前列腺癌细胞特异性启动子及其应用

摘要

本发明公开了一种前列腺癌细胞特异性启动子及其应用。该启动子，是3端序列为如SEQ ID NO：9或10或11或12所示的核苷酸序列，由595－1544个核苷酸组成的DNA片段。本发明的启动子，在前列腺癌细胞中具有组织特异性和高效转录活性。实验表明，本发明的启动子的转录活性和前列腺组织特异性显著优于目前常用的前列腺组织特异性启动子。

说明书

技术领域

本发明涉及一种前列腺癌细胞特异性启动子及其应用。

背景技术

前列腺癌是西方国家男性常见的恶性肿瘤，死亡率高居男性肿瘤第二位(LandisSH，Murray T，Bolden S，Wingo PA.Cancer statistics 1999.CA Cancer J Clin1999，49：8-31)。每年大约有40,000美国男性死于前列腺癌(Haiyen E.Zhau，Chang-Ling Li，Leland W.K.Chung.Establishment of human prostate cancinomaskeletal metastasis Models.Cancer Supplement 2000，8：2995-3001)。随着我国人口结构逐步老龄化，前列腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。因此，寻求最佳诊断治疗措施仍然是目前亟待解决的问题。

前列腺是一种男性雄激素依赖器官，前列腺器官的发育和前列腺癌的发生发展均与雄激素信号途径有关。受雄激素刺激和前列腺组织特异性表达的基因和其调控元件对治疗前列腺癌具有重要意义，如启动子的调控作用对于转基因靶向特异性组织表达和建立基因治疗载体十分重要。

目前，国外已经发现了一些的前列腺组织特异性启动子，其中比较理想的是大鼠的前列腺相关的Probasin(PB)启动子、人PSA启动子和PSP94启动子等。这些启动子元件具有重要的前列腺癌基础研究和临床应用潜力。例如在转基因动物模型建立方面，短的PB启动子(-426/+28，mPB)携带的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)或荧光素酶报告基因(Luc)均能在前列腺癌细胞(PC-3、DU-145、LNCaP)中不同程度地表达，能诱导转基因CAT的前列腺靶向性表达。Gingrich等1996年建立了该启动子驱动的SV40大T和小T(SV40Large-T/small-T)抗原表达的转基因小鼠腺癌模型(TRAMP)，其中Large-T/small-T在所有的前列腺背侧腺中均有高水平的表达，进一步确认了该启动子的前列腺靶向性特征(Gingrich JR，Barrios RJ，Morton RA，et al.Metastat ic prostate cancer in a transgenic mouse.Cancer Research，1996，56：4096-4102)。Kasper等，1998年利用长的PB(12kb)启动子LPB构建了LPB驱动SV40大T抗原表达的LADY转基因模型，转基因SV40大T抗原在所有的前列腺叶均有高水平的表达，如：背腺、腹腺、侧腺和前叶腺或附睾中(Kasper S，Sheppard PC，Yan Y，et al.Development，progression，and androgen-dependenceof prostate tumors in probasin-large T ant igen transgenic mice：Amodel forprostate cancer.Lab Invest，1998，78：i-xv)。另外，Zhang等2000年在内源PB启动子前加两个ARR构建了杂合启动子ARR2PB，该启动子如同LPB启动子能驱动转基因在小鼠前列腺特异性高表达(Zhang ZF，Thomas TZ，Kasper S，et al.Asmall composite probasin promoter confers high levels of prostate-specificgene expression through regulation by androgens and glucocorticoid in vitroand in vivo.Endocrinology，2000，141：4698-4710)。PB类型的启动子驱动的许多转基因模型为前列腺肿瘤发生发展中基因变化的分子机制的研究提供了诸多便利。但是，目前仍需构建更高活性的启动子以带来更好的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种前列腺癌细胞特异性启动子及其应用。

