf4结合而不与GST或GST-ZNFN3A1蛋白结合。类似地，尽管ZBE不与GST结合，其能与GST-ZNFN3A1蛋白结合。此外，确定所述相互作用通过加入冷竞争性DNA抑制，提示GST-ZNFN3A1和ZBE之间的特异性相互作用。
表5 受ZNFN3A1上调和下调的基因
上调的基因
癌基因
细胞周期
信号转导
粘附
受体
形态
转录
分泌的
各种酶
其它
下调的基因
细胞周期
转录
分泌性
各种酶
其它
实施例7：ZNFN3A1调节Nkx2.8的转录活性
为了检测ZBE是否导致Nkx2.8在癌细胞中的反式活化，制备报道质粒，其包括克隆的荧光素酶基因上游区的野生型ZBE(pGL3-Nkx2.8-wtZBE)的Nkx2.8的-791到+109，以及包括突变ZBE的(pGL3-Nkx2.8-mutZBE)的报道质粒。这些报道质粒被转染入HepG2或SNU475细胞，并且在存在或不存在ZNFN3A1的siRNA的条件下测定其荧光素酶活性(图7d)。突变报道质粒显示与野生型质粒相比在细胞中的活性明显降低，表明ZBE导致Nkx2.8在细胞中的反式活化。明显地，与表达ZNFN3A1的siRNA的质粒共转染(psiU6BX-ZNFN3A1-12通过将以下双链寡核苷酸克隆入psiU6BX载体的Bbsl位点制备；正向：
5′-CACCAACATCTACCAGCTGAAGGTGTTCAAGAGACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3′(SEQ ID NO；48)，反向：
5′-AAAAAACATCTACCAGCTGAAGGTGTCTCTTGAACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3′(SEQ ID NO；49)(WO2004/76623))降低野生型报道质粒与模拟(psiU6BX-Mock)相比的荧光素酶活性，但不影响突变质粒的活性。
这些数据表明ZNFN3A1通过与ZBE反应直接调节Nkx2.8的转录活性。
实施例8：Nkx2.8与ZNFN3A1的HSP90A依赖性HMTase活性相关
为了测定ZNFN3A1的HMTase活性是否与Nkx2.8的表达相关，以及HSP90A是否参与其调节，用表达野生型或无HMTase活性的突变ZNFN3A1的质粒(ZNFN3A1-ΔEEL和ZNFN3A1-ΔNHSC)转染，利用分离自转染的细胞的RNA进行半定量RT-PCR(图7e)。如预期那样，尽管野生型质粒促进Nkx2.8的表达，两种类型的突变质粒都不能诱导表达。此外，添加HSP90A的特异性抑制物格尔德霉素(geldanamycin)抑制野生型ZNFN3A1导致的表达增强(图7e泳道3)，这于HSP90A在体外增强HMTase活性的发现一致(图1c)。建立了在基因组中整合了Nkx2.8和荧光素酶基因(pGL3-Nkx2.8-wtZBE)的HEK293-Nkx2.8Luc细胞。利用表达野生型ZNFN3A1的质粒进行转染以剂量依赖方式增加荧光素酶活性，但是加入2μM格尔德霉素或与无HMTase活性的突变不增加所述活性(图7f)。总而言之，这些结果表明Nkx2.8的表达与ZNFN3A1的HSP90A依赖型HMTase活性相关。
实施例9：Nkx2.8启动子中的ChaIP-4区与ZNFN3A1的结合
我们利用大量表达ZNFN3A1的HepG2或Huh7肝癌细胞的提取物利用抗ZNFN3A1抗体进行另外的ChIP测定，其支持了内源性ZNFN3A1蛋白与ChIP-4区之间的作用(图8a)。利用抗二甲基化的H3-K4抗体进行进一步ChIP测定显示用野生型ZNFN3A1转染的HEK293细胞中二甲基化的H3-K4与ChIP-4区之间的结合(图8b)。
工业实用性
本发明显示ZNFN3A1具有甲基转移酶活性，并且抑制所述活性导致对癌细胞的细胞增殖的抑制。因此，抑制甲基转移酶活性或ZNFN3A1与其辅助因子的结合的试剂阻止其活性，可作为抗癌药剂用于治疗，具体可作为用于治疗HCC或结肠直肠癌的抗癌药剂。
已经报道ZNFN3A1的表达在HCC或结肠直肠癌中上调。因此，本发明检测ZNFN3A1的甲基转移酶活性的方法也可用于鉴定这些癌症。具体地，与正常细胞相比显示较高的甲基转移酶活性的细胞可被鉴定为癌症细胞。
此外，调节ZNFN3A1的甲基转移酶活性的调节物也可用于鉴定癌症。例如，所述调节物可用于证实受试细胞中检出的甲基转移酶活性是否源自ZNFN3A1。具体地，当甲基转移酶活性受到调节物的改变(抑制或增强)时，所述活性被判断为不是假阳性。
本文引用的所有专利，专利申请以及公开出版物都全文包含在此作为参考。此外，虽然本发明已经参考具体实施方案进行了详细描述，对于本领域技术人员而言，显而易见可进行各种改变和修饰而不偏离本发明的精神和范围。
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<220>
<223>用于ChIP测定法的人工合成的引物序列
<400>28
tcactgcctg ggctttggtc tttg 24
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于ChIP测定法的人工合成的引物序列
<400>29
gaccaaagcc caggcagtga gagtg 25
<210>30
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于ChIP测定法的人工合成的引物序列
<400>30
ctgaggaagg gctgggacaa cattc 25
<210>31
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于ChIP测定法的人工合成的引物序列
<400>31
tggctacaag cctcttctgt tttgc 25
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于ChIP测定法的人工合成的引物序列
<400>32
aggggtgggt ttattagcac ccagg 25
<210>33
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于体外结合测定法的人工合成的引物序列
<400>33
ttacgccctc ctgaaacttg tcatcctgaa tcttagaggg gccc 44
<210>34
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于体外结合测定法的人工合成的引物序列
<400>34
gggcccctct aagattcagg atgacaagtt tcaggagggc gtaa 44
<210>35
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于体外结合测定法的人工合成的引物序列
<400>35
ccctttgatc ttacc 15
<210>36
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于体外结合测定法的人工合成的引物序列
<400>36
ggtaagatca aaggg 15
<210>37
