大白菜橙色叶球的SCAR标记及其用于辅助选择育种的应用

摘要

本发明公开了一种大白菜橙色叶球的SCAR标记及其该SCAR标记用于辅助选择育种的应用。辅助选择育种方法以彩色大白菜和普通白色大白菜及其杂交二代分离群体的基因组DNA为模板，通过RAPD分析，多次重复试验，筛选到了与彩色大白菜橙色叶球连锁的RAPD标记，并成功的转化为一个特异性SCAR标记，连锁分析发现该标记与橙色叶球的连锁距离为3.7cm，应用这个SCAR标记，可以进行大白菜橙色叶球性状的分子辅助选择育种。

说明书

                        技术领域

本发明属于农业的蔬菜品种选育与生物技术领域，涉及白菜的品种选育和分子标记辅助选择育种方法，特别是一种大白菜橙色叶球的SCAR标记及其用于辅助选择育种的应用。

                        背景技术

大白菜起源于我国，栽培面积和产量居蔬菜之首，大白菜的品质和营养与人民身体健康密切相关。随着人们生活水平的提高，对于大白菜品质的要求越来越高。目前出现的彩色大白菜，颜色好看，不仅营养价值较高，而且加工腌制不变色等优点很受欢迎。

申请人的园艺学院蔬菜科学系于1993年开始彩色大白菜育种，配制的秋大白菜一代杂种“金冠1号”和“金冠2号”彩色大白菜新品种，在2004年已经通过陕西省审定，同时受得了国内外媒体的广泛关注和大白菜生产者的青睐。由于传统的叶球颜色表型选择要在结球末期，采用田间剖球观察进行，操作起来费时费力，很大程度上延缓了育种进程。为了加快彩色大白菜的育种速度，采用现代生物技术，进行分子标记辅助育种十分迫切。

分子标记是近年来研究的热门领域，它以DNA为研究对象，具有以下优越性：(1)直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；(2)数量极多，遍及整个基因组，可检测到的基因座位几乎是无限的；(3)多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；(4)表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；(5)有许多分子标记表现为共显性(codominance)，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，因而现已形成许多分子标记系统。

PCR技术是近年来发展起来的DNA分子标记之一，与RFLP相比，RAPD标记具有以下特点：(1)RAPD的引物具有通用性，同一套引物可适用于不同生物基因组的分析。相反RFLP标记具有种族特异性，只在一定的种属范围内可相互使用；(2)RAPD技术简单成熟，可程序化作业，特别适于大批量检测；(3)由于引物的随机性，RAPD标记几乎可覆盖整个基因组；(4)RAPD标记一般表现为显性遗传，不能区分杂合型和纯合型；(5)RAPD标记一般可以同时检测多个位点，很适于快速构建遗传图谱和不同材料多态性筛选；(6)RAPD分析不使用同位素，因而比较安全，也不受特殊地区规定限制；(7)RAPD技术DNA用量少，不受植株生长条件、时期的限制。所以，RAPD分析非常适于大规模样品的植物育种、种群遗传学和生物多样性等众多研究领域。

SCAR标记，即序列特异扩增带，是基于RAPD发展起来的一类标记，在对多态性RAPD产物测序的基础上，设计一对新的引物，特异地扩增一个在遗传上定义为一个位点的DNA区段。在对多态性RAPD产物测序的基础上，设计一对新的引物，特异地扩增一个在特定位点的DNA片段，一般在原RAPD引物的3’与5’端延长14个碱基，利用两端各24个碱基的引物进行特异扩增，因此，该方法与RAPD相比具有如下优点：由于使用较长的引物和高退火温度，因此具有重复性和稳定性好，带型简单等优点，因此，SCAR标记成为分子育种、品种鉴定和种子纯度鉴定的首选标记。

总之，分子标记不受基因表达时间、显隐关系、环境因素等条件影响，利用与目标性状紧密连锁的分子标记可在生育早期阶段进行选择，减少了选择的盲目性，缩短了育种年限，从而可以大大提高育种效率，加快育种进程。

                          发明内容

本发明的目的是提供一种大白菜橙色叶球的SCAR标记及其用于辅助选择育种的用途。

本发明采用RAPD技术，寻找与橙色叶球性状紧密连锁的RAPD分子标记，并进一步转化为SCAR标记，为开展大白菜球色分子标记辅助育种奠定基础。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种大白菜橙色叶球的SCAR标记，其特征在于，该SCAR标记的特异片断S₈₂-591全长591bp，其基因序列为：