本发明提供的前列腺癌细胞特异性启动子，是3′端序列为如SEQ ID NO：9(序列表中序列1的自5′端第507-1101位核苷酸的序列)或SEQ ID NO：10(序列表中序列5的自5′端第933-1515位核苷酸的序列)或SEQ ID NO：11(序列表中序列6的自5′端第933-1527位核苷酸的序列)或SEQ ID NO：12(序列表中序列7的自5′端第933-1527位核苷酸的序列)所示的核苷酸序列，由595-1544个核苷酸组成的DNA片段。

所述启动子，其核苷酸序列可为如下1)或2)所述的序列：

1)选自序列表中序列1的自3′端的595-1101bp的核苷酸序列；

2)与1)所述的核苷酸序列在高严谨条件下能够杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

所述启动子，其核苷酸序列可为如下所述的序列之一：

1)序列表中序列1的自5′端第507-1101位核苷酸的序列；

2)序列表中序列1的自5′端第369-1101位核苷酸的序列；

3)序列表中序列1的自5′端第252-1101位核苷酸的序列；

4)序列表中序列1的自5′端第125-1101位核苷酸的序列；

5)序列表中序列1。

序列表中序列1具有1206个脱氧核苷酸，自序列1的5′端第48-63位核苷酸、自序列1的5′端第103-119位核苷酸、自序列1的5′端第1003-1012位核苷酸、自序列1的5′端第1017-1026位核苷酸分别为4个雌激素受体反应元件序列；自序列1的5′端第650-661位核苷酸为一个抑制子元件(Repressor元件)DNA序列。

所述启动子的5′端还可以连接有如序列表中序列8所示的增强子序列，即ARE元件，以增强启动子对雄激素敏感性。

所述启动子，其含有的顺时元件可以缺失、或替换为其他增强启动子活性的元件，其核苷酸序列可为下述的核苷酸序列之一：

1)序列表中序列2；

2)序列表中序列3；

3)序列表中序列4；

4)序列表中序列5；

5)序列表中序列6；

6)序列表中序列7。

含有上述启动子的表达盒、重组表达载体、工程菌和转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明的启动子，在前列腺癌细胞中具有组织特异性和高效转录活性。实验表明，本发明的启动子的转录活性和前列腺组织特异性显著优于目前常用的前列腺组织特异性启动子，如SV40、PSA启动子。本发明的启动子在构建转基因动物模型和建立基因治疗载体治疗前列腺癌中具有很好的应用价值。

附图说明

图1为mPC-1启动子在前列腺癌细胞中的转录活性检测结果

图2为mPC-1启动子在前列腺癌细胞中转录活性强度分析结果

图3为mPC-1启动子的不同细胞系中的转录特异性检测结果

图4为启动子mPC-19-ERE-1、mPC-19-ERE-2、mPC-22-ERE、mPC-23-ER的结构示意图

图5为启动子mPC-ARE-1.1、mPC-14-ERE、mPC-0.45、mPC-0.6、mPC-0.7、mPC-0.8、mPC-0.998在前列腺癌细胞中的转录活性检测结果

图6为启动子mPC-19-ERE-1、mPC-19-ERE-2、mPC-22-ERE、mPC-23-ER在前列腺癌细胞中的转录活性检测结果

图7为启动子mPC-1、mPC-ARE-1.1和mPC-14-ERE对雄激素的敏感性分析结果

图8为启动子mPC-1、mPC-ARE-1.1和mPC-14-ERE的细胞特异性分析结果

图9为启动子mPC-1、mPC-23-ERE的细胞特异性分析结果

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、mPC-1启动子的获得及其转录特性检测

1、mPC-1启动子的获得

小鼠mPC-1基因是发明人发现的与人前列腺癌相关基因hPC-1/PrlZ具有高度同源性的新基因。小鼠多种组织表达谱分析表明，mPC-1具有较好的前列腺组织特异性，基因表达受雄激素刺激后上调(Liang RX，Zhou JG，Huang CF.et al，Cloning andCharacterization of a Novel Gene：Mouse mPC-1.Progress in Biochemistry andBiophysics，2004，31(9)：841-846)。该基因的表达调控元件可能在建立前列腺组织特异性转基因动物模型以及建立基因治疗载体中有重要应用潜力。