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于体外结合测定法的人工合成的引物序列
<400>37
ccctttggcc ttacc 15
<210>38
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于体外结合测定法的人工合成的引物序列
<400>38
ggtaaggcca aaggg 15
<210>39
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于构建突变型ZNFN3A1的人工合成的引物序列
<400>39
cggaattctg gcgtcgtctg cgaccgctg 29
<210>40
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于构建突变型ZNFN3A1的人工合成的引物序列
<400>40
ggggtacctt aggatgctct gatgttggcg tc 32
<210>41
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于构建突变型ZNFN3A1的人工合成的引物序列
<400>41
cggaattcag actccgttcg acttcttggc ag 32
<210>42
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于构建突变型ZNFN3A1的人工合成的引物序列
<400>42
cggaattccc ggaagcagct gagggaccag tac 33
<210>43
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于构建突变型ZNFN3A1的人工合成的引物序列
<400>43
cggaattcga tggagccgct gaaggtggaa aag 33
<210>44
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于构建突变型ZNFN3A1的人工合成的引物序列
<400>44
ggggtacctt accggcgctc ctcactggtc 30
<210>45
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于构建突变型ZNFN3A1的人工合成的引物序列
<400>45
ggggtacctt agtctggagg atatctgggt ttg 33
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于通过PCR扩增Nkx2.8启动子的片段的人工合成的引物序列
<400>46
agcgggcctg gtaccaaatt tgtg 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于通过PCR扩增Nkx2.8启动子的片段的人工合成的引物序列
<400>47
ccgggatgct agcgcattta cagc 24
<210>48
<211>55
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于表达ZNFN3A1的siRNA的质粒的人工合成的寡核苷酸序列
<400>48
caccaacatc taccagctga aggtgttcaa gagacacctt cagctggtag atgtt 55
<210>49
<211>55
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于表达ZNFN3A1的siRNA的质粒的人工合成的寡核苷酸序列
<400>49
aaaaaacatc taccagctga aggtgtctct tgaacacctt cagctggtag atgtt 55
<210>50
<211>1622
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(96)..(1382)
<400>50
gtgcgcgcag ggcgcaggcg cgcgggtccc ggcagcccgt gagacgcccg ctgctggacg 60
cgggtagccg tctgaggtgc cggagctgcg ggagg atg gag ccg ctg aag gtg 113
Met Glu Pro Leu Lys Val
1 5
gaa aag ttc gca acc gcc aac agg gga aac ggg ctg cgc gcc gtg acc 161
Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn Gly Leu Arg Ala Val Thr
10 15 20
ccg ctg cgc ccc gga gag cta ctc ttc cgc tcg gat ccc ttg gcg tac 209
Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg Ser Asp Pro Leu Ala Tyr
25 30 35
acg gtg tgc aag ggg agt cgt ggc gtc gtc tgc gac cgc tgc ctt ctc 257
Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val Cys Asp Arg Cys Leu Leu
40 45 50
ggg aag gaa aag ctg atg cga tgc tct cag tgc cgc gtc gcc aaa tac 305
Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln Cys Arg Val Ala Lys Tyr
55 60 65 70
tgt agt gct aag tgt cag aaa aaa gct tgg cca gac cac aag cgg gaa 353
Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp Pro Asp His Lys Arg Glu
75 80 85
tgc aaa tgc ctt aaa agc tgc aaa ccc aga tat cct cca gac tcc gtt 401
Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg Tyr Pro Pro Asp Ser Val
90 95 100
cga ctt ctt ggc aga gtt gtc ttc aaa ctt atg gat gga gca cct tca 449
Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu Met Asp Gly Ala Pro Ser
105 110 115
gaa tca gag aag ctt tac tca ttt tat gat ctg gag tca aat att aac 497
Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp Leu Glu Ser Asn Ile Asn