    GGCACTGAGGATTGGGTTCCTACTAGAATTTAAATAGCTTCTTTGAAGACTTTATCTAAAA

TAGATGTGAACATGACTACACAAGTCAACTAAAAACTCAACCCATCATTGACTTTTGCGTTTACC

TCCCACTATGAGAATAGACCAGTGAGTGCATATCCATCACCTATTAGGTGTCAGCCTCTATGGAG

GGGCCTTTGCTACACTCTTAACATTTGTATCCATGTTTGCATTTTATAGATGGGTCGTTAAGAGT

TTCAAACAGCACTAACTTTACCAAACATATCATTTTAAAACATAACAAGTCAAACAAAACAACTG

ATTCTAGAGAGAAATTAAATGGAAAAACAACATAATCATCATGACTGAATCTTGGACATTTTAGT

AAGAACGGAAGAAGCTCTGGTTACAAAAGGATCTTAAGCCTTCTCTTCTTCATCTTCTTCAATCT

TAGGAGCCAAGTAGTAACGAATGTAACCCATCTCAGCCACCTTATACTCCACCACAACTGGCAGC

TCAGACGATAAGCTGATCGTCACTGTGTCCGACAAAGGAGTTGCCTTTGTGAAGGAGTTCATGTA

CCTCAGTGCC。

上述特异片断S₈₂-591两端为S₈₂引物序列为5’GGCA CTGA GG3’，根据S₈₂-591的测序结果设计的SCAR引物如下：

fS82-600：5’GGCACTGAGGATTGGGTTC 3’

rS82-600：5’GGCACTGAGGTACATGAAC3’。

上述大白菜橙色叶球的SCAR标记，经申请人的实验证明，能够用于辅助选择育种的应用。

将该SCAR引物进行大白菜橙色叶球性状的辅助选择育种的方法是，首先进行彩色大白菜自交系和受体普通大白菜基因重组群体材料的准备，接着进行DNA提取，SCAR引物的设计，SCAR引物扩增，SCAR标记在分离群体中分离规律分析，阳性SCAR标记单株的选择，具体包括下列步骤：

1)基因重组群体材料的准备：

以供体彩色大白菜自交系和受体普通大白菜杂交，单株自交，随机选取50-100株F2单株和亲本种子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期给F2单株编号，于苗期取幼苗嫩叶片提取DNA备用，成株期根据品种特性鉴定生物学性状；

2)DNA提取

A.在1.5ml的离心管中加入750μL1×CTAB提取液，其中，CTAB 2％，Tris-HCI100mmol/L，EDTA 20mmol/L，NaCl 1.4mol/L，并加入8μL β-巯基乙醇摇匀；

B.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，加入液氮研磨至粉末，然后将1.5ml离心管中提取液加入到研钵中，混匀后转入到离心管中，并不断地摇动离心管；

C.随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔几分钟摇一次，水浴30min；

D.取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇的混合物，其中，酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，摇匀10min后，常温下12000r/min离心10min；

E.将上层液相转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇，其比例为24∶1，摇匀10min，常温下12000r/min离心10min；

F.取上清加入2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后，使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下12000r/min离心10min；

G.弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀2～3次，沉淀物室温晾干；

H.加入400～500μL TE缓冲液溶解DNA，加入1.5μL RNaseA(10μg/μL)，使终浓度达10μg/mL，混匀后37℃保温30min；

I.待DNA完全溶解后，加入3mol/L NaAC溶液40μL～50μL和等体积的异丙醇，摇匀使DNA充分沉淀，冰浴15min；

J.在4℃，12000r/m条件下离心10min，弃上清，加入75％的乙醇清洗沉淀1～2次，后加入1200μL DNA贮存液，DNA贮存液由75％乙醇，0.3mol/LNaAC溶液构成；

提取的DNA，经纯度检测，证实纯化较好，一般用灭菌的400～500μLddH₂O稀释，存于4℃中备用；

3)SCAR引物设计：

特异标记SC₈₂-591的SCAR引物如下：

fS82-600：5’GGCACTGAGGATTGGGTTC 3’

rS82-600：5’GGCACTGAGGTACATGAAC 3’

4)SCAR-PCR扩增：

SCAR-PCR扩增在25μL PCR反应体系中进行，反应体系中有10×PCR缓冲液2.5μL，Taq DNA聚合酶1Unit，MgCl₂浓度为2.5mmol/L，上、下游特异性引物浓度分别为0.3μmol/L，4种dNTP浓度各为0.2mmol/L，模板DNA 30～50ng；

PCR反应程序为：预变性94℃/4min、94℃/60s、60℃/60s、72℃/90s，30个循环后，72℃延伸10min；

电泳：取10μL扩增产物与2μL的6×Loading buffer混匀，点入含0.5μg/ml EB的1.5％琼脂糖凝胶中，在120V下电泳1h，经EB染色后在凝胶成像议中观察照相，以DL2000marker为标准分子量；