以小鼠肾组织的DNA为模板，以PF：5′-CGGGGTACCCTCAGGTTTCTGAGTAATGTGATTATGGC-3′(KpnI)和PR：5′-ACGCGTCGACGCTAGCTGAAGGCAGCGAGCAAGGCGAGC-3′(Sal I)为引物，进行PCR扩增反应；PCR的反应体系为50μl，其中，小鼠肾脏DNA模板4μl，10×Super Taq 5μl，dNTP4μl，PF 4μl，PR 4μl，Super Taq 0.5μl，水补足至50μl；PCR的反应程序为先94℃ 5min，再94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min共30cycles，最后72℃ 7min。PCR扩增出mPC-1基因翻译起始位点ATG上游1.12kb(1101bp的启动子序列加上酶切位点及保护碱基是1120bp)的DNA片段，通过测序表明，该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，即mPC-1启动子序列。将该片段用限制性内切酶KpnI和Sal I酶切后，定向克隆到质粒pGL3-Basic荧光素酶(Luc)报告基因上游位置，即插入到含有荧光素酶报告基因但不含启动子的质粒pGL3-Basic(购自Promega公司)的KpnI和Xho I酶切位点之间，将得到的重组质粒转化大肠杆菌菌株DH5α得到含有该重组质粒的大肠杆菌，然后进行菌落PCR和质粒双酶切鉴定阳性克隆，将经鉴定表明含有mPC-1启动子序列的pGL3-Basic重组载体命名为pm1.1-Luc。

通过AliBaba2.1预测程序对mPC-1启动子序列进行预测分析，结果表明mPC-1启动子中包含有一些顺式作用元件，如4个雌激素受体反应元件(ERE)，分别命名为ERE-1(自序列1的5′端第48-63位核苷酸)、ERE-2(自序列1的5′端第103-119位核苷酸)、ERE-3(自序列1的5′端第1003-1012位核苷酸)、ERE-4(自序列1的5′端第1017-1026位核苷酸)；一个抑制子(Repressor元件)DNA序列(自序列1的5′端第650-661位核苷酸)。

2、mPC-1启动子的转录活性分析

将人前列腺癌细胞LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、PC-3和DU-145(人前列腺癌细胞株LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、PC-3、DU145均购自优莱科(UroCor)公司(OklahomaCity))分别接种于装有含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，(胎牛血清FBS购自Hyclone公司，RPMI 1640购自Gibico公司)的24孔板中，待细胞生长至铺满80％的密度备用。

将pm1.1-Luc或pGL3-Basic分别与pRL-TK(购自Promega公司)(内标对照，Renilla荧光素酶载体)按照摩尔数比为10∶1的比例混合后，再与脂质体Lipfectamin 2000试剂(购自Invitrogen公司)混合(按照脂质体Lipfectamin 2000说明书进行)，然后分别转染上述培养好的人前列腺癌细胞LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、PC-3和DU-145，48h后收集细胞，进行荧光素酶的活性检测。

活性检测用Promega公司的双荧光素酶报道基因检测试剂盒(Dual Luciferase-3′Reporter Assay System，Cat.#E1910)检测，按照试剂盒说明书所述方法进行，双荧光素酶的检测具体方法为：每孔细胞用1ml的PBS先后洗三次后，用500μl的稀释为1×细胞裂解液(5×Passive Lysis Buffer，来自上述双荧光素酶报道基因检测试剂盒，组分为25mM双甘氨肽pH 7.8，15mM MgSO4，4mM EGTA，1mMdithiothreitol，1％Triton X-100，15％glycerol)裂解15min后转移到1.5ml的离心管中，振荡1min，然后离心3min。取20μl的上清和100μl的Firefly荧光素酶检测底物(Luciferase Assay Substrate试剂盒提供，购自Promega公司，组分为25mM双甘氨肽pH 7.8，15mM MgSO₁，4mM EGTA，2mM ATG，0.2mM荧光素，2mM dithiothreitol)混合后，用荧光光度计测定Firefly荧光素的发光值，加入100μl的反应终止液，测定作为内标的Renilla荧光素的发光值，两者的比值(Firefly荧光素的发光值/Renilla荧光素的发光值)即为荧光素酶的相对活性RLA(RelativeLuciferase Activity)。