120 125 130
aaa ctg act gaa gat aag aaa gag ggc ctc agg caa ctc gta atg aca 545
Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu Arg Gln Leu Val Met Thr
135 140 145 150
ttt caa cat ttc atg aga gaa gaa ata cag gat gcc tct cag ctg cca 593
Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln Asp Ala Ser Gln Leu Pro
155 160 165
cct gcc ttt gac ctt ttt gaa gcc ttt gca aaa gtg atc tgc aac tct 641
Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala Lys Val Ile Cys Asn Ser
170 175 180
ttc acc atc tgt aat gcg gag atg cag gaa gtt ggt gtt ggc cta tat 689
Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu Val Gly Val Gly Leu Tyr
185 190 195
ccc agt atc tct ttg ctc aat cac agc tgt gac ccc aac tgt tcg att 737
Pro Ser lle Ser Leu Leu Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Cys Ser Ile
200 205 210
gtg ttc aat ggg ccc cac ctc tta ctg cga gca gtc cga gac atc gag 785
Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg Ala Val Arg Asp Ile Glu
215 220 225 230
gtg gga gag gag ctc acc atc tgc tac ctg gat atg ctg atg acc agt 833
Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu Asp Met Leu Met Thr Ser
235 240 245
gag gag cgc cgg aag cag ctg agg gac cag tac tgc ttt gaa tgt gac 881
Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln Tyr Cys Phe Glu Cys Asp
250 255 260
tgt ttc cgt tgc caa acc cag gac aag gat gct gat atg cta act ggt 929
Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp Ala Asp Met Leu Thr Gly
265 270 275
gat gag caa gta tgg aag gaa gtt caa gaa tcc ctg aaa aaa att gaa 977
Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu Ser Leu Lys Lys Ile Glu
280 285 290
gaa ctg aag gca cac tgg aag tgg gag cag gtt ctg gcc atg tgc cag 1025
Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln Val Leu Ala Met Cys Gln
295 300 305 310
gcg atc ata agc agc aat tct gaa cgg ctt ccc gat atc aac atc tac 1073
Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu Pro Asp Ile Asn Ile Tyr
315 320 325
cag ctg aag gtg ctc gac tgc gcc atg gat gcc tgc atc aac ctc ggc 1121
Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp Ala Cys Ile Asn Leu Gly
330 335 340
ctg ttg gag gaa gcc ttg ttc tat ggt act cgg acc atg gag cca tac 1169
Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr Arg Thr Met Glu Pro Tyr
345 350 355
agg att ttt ttc cca gga agc cat ccc gtc aga ggg gtt caa gtg atg 1217
Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val Arg Gly Val Gln Val Met
360 365 370
aaa gtt ggc aaa ctg cag cta cat caa ggc atg ttt ccc caa gca atg 1265
Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly Met Phe Pro Gln Ala Met
375 380 385 390
aag aat ctg aga ctg gct ttt gat att atg aga gtg aca cat ggc aga 1313
Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met Arg Val Thr His Gly Arg
395 400 405
gaa cac agc ctg att gaa gat ttg att cta ctt tta gaa gaa tgc gac 1361
Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu Leu Leu Glu Glu Cys Asp
410 415 420
gcc aac atc aga gca tcc taa gggaacgcag tcagagggaa atacggcgtg 1412
Ala Asn Ile Arg Ala Ser
425
tgtctttgtt gaatgcctta ttgaggtcac acactctatg ctttgttagc tgtgtgaacc 1472
tctcttattg gaaattctgt tccgtgtttg tgtaggtaaa taaaggcaga catggtttgc 1532
