全基因组滚环扩增及其产物的固定方法

摘要

全基因组滚环扩增及其产物的固定方法实现了全基因组信息的同时获取，大大节约了模板制备时间；同时由于全基因组的信息在片段化后同时以单分子形式扩增放大，既保持了片断化后的单分子数，又提高了使用检测的灵敏度。基因组DNA经酶消化或者超声破碎成较短的片段，片段化的DNA在酶的作用下连接连接子，并连接成环，以该环分子为模板进行滚环扩增，得到滚环扩增的基因组片段化核酸序列；将稀释的滚环扩增的基因组片段化核酸序列通过化学方法固定在一块硬质材料载体表面，使得每个基因组片段化核酸序列在该载体表面占有一个独立的位置坐标而与其它序列分开固定，从而实现全基因组序列的固定，构成全基因组DNA芯片。

说明书

技术领域

本发明涉及一种全基因组扩增及其产物的固定化方法，属于生物医学中基因组检测的技术领域。

背景技术

随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。虽然导致疾病发生的因素众多，但基因突变(单核苷酸多态性、甲基化等)被广泛认为是一个重要的内在因素。在基础研究方面，基因突变位点有助于基因组的精确定位，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点：大多数复杂疾病，如癌症、糖尿病、心血管疾病、抑郁症、哮喘等，是受众多基因以及环境因子共同作用，通过对于大量某一特定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。更为重要的是，通过筛查药物敏感的基因突变位点，为今后实现个体化用药提供依据。通过发现疾病易感性的基因突变位点，可以使人们及早地预防疾病，达到避免疾病的发生的目的。因此，人类基因组草图刚刚绘制完成后，寻找人类基因组中基因突变位点立即成为人类基因组计划的主要任务之一。例如，国际上十大制药巨头公司和Wellcome Trust联合组成了SNP协作组，启动了在整个基因组范围内寻找SNP位点的计划。我国南方基因组中心和北方(华大)基因中心也开展了中华民族SNP基因位点的筛查工作。目前，绝大多数人类SNP基因多态位点(约300万个)已经完成定位和认证工作，并在网上公布。然而，确定人类基因组中的基因突变位点仅仅是人们研究和利用基因突变位点的第一步，寻找基因突变位点与人类表型，特别是与人类疾病的相关性才是人们关注和竞争的焦点。SNP基因型及其功能研究已成为后基因组计划的重要部分。

目前有许多关于突变和单核苷酸多态性检测的方法，如DNA测序、限制性酶切长度多态性、单链构象多态性、焦磷酸测序和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等。这些技术虽在某种程度上能完成对突变或核苷酸多态性的检测，但首先需要对目标片段进行扩增以提高检测的灵敏度，这样它们检测的位点相当有限，因此得到的信息是不完整的。发展简单、低廉、灵敏、可靠的分析全基因组DNA信息的方法对于从全基因水平上认识生命无疑具有重要的意义。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种全基因组滚环扩增及其产物的固定方法，该方法实现了全基因组信息的同时获取，大大节约了模板制备时间；同时由于全基因组的信息在片段化后同时以单分子形式扩增放大，既保持了片断化后的单分子数，又提高了使用检测的灵敏度。

技术方案：本发明先将全基因组以片段化，并将片段化的核酸以单分子的形式扩增放大，构成全基因组DNA芯片，使获得的全基因组信息准确、可靠。

本发明的全基因组滚环扩增及其产物的固定方法为：基因组DNA经酶消化或者超声破碎成较短的片段，片段化的DNA在酶的作用下连接连接子，并连接成环，以该环分子为模板进行滚环扩增，得到滚环扩增的基因组片段化核酸序列；将稀释的滚环扩增的基因组片段化核酸序列通过化学方法固定在一块硬质材料载体表面，使得每个基因组片段化核酸序列在该载体表面占有一个独立的位置坐标而与其它序列分开固定，从而实现全基因组序列的固定，构成全基因组DNA芯片。基因组片段化核酸序列是基因组片段化、连接、环化后，用通用引物滚环扩增环分子得到具有若干环分子重复片断的单分子滚环扩增的基因组片段化核酸序列。基因组片段化核酸序列的固定是通过载体表面的活基团与修饰基团的基因组片段化核酸序列间的化学反应，或采用修饰的基因组片段化核酸序列聚合成的凝胶方法固定。连接子是指与基因组中任何片断都不相同，也不构成与基因组中任何片断互补的一段寡核苷酸序列，片段化核酸分子的一端或者两端均可以连接连接子。稀释的滚环扩增的基因组片段化核酸序列的浓度保证没有两个核酸分子占据同一个位置坐标。硬质材料载体表面含有氨基、或生物素活性基团，而连接子的活性基团可以是醛基、或亲和素、或丙烯酰胺基团；其中，至少有一个连接子的一端带有一个活性基团，在片段化核酸序列的固定过程中，能与载体表面发生化学反应。

构建的全基因组DNA微阵列芯片可以用于荧光杂交、测序等核酸分析。该技术将基因组的全部信息分配到各个DNA片段中，并利用PCR方法将基因组所有信息实现了放大，使全基因组的分析变得简单易行。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明的最大优点是实现了全基因组信息的同时获取，大大节约了模板制备时间；同时由于全基因组的信息在片段化后同时以单分子形式扩增放大，既保持了片断化后的单分子数，又提高了使用检测的灵敏度，