上述实验进行两到三次重复，RLA表示为平均值±标准差。平均值之间的显著性差异分析采用t检验法(P＜0.05)。结果如图1所示，结果表明mPC-1启动子在前列腺癌细胞LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、PC-3和DU-145中的相对启动子活性，分别比阴性对照pGL3-basic高787、151、506、1008、13和13倍；表明，mPC-1启动子在前列腺癌细胞中呈现显著的启动子活性。

3、mPC-1启动子在前列腺癌细胞中转录活性强度分析

pGL3-Control(Promega公司)为一个用SV40启动子控制荧光素酶报道基因转录的阳性对照载体，SV40是一个目前已被商业化、广泛应用并具有组成型转录活性的强启动子。

p61-PSA(即pPSA-61-LUC，该载体结构及其构建方法如Kitty B.J.M.Cleutjens等1997年文献所述(Cleutjens KBJM，van der Korput HAGM，van EekelenCCEM，van Rooij HCJ，Faber PW，Trapman J.An androgen response element ina far upstream enhancer region is essential for high，androgen-regulatedactivity of the prostate-specific antigen promoter.1997 Mol Endocrinol11：148-161)，具体构建方法为：PCR扩增PSA基因启动子的(约-6kb/+12)片段，其中，所用的引物为5′-CCCAAGCTTCTAGTTTTCTTTTCC-3′和5′-CCCAAGCTTGGGGCTGGGGAGCCTCC-3′，模板为前列腺癌细胞LNCaP的基因组DNA。将扩增得到的5761bp的片段，用HindIII酶切后，插入到载体pGL3-Basic的多克隆位点的HindIII酶切位点，得到的质粒经测序验证，测序验证含有上述扩增得到的PSA基因启动子的(约-6kb/+12)片段的pGL3-Basic重组载体即为p61-PSA。p61-PSA中含有的6k启动子区为一个用约6kb长的PSA启动子控制荧光素酶报道基因转录的，具有较强的启动子活性和前列腺组织特异性阳性对照，目前被广泛应用于建立前列腺癌转基因动物模型和建立基因治疗载体。

将人前列腺癌细胞LNCaP、C4-2、C4-2B(人前列腺癌细胞株LNCaP、C4-2、C4-2B均购自优莱科(UroCor)公司(Oklahoma City))分别接种于24孔板中，待细胞生长至铺满80％的密度备用。

将pm1.1-Luc、pGL3-Basic、pGL3-Control或p61-PSA分别与pCMV-gal(购自Promega公司)按照摩尔数比为10∶1的比例混合后，再与脂质体Lipfectamin 2000试剂(购自Invitrogen公司)混合，然后分别转染上述培养好的人前列腺癌细胞LNCaP、C4-2和C4-2B，48h后收集细胞，进行荧光素酶的活性检测。

活性检测用Promega公司的单荧光素酶报道基因检测试剂盒检测，单荧光素酶的检测通常用β-半乳糖苷酶(β-gal)作为内标。按Promega公司提供的单荧光素酶的检测试剂盒说明进行，具体方法为：将上述转染48h后的细胞，弃去培养基，再用PBS洗细胞1次，加入160μl稀释的1×裂解缓冲液(Luciferase Assay Systemwith Reporter Lysis Buffer Cat.#，E4030试剂盒中的5×Reporter Lysis Buffer，购自Promega公司)，放在水平摇床上摇动15min，用细胞刮子刮下细胞，放入1.5ml离心管中，旋涡振动5min，离心(12000r/min，10min，4℃)，取上清液用荧光光度计(TD-20/20Luminometer)，测定荧光素发光值，即为荧光素酶活性。用ONPG测定β-半乳糖苷酶活性。取上述上清液10μl加入到450μl含有β-巯基乙醇(2.7ml/L)的Z缓冲液(60mM Na₂HPO₁，45mM Na₂HPO₁，5mM KCl，1mM MgSO₁，pH7.0)中，加入100μl0.4％的ONPG溶液(4g ONPG溶于1ml的Z缓冲液，pH7.0)，37℃保温，直到出现浅黄色为止，加入250μl 1mol/L Na₂CO₃终止反应，在420nm波长下测定样品吸光值，即为β-半乳糖苷酶活性。然后计算两者的比值(荧光素酶活性/β-半乳糖苷酶活性)即为荧光素酶的相对活性RLA。RLA的数值为3次重复实验结果的平均值±标准差。