5)SCAR标记与橙色叶球性状的连锁关系

针对目标基因的重组群体，统计纯合型白色叶球的单株、纯合型橙色叶球的单株和杂和型白色单株中SCAR标记的数量，根据Mapmaker Ver.3.0计算遗传距离为3.7cM，表明S₈₂-591与橙色基因紧密连锁，其理论选择效率为96.3％；

6)SCAR标记的特征及其选择策略

SCAR引物在橙色池单株中扩增出一条特异标记SC₈₂-591；白色池中的单株中没有扩增产物，没有特异条带SC82-591，因此对于重组分离群体，只要后代单株中检测存在特异条带SC82-591，就一定携带橙色叶球基因，而无需等到结球时期选择，即有SCAR标记的单株就携带有橙色叶球基因，该单株被选留，通过SCAR标记间接选择橙色叶球性状，能够起到早期、快速、准确选择分子育种。

本发明对196个F₂群体单株DNA用SCAR引物进行PCR扩增表明，在45个纯合型白色叶球的单株中有42株未扩增到特异条带SC₈₂-591，3株扩增出此带；39个纯合型橙色叶球的单株中，37株扩增出此条带，而2株没有扩增出此条带，112个杂和型白色单株中，有2株没有扩增出此条带，这一扩增结果与RAPD标记的在F₂代中的分离结果相吻合；根据Mapmaker Ver.3.0计算遗传距离其为3.7cM，表明S₈₂-591与橙色基因紧密连锁，其理论选择效率为96.3％。。

                           附图说明

图1是CTAB法提取的大白菜基因组DNA检测图；

图2是几个引物在优化后的RAPD体系下的扩增结果图；

图3-1引物S₈₂对两基因池的F₂单株DNA扩增结果图，其中M：DL2000DNA marker；1～10：橙色池中单株；11～20：白色池中各单株；

图3-2引物S₈₂对F₂橙色单株和白色单株DNA扩增结果图，其中，M：DL2000 DNA marker；21～31：橙色单株；32～40：白色单株；

图3-3引物S₈₂对F₂橙色单株和白色单株DNA扩增结果图，其中，M：DL2000DNA marker；41～50：橙色单株；51～62：白色单株；

图4是引物SC₈₂-591对混合池单株的扩增结果图，其中，M：DL2000DNAmarker；1：橙色池的RAPD扩增；2：白色池的RAPD扩增；3～11：白色池中各单株的SCAR扩增；12～18：橙色池中各单株的SCAR扩增；

图5是SC₈₂-591标记在F₂橙色单株中的扩增结果图；

以下结合附图和发明人给出的利用大白菜橙色叶球的SCAR标记进行分子辅助选择育种方法对本发明作进一步的详细说明。

                         具体实施方式

本发明以彩色大白菜自交系和普通大白菜自交系配制了4套F₁、F₂、BC1材料为研究材料，分别如下：

(1)母本：早皇白-4，父本：S941-6，回交亲本：S941-6；

(2)母本：S941-1，父本01S160-1，回交亲本：S941-6；

(3)母本：S941-7，父本77M-5，回交亲本：S941-6；

(4)母本：S941-2，父本01Sb5-1，回交亲本：S941-6；

研究利用RAPD技术筛选与橙色叶球相关的特异性引物，进一步对特异片段克隆测序，转化为SCAR标记，通过F2代分离表现，计算连锁距离，将SCAR标记应用于分子育种。

首先进行PCR反应体系优化，接着进行特异性引物筛选，特异性条带的克隆测序，SCAR引物的设计，SCAR引物的验证与分离群体分离规律分析。

具体如下：

1.大白菜橙色叶球遗传规律

在4套材料中，F₁群体全部表现为白色叶球。由表2可以看出，4套材料中，F₂代群体中橙色叶球单株与白色叶球单株的比例约为1∶3，回交后代群体中橙色叶球单株与白色叶球单株的比例约为1∶1。从田间实验性状统计结果充分说明橙色性状为隐性单基因控制的独立遗传，符合孟德尔遗传规律。

            表1  大白菜F₂，BC₁的叶球颜色表现型和比例

  组合  世代  表型株数  总株数  理论比率  X²  P  橙色叶球  白色叶球  O∶W  1  F₂  77  237  314  3∶1  0.038  ＞0.9＞0.05  BC₁  64  78  142  1∶1  1.38  ＞0.3＞0.05  2  F₂  29  107  136  3∶1  0.98  ＞0.3＞0.05  BC₁  66  53  119  1∶1  1.42  ＞0.3＞0.05  3  F₂  64  144  208  3∶1  3.69  ＞0.1＞0.05  BC₁  102  86  198  1∶1  1.36  ＞0.3＞0.05  4  F₂  48  175  223  3∶1  1.11  ＞0.3＞0.05  BC₁  65  83  148  1∶1  2.18  ＞0.2＞0.05