aaaccacaag aatcattagt tgtagagaag cacgattata ataaattcaa aacatttggt 1592
tgaggatgcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1622
<210>51
<211>428
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>51
Met Glu Pro Leu Lys Val Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn
1 5 10 15
Gly Leu Arg Ala Val Thr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg
20 25 30
Ser Asp Pro Leu Ala Tyr Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val
35 40 45
Cys Asp Arg Cys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln
50 55 60
Cys Arg Val Ala Lys Tyr Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp
65 70 75 80
Pro Asp His Lys Arg Glu Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg
85 90 95
Tyr Pro Pro Asp Ser Val Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu
100 105 110
Met Asp Gly Ala Pro Ser Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp
115 120 125
Leu Glu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu
130 135 140
Arg Gln Leu Val Met Thr Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu lle Gln
145 150 155 160
Asp Ala Ser Gln Leu Pro Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala
165 170 175
Lys Val Ile Cys Asn Ser Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu
180 185 190
Val Gly Val Gly Leu Tyr Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys
195 200 205
Asp Pro Asn Cys Ser Ile Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg
210 215 220
Ala Val Arg Asp Ile Glu Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu
225 230 235 240
Asp Met Leu Met Thr Ser Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln
245 250 255
Tyr Cys Phe Glu Cys Asp Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp
260 265 270
Ala Asp Met Leu Thr Gly Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu
275 280 285
Ser Leu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln
290 295 300
Val Leu Ala Met Cys Gln Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu
305 310 315 320
Pro Asp Ile Asn Ile Tyr Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp
325 330 335
Ala Cys Ile Asn Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr
340 345 350
Arg Thr Met Glu Pro Tyr Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val
355 360 365
Arg Gly Val Gln Val Met Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly
370 375 380
Met Phe Pro Gln Ala Met Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met
385 390 395 400
Arg Val Thr His Gly Arg Glu His Ser Leu lle Glu Asp Leu Ile Leu
405 410 415
Leu Leu Glu Glu Cys Asp Ala Asn Ile Arg Ala Ser
420 425
<210>52
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>52
Asn His Ser Cys Asp Pro Asn
1 5
<210>53
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>53
Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr
1 5
<210>54
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(5)..(6)
<223>“Xaa”表示任何氨基酸
<400>54
Asn His Ser Cys Xaa Xaa Asn
1 5
<210>55
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(5)..(7)
<223>“Xaa”表示任何氨基酸
<400>55
Gly Glu Glu Leu Xaa Xaa Xaa Tyr
1 5
机译： 检测甲基转移酶活性的方法和筛选甲基转移酶活性调节剂的方法
机译： 检测甲基转移酶活性的方法和筛选甲基转移酶活性调节剂的方法
机译： 检测甲基转移酶活性的方法和筛选甲基转移酶活性的调节剂的方法