荧光素酶报告基因分析比较结果如图2所示，结果表明，在前列腺癌细胞中，mPC-1启动子上述3种细胞中的活性比SV40启动子高出分别30、36和4倍，比PSA启动子分别高出20、6和5倍，比阴性对照pGL3-basic高出分别1000、400和400倍。结果表明mPC-1启动子在前列腺癌细胞中具有很高的转录活性。

4、mPC-1启动子的前列腺癌细胞特异性分析中

分别将人前列腺癌细胞LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、PC-3、DU-145、黑色素瘤B16、非洲绿猴肾COS7、人乳腺癌MCF-7、小鼠成纤维NIH3T3、肺巨细胞癌PLA-801、人宫颈癌Hela、人肝癌HepG2、人乳腺导管癌MDA-MB-435S、人乳腺癌MDA-MB-231细胞(黑色素瘤B16、非洲绿猴肾COS7、人乳腺癌MCF-7、小鼠成纤维NIH3T3、肺巨细胞癌PLA-801、人宫颈癌Hela、人肝癌HepG2、人乳腺导管癌MDA-MB-435S、人乳腺癌MDA-MB-231细胞均购自中科院上海细胞所)按照步骤2所述培养细胞的方法进行培养。

将pm1.1-Luc或pGL3-Basic分别与pRL-TK(内标对照，Renilla荧光素酶载体)按照摩尔数比为10∶1的比例混合后，按照步骤2所述的方法转染上述培养好的细胞，并通过步骤2所述的方法检测荧光素酶的相对活性RLA，对pm1.1-Luc在不同细胞系中的转录活性进行分析。

结果如图3所示，结果表明，pm1.1-Luc在代表AR阳性前列腺癌细胞系如LNCaP、C4和C4-2中呈现高RLA，在黑色素瘤B16、非洲绿猴肾COS7和人乳腺癌MCF-7中有一定水平RLA，在其他非前列腺癌细胞系例如：小鼠成纤维NIH3T3、肺巨细胞癌PLA-801、宫颈癌Hela、人肝癌HepG2、乳腺癌MDA-MB-435、MDA-MB-231中基本无活性，而对照pGL3-Basic在15种不同的细胞系中均基本无荧光素酶表达活性。这一结果表明mPC-1启动子具有明显的前列腺癌细胞特异性功能特征。

实施例2、启动子mPC-ARE-1.1、mPC-14-ERE、mPC-19-ERE-1、mPC-19-ERE-2、mPC-22-ERE、mPC-23-ERE、mPC-0.6、mPC-0.7、mPC-0.8、mPC-0.998的获得及它们的转录活性和转录特异性检测

为进一步增强mPC-1的启动子活性和前列腺癌细胞特异性，对mPC-1基因的1.1kb启动子进行了一系列的人工改造，并对改造后的mPC-1启动子进行了活性及细胞特异性分析。

1、启动子mPC-0.45、mPC-0.6、mPC-0.7、mPC-0.8、mPC-0.998的获得

为了确定mPC-1启动子发挥功能的区域，在p1.1基础上构建了一系列不同长度mPC-1启动子缺失突变体。用pm1.1-Luc质粒DNA为模板，PCR分别扩增出mPC-1基因翻译起始位点ATG上游长度分别约为0.45kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb和0.998kb的DNA启动子片段，将这些启动子根据片段的大小，分别命名为mPC-0.45、mPC-0.6、mPC-0.7、mPC-0.8、mPC-0.998。具体构建方法如下所述：