2、本发明采用通用的连接子和通用的扩增引物来实现片段化核酸的连接和扩增，可以节省大量的检测成本。

3、本发明的目的是提供一种全基因组DNA微阵列，通过对全基因组DNA微阵列的分析得到个体的全基因组信息，同时可以通过多种方式(例如测序、杂交分析等)实现对信息的获取，从而为全基因组信息的高通量检测提供了极好的技术分析平台。

附图说明

图1是本发明全基因滚环扩增及其产物产物固定方法的示意图。

图2是本发明中连接连接子后的基因组片段的结构示意图。

以上的图中有：限制性酶切反应A、连接酶I的连接反应B、连接酶11的连接反应C、滚环扩增反应D；滚环产物的固定反应E

基因组DNA 1、基因组片段化核酸序列2、连接子3、环分子4、滚环扩增反应引物5、扩增核酸序列重复片6、平面表面7。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步说明。

本发明中的基因组DNA经适当的限制性内切酶消化(或者超声破碎)形成较短的片段，片段化的DNA在酶的作用下与通用的连接子连接，将这些片段化的核酸序列在连接酶的作用下连接成环，然后使用通用引物以环分子为模板进行滚环扩增，片段化的DNA以单分子的形式实现扩增放大，稀释扩增产物使每一个片段化的核酸分子占有一个独立的坐标位置。从而实现了全基因组序列以片段化形式的固定，构成全基因组DNA芯片，该芯片可用于杂交、测序等核酸分析，由于对片段化的DNA以单分子形式扩增放大，因此提高了使用检测的灵敏度。

本发明的全基因滚环扩增及其产物产物固定方法采取以下方案实现的：

先用限制性内切酶(或者超声破碎)将基因组切割成大小为50-1000碱基的片断，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个连接子与扩增反向引物序列完全互补；

用通用引物滚环扩增环分子得到具有若干环分子重复片断的单分子扩增核酸序列片；

稀释滚环扩增的单分子扩增核酸序列片并在一块硬质材料载体表面得到固定。则全基因组序列以片段化的形式分别被固定平面表面，从而构建成了全基因组DNA微阵列芯片。

图1中，置于Eppendorff管中的基因组DNA 1通过用限制性酶切A，将基因组片段化为大小50-1000碱基的基因组片段化核酸序列2，这些片段化核酸序列在连接酶I的作用下(B)与一对通用连接子进行连接3，其中的一个通用连接子与滚环扩增反应引物是完全互补(参见附图2)。连接臂连接的片段化核酸序列在连接酶的作用下C连接成环分子4，加入滚环扩增反应引物5与是完全互补的通用连接子退火后，进行滚环扩增反应D，稀释滚环扩增的单分子扩增核酸序列片6并在一块硬质材料载体表面通过化学反应得到固定。则全基因组序列以片段化的形式分别被固定平面表面7，从而构建成了全基因组DNA微阵列芯片。

图2中每个包含连接子后的基因组片段又由两部分构成：基因组片段化核酸序列2，用于与滚环扩增反应引物5是完全互补于连接子2。

实例1  酵母全基因组固定方法

参照附图1、2，在一块平整的玻璃片上用二氯二甲基硅烷将微孔板表面进行疏水处理。微孔经过水洗、干燥后用5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷丙酮修饰1小时、5％的戊二醛处理2小时后载体表面衍生出醛基活性基团。

另一方面，将酵母基因组用酶切割成大小约为500碱基的片断，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用寡核酸分子进行连接，其中的一个通用寡核酸分子与滚环扩增引物的序列完全互补。

连接臂连接的片段化核酸序列在连接酶的作用下连接成环分子，加入氨基修饰的滚环扩增反应引物进行滚环扩增反应，稀释滚环扩增的氨基修饰单分子扩增核酸序列，使每一个片段化的单核酸分子占有一个独立的坐标位置，然后使片段化的单核酸分子固定于玻片上与具有醛基活性基团的载体表面反应，则酵母全基因组序列以片段化的形式分别被固定平面表面，从而构建成了酵母全基因组DNA微阵列芯片。利用该全基因组DNA芯片可以通过多种方式(例如测序、杂交分析等)实现对酵母全基因组信息的分析。

实例2  人全基因组固定方法

参照附图1、2。

一方面，将人基因组用酶切割(或者超声破碎)成大小为50-1000碱基的片断，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用寡核酸分子与滚环扩增引物的序列完全互补。

连接臂连接的片段化核酸序列在连接酶的作用下连接成环分子，加入丙烯酰胺基团修饰的滚环扩增引物退火后，进行滚环扩增反应。

丙烯酰胺修饰滚环扩增反应物用3％的丙烯酰胺单体稀释、混合成预聚合物溶液，并均匀分布于干净的玻璃片上，使每一个片段化的单核酸分子占有一个独立的坐标位置，然后将其置于真空中，且四甲基乙二胺的汽化氛围下，以促其发生聚合反应形成凝胶，使片段化的单核酸分子固定于玻片上。从而构建成了人全基因组DNA微阵列芯片。利用该全基因组DNA芯片可以通过多种方式(例如测序、杂交分析等)实现对人全基因组信息的分析。