χ²＝∑[(O-E)²/E]自由度＝2-1   χ_0.05²＝3.84

2.小量法DNA提取

A.在1.5ml的离心管中加入750μL1×CTAB(CTAB 2％，Tris-HCI(pH8.0)100mmol/L，EDTA 20mmol/L，NaCl 1.4mol/L，)提取液，并加入8μL β-巯基乙醇摇匀。

B.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，加入液氮研磨至粉末，然后将1.5ml离心管中提取液加入到研钵中，混匀后转入到离心管中，并不断地摇动离心管。

C.随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔几分钟摇一次，水浴30min。

D.取出离心管，加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合物，其中，酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，摇匀10min后，常温下12000r/min离心10min。

E.将上层液相转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)后，摇匀10min，常温下12000r/min离心10min。

F.取上清加入2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后，使DNA抱团，-20℃沉淀30min，4℃下12000r/min离心10min。

G.弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀2～3次，沉淀室温晾干。

H.加入400～500μL TE缓冲液溶解DNA，加入1.5μL RNaseA(10μg/μL)，使终浓度达10μg/mL，混匀后37℃保温30min(期间轻弹管壁，充分溶解DNA)。

I.待完全溶解后，加入3m0l/L NaAC溶液40~50μL(终浓度达到0.3mol/L)预冷的等体积的异丙醇，摇匀使DNA充分沉淀，冰浴15min。

J.在4℃，12000r/m下离心10min，然后弃上清，加入75％的乙醇清洗沉淀1～2次，后加入1200μLDNA贮存液(75％乙醇，0.3mol/L NaAC溶液)。

提取的DNA，经纯度检测，证实纯化较好，一般用灭菌的400～500μLddH₂O稀释，存于4℃中备用。

3.优化的RAPD体系

将提取的大白菜基因组DNA稀释后，取8μLDNA样品与1.6μL6×Loading buffer混匀后，经含0.5μg/ml EB的0.8％琼脂糖凝胶中电泳，检测DNA质量。由附图1可见，采用改进的CTAB法提取的DNA片段电泳条带清晰、无污染、无明显降解发生，能保证基因组所携带信息量的完整性。表明该方法提取的DNA纯度较高，可满足后续实验需要。由附图2可见，以提取的基因组DNA为模板，采用优化之后的RAPD体系进行分析，扩增条带清晰、无脱尾现象、且条带较多、重复性较好，可满足RAPD分析需要。

4.多态性RAPD引物的筛选

用400个随机引物，分别对橙色池和白色池进行RAPD扩增，结果80％的随机引物均能扩增出清晰DNA条带。

在橙色叶球池和白色叶球池间表现出多态性的引物有330个，占所用引物数量的82.5％。在橙色叶球池中有特征性条带的引物有13条，在白色池中扩增出特征性条带的引物有6条。其中引物S₈₂经多次重复扩增，在两池间表现稳定、一致的差异，引物S₈₂共扩出8条带，除一条带在两池间表现出多态性外，其余条带在两混和池间无多态性，引物S₈₂在橙色池扩增出一特异条带S₈₂-591，而白色池缺失这条带。

5.S₈₂-591片断在F₂群体中的分离情况

用特异性引物S₈₂对F₂代群体的各单株进行扩增，对标记进一步检测。构建橙色池的10个单株全部扩增到S₈₂-591条带(附图3)，构建白色池的单株中有9株没有扩增到此条带，有1株扩增到此带，说明此单株可能是发生了交换。在整个196个F₂群体中，在39株橙色叶球单株中，有2株未扩到此条带；在45株基因纯合型白色叶球单株中有3株扩到了此条带，而42株未扩到此条带；在112株基因杂合型白色叶球单株中有110株扩到了此条带，有2株没有扩增出此条带，RAPD鉴定结果与田间球色记载完全相符。7个不符单株的出现，可能是由于在自交过程中发生了基因重组，重组位点正好位于标记和橙色叶球基因之间使得标记位点与目的基因重组到不同配子中，导致了上述7个单株的RAPD标记与田间株型表现不符。根据扩增结果和植株的表现型应用Mapmaker Ver.3.0计算遗传距离为3.7cM(centimorgan)，表明S₈₂-591与橙色基因紧密连锁。