以pm1.1-Luc为模板，分别以PFD1：

5′-CGGGGTACCCTCAGGTTTCTGAGTAATGTGATTATGGC-3′(Kpn I)、PFD2：5′-CCGAGCTCAAGGCTGCTTGCTAAACACG-3′(Sac I)、PFD3：5′-CCGAGCTCCTGCACCTTCCAGCTACTTCC-3′(Sac I)、PFD4：5′-CCGAGCTCTGAGGGCATGCCTGACTTTGC-3′(Sac I)、PFD5：5′-CGGGGTACCGTTAGAGAGCATGAGCAGGGTCTCTGGAGG-3′(KpnI)为正向引物，以PR2：5′-GAAGATCTGCTAGCTGAAGGCAGCGAGCAAGGCGAGC-3′(Bgl II)为反向引物，进行PCR扩增mPC-1启动子序列的3′端不同长短的启动子DNA片段。

PCR的反应体系均为50μl，(10×Super Taq 5μl，dNTP 4μl，上游引物分别为PFD1、PFD2、PFD3、PFD4、PFD5 4μl，PR2 4μl，Super Taq 0.5μl，水补足至50μl)；

PCR的反应程序均为先94℃ 5min；再94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，共30cycles；最后72℃ 7min。

经测序检测表明PFD1和PR2为引物扩增得到465bp的片段(具有自序列1的5′端的第653-1101位核苷酸)，将该具有自序列1的5′端的第653-1101位核苷酸序列的片段命名为mPC-0.45启动子。将该片段经限制性内切酶SacI和Bgl II酶切后，插入到质粒pGL3-Basic(购自Promega公司)的SacI和Bgl II酶切位点之间，得到的质粒进行菌落PCR和质粒双酶切鉴定阳性克隆，将经鉴定表明含有mPC-0.45启动子的pGL3-Basic重组载体命名为pm0.45-Luc。

经测序检测表明PFD2和PR2为引物扩增得到612bp的片段(具有自序列1的5′端的第507-1101核苷酸)，将该具有自序列1的5′端的第507-1101位核苷酸序列的片段命名为mPC-0.6启动子。将该片段经限制性内切酶SacI和Bgl II酶切后，插入到质粒pGL3-Basic(购自Promega公司)的SacI和Bgl II酶切位点之间，得到的质粒进行菌落PCR和质粒双酶切鉴定阳性克隆，将经鉴定表明含有mPC-0.6启动子的pGL3-Basic重组载体命名为pm0.6-Luc。

经测序检测表明PFD3和PR2为引物扩增得到749bp的片段(具有自序列1的5′端的第369-1101位核苷酸)，将该具有自序列1的5′端的第369-1101位核苷酸序列的片段命名为mPC-0.7启动子。将该片段经限制性内切酶SacI和Bgl II酶切后，插入到质粒pGL3-Basic(购自Promega公司)的SacI和Bgl II酶切位点之间，得到的质粒进行菌落PCR和质粒双酶切鉴定阳性克隆，将经鉴定表明含有mPC-0.7启动子的pGL3-Basic重组载体命名为pm0.7-Luc。

经测序检测表明PFD4和PR2为引物扩增得到866bp的片段(具有自序列1的5′端的第252-1101位核苷酸)，将该具有自序列1的5′端的第252-1101位核苷酸序列的片段命名为mPC-0.8启动子。将该片段经限制性内切酶SacI和Bgl II酶切后，插入到质粒pGL3-Basic(购自Promega公司)的SacI和Bgl II酶切位点之间，得到的质粒进行菌落PCR和质粒双酶切鉴定阳性克隆，将经鉴定表明含有mPC-0.8启动子的pGL3-Basic重组载体命名为pm0.8-Luc。

经测序检测表明PFD5和PR2为引物扩增得到993bp的片段(具有自序列1的5′端的第125-1101位核苷酸)。将该具有自序列1的5′端的第125-1101位核苷酸序列的片段命名为mPC-0.998启动子。将该片段经限制性内切酶SacI和Bgl II酶切后，插入到质粒pGL3-Basic(购自Promega公司)的SacI和Bgl II酶切位点之间，得到的质粒进行菌落PCR和质粒双酶切鉴定阳性克隆，将经鉴定表明含有mPC-0.998启动子的pGL3-Basic重组载体命名为pm0.998-Luc。

2、启动子mPC-ARE-1.1和启动子mPC-14-ERE的获得

以质粒p61-PSA为模板，以PF3：5′-CGGGGTACCGCTAGCTGAAGGCAGCGAGCAAGG-3′(KpnI)和PR3：5′-CGGGGTACCGGTGACCAGAGCAGTCTAGG-3′(KpnI)为引物，进行PCR扩增，PCR的反应体系为50μl，其中，10×Super Taq 5μl，dNTP 4μl，PF34μl，PR3 4μl，Super Taq 0.5μl，水补足至50μl；PCR的反应程序为先94℃ 5min；再94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共30cycles；最后72℃ 7min。将扩增得到455bp(加上酶切位点，不加的酶切位点为437bp)的片段，经测序表明该片段含有雄激素受体反应元件的PSA启动子上游增强子区(ARE)(具有序列表中序列8的脱氧核苷酸序列)，共包含437个碱基(Yeung F，LiX，Ellett J，et al，Regionsof Prostate-specific Antigen(PSA)Promoter Confer Androgen-independentExpression of PSA in Prostate Cancer Cells，2000，THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY，275(52)：40846-40855)。

将上述扩增得到的片段用KpnI酶切后，插入到pm1.1-Luc载体KpnI位点(即插入到pm1.1-Luc的mPC-1启动子的KpnI酶切位点处(自序列表中序列1的5′端第1位脱氧核苷酸之前的KpnI酶切位点处)，将经测序表明含有上述PSA启动子上游增强子区的pm1.1-Luc重组载体命名为pARE-1.1。将pARE-1.1中含有的mPC-1插入PSA的增强区的嵌合启动子命名为mPC-ARE-1.1启动子(具有序列表中序列2的核苷酸序列)。

在pARE-1.1的基础上，用引物PF3、PR4、PF4、PR通过重叠PCR缺失了一个雌激素受体反应元件(ERE-2)(自序列表中序列1的5′端第103-119位核苷酸)构建了突变体p14-ERE。

具体方法为：以质粒pARE-1.1为模板，分别以PF3：

5′-CGGGGTACCGCTAGCTGAAGGCAGCGAGCAAGG-3′(Kpn I)和PR4：5′-CATGGAGAGAGCATGAGCAG-3′为引物扩增得到581bp的片段(具有自序列2的5′端的第1-581位核苷酸序列)，以PF4：

5′-CTGCTCATGCTCTCTCCATGACAGCGCTTGCAGGCCCTTGGTG-3′和PR5′-ACGCGTCGACGCTAGCTGAAGGCAGCGAGCAAGGCGAGC-3′(Sal I)为引物进行PCR扩增，得到983bp的片段(具有自序列2的5′端的第562-1544位核苷酸序列)，983bp片段与581bp片段有20个碱基重叠(自序列表中序列1的5′端第562-581位核苷酸)，然后以581bp和983bp片段为模板，以PF3和PR为引物进行PCR扩增，得到1527bp的片段，将经测序表明该片段具有自序列3的5′端的第1-1527位核苷酸序列，缺失了ERE-2(自序列表中序列1的5′端第103-119位核苷酸)，将该启动子命名为mPC-14-ERE启动子。将上述扩增得到的片段经Kpn I和Sal I酶切后，得到了437bp的ARE片段和1091bp的片段，首先将1091bp片段定向克隆到质粒pGL3-Basic荧光素酶(Luc)报告基因上游位置，即插入到含有荧光素酶报告基因但不含启动子的质粒pGL3-Basic(购自Promega公司)的Kpn I和Xho I酶切位点之间，得到新的质粒，然后将两端含有Kpn I位点的437bp的ARE片段插入到该质粒的Kpn I位点处，得到含有mPC-14-ERE启动子的载体，将其命名为p14-ERE。上述PCR的反应体系均为50μl；PCR的反应程序为先94℃ 5min；再94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，共30cycles；最后72℃ 7min。