                  表1  S82-591标记与橙色基因的遗传连锁分析

  球色  株数  有S₈₂-591标记  无S₈₂-591标记  重组率  遗传距离(cM)  纯合型橙色  纯合型白色  杂合型白色  39  45  112  37  3  110  2  42  2  3.57  3.7

6.特异片断的测序及SCAR引物设计

测序结果表明：特异片断S₈₂-591全长591bp，如下：

GGCACTGAGGATTGGGTTCCTACTAGAATTTAAATAGCTTCTTTGAAGA

CTTTATCTAAAATAGATGTGAACATGACTACACAAGTCAACTAAAAACT

CAACCCATCATTGACTTTTGCGTTTACCTCCCACTATGAGAATAGACCA

GTGAGTGCATATCCATCACCTATTAGGTGTCAGCCTCTATGGAGGGGCC

TTTGCTACACTCTTAACATTTGTATCCATGTTTGCATTTTATAGATGGGT

CGTTAAGAGTTTCAAACAGCACTAACTTTACCAAACATATCATTTTAAA

ACATAACAAGTCAAACAAAACAACTGATTCTAGAGAGAAATTAAATGG

AAAAACAACATAATCATCATGACTGAATCTTGGACATTTTAGTAAGAAC

GGAAGAAGCTCTGGTTACAAAAGGATCTTAAGCCTTCTCTTCTTCATC

TTCTTCAATCTTAGGAGCCAAGTAGTAACGAATGTAACCCATCTCAGCC

ACCTTATACTCCACCACAACTGGCAGCTCAGACGATAAGCTGATCGTC

ACTGTGTCCGACAAAGGAGTTGCCTTTGTGAAGGAGTTCATGTACCTC

AGTGCC

两端为S₈₂引物序列(5’GGCA CTGA GG3’)，根据S₈₂-591的测序结果设计的SCAR引物：

fS82-600：5’GGCACTGAGGATTGGGTTC 3’

rS82-600：5’GGCACTGAGGTACATGAAC 3’

7.SCAR引物在F₂群体中的扩增结果

利用SCAR引物，在F₂群体中进行PCR扩增。在附图4中，1、2泳道为用引物S₈₂对橙色池和白色池进行RAPD扩增结果，从图中可以看出，SCAR引物扩增出一条与S₈₂-591等长的片断，命名为SC₈₂-591。白色池中的9个单株未扩出特异条带SC82-591，而橙色池中的这7个单株均扩出特异条带SC₈₂-591。对196个F₂群体单株DNA用SCAR引物进行PCR扩增(附图5，部分图片)，在45个纯合型白色叶球的单株中有42株未扩增到特异条带SC₈₂-591，3株扩增出此带；39个纯合型橙色叶球的单株中，37株扩增出此条带，而2株没有扩增出此条带，112个杂和型白色单株中，有2株没有扩增出此条带，这一扩增结果与RAPD标记的在F₂代中的分离结果相吻合。

     SC₈₂-591特异片断核酸序列及SCAR引物序列

特异片断S₈₂-591全长591bp，如下：

GGCACTGAGGATTGGGTTCCTACTAGAATTTAAATAGCTTCTTTGAAGA

CTTTATCTAAAATAGATGTGAACATGACTACACAAGTCAACTAAAAACT

CAACCCATCATTGACTTTTGCGTTTACCTCCCACTATGAGAATAGACCA

GTGAGTGCATATCCATCACCTATTAGGTGTCAGCCTCTATGGAGGGGCC

TTTGCTACACTCTTAACATTTGTATCCATGTTTGCATTTTATAGATGGGT

CGTTAAGAGTTTCAAACAGCACTAACTTTACCAAACATATCATTTTAAA

ACATAACAAGTCAAACAAAACAACTGATTCTAGAGAGAAATTAAATGG

AAAAACAACATAATCATCATGACTGAATCTTGGACATTTTAGTAAGAAC

GGAAGAAGCTCTGGTTACAAAAGGATCTTAAGCCTTCTCTTCTTCATC

TTCTTCAATCTTAGGAGCCAAGTAGTAACGAATGTAACCCATCTCAGCC

ACCTTATACTCCACCACAACTGGCAGCTCAGACGATAAGCTGATCGTC

ACTGTGTCCGACAAAGGAGTTGCCTTTGTGAAGGAGTTCATGTACCTC

AGTGCC

两端为S₈₂引物序列(5’GGCA CTGA GG3’)，根据S₈₂-591的测序结果设计的SCAR引物：

fS82-600：5’GGCACTGAGGATTGGGTTC 3’

rS82-600：5’GGCACTGAGGTACATGAAC 3’