3、mPC-19-ERE-1、mPC-19-ERE-2、mPC-21-ERE和mPC-23-ER的获得及含有这些启动子的重组载体的构建

为了进一部降低mPC-1启动子在乳腺癌细胞中的活性，提高前列腺癌组织特异性和活性，为此设计在mPC-14-ERE启动子基础上缺失最远端的ERE(ERE-1)或Repressor元件分别得到新的启动子结构P19-ERE-1、P19-ERE-2，再在mPC-14-ERE启动子基础上用ARE元件替换Repressor或用两个ARE元件替换近端的两个ERE(ERE-3和ERE-4)，从而构建4个新的启动子结构P19-ERE-1、P19-ERE-2、p21-ERE和p23-ER(结构简图如图4所示，图4中Δ表示元件缺失，<>表示所用到的替换元件)。具体方法如下所述：

以p14-ERE为模板，以PF5：5′-CGAGCTCACTCCTCGTAGATTTCTGCACTGTCCTTGG-3′(SacI)和PR2：5′-GAAGATCTGCTAGCTGAAGGCAGCGAGCAAGGCGAGC-3′(Bgl II)为引物，进行PCR扩增，得到缺失ERE-2的mPC-1启动子片段，将该片段用Sac I和Bgl II酶切，插入到载体pGL3-Basic通过Sac I和Bgl II酶切位点之间，将经测序表明含有上述片段的pGL3-Basic命名为p15-ERE，p15-ERE中含有缺失ERE2的mPC-1启动子片段。

以p61-PSA质粒为模板，用引物PF3：

5′-CGGGGTACCGCTAGCTGAAGGCAGCGAGCAAGG-3′(KpnI)和PR5：5′-CGAGCTCAGACAAGGGTGGAAGCCTCTGG-3′(SacI)为引物，进行PCR扩增，PCR的反应体系为50μl，(10×Super Taq 5μl，dNTP 4μl，PF34μl，PR54μl，Super Taq0.5μl，水补足至50μl)；PCR的反应程序为先94℃ 5min；再94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共30cycles；最后72℃ 7min。扩增得到437bp的片段，经测序表明该片段含有雄激素受体反应元件的PSA启动子上游增强子区(ARE)(具有序列表中序列8的脱氧核苷酸序列)，将该扩增片段即为ARE片段，将ARE片段用KpnI和Sac I酶切后，插入到p15-ERE的Kpn I和SacI酶切位点之间，得到含有插入1个ARE片段和缺失ERE-2的mPC-1启动子片段的重组载体，将该载体命名为p16-ERE，将该插入1个ARE片段和缺失ERE-2的mPC-1启动子片段命名为MPP。

由于点突变试剂盒适用于长度小于5k的序列，因此通过Kpn I和Hind III限制性内切酶酶切p16-ERE，将酶切得到的1527bp的MPP片段，插入载体pUC-18的Kpn I和Hind III酶切位点之间，将鉴定含有MPP片段的pUC-18重组质粒命名为p17-ERE。

按照TaKaRa点突变试剂盒(购自TaKaRa公司，D401)说明书将p17-ERE的MPP缺失远端的ERE1(自序列1的5′端第48-63位核苷酸)或Repressor元件(自序列1的5′端第650-661位核苷酸)，分别得到含有缺失了ERE-1的MPP片段的载体p18-ERE-1和缺失了Repressor元件的MPP片段的载体p18-ERE-2。

用Kpn I和Hind III双酶切p18-ERE-1，得到1511bp的缺失了ERE-1的MPP片段(插入了1个ARE片段和缺失ERE-2和ERE-1的mPC-1启动子片段，即mPC-19-ERE-1启动子)，经测序表明，mPC-19-ERE-1启动子具有序列表中序列4的核苷酸序列，自序列4的5′端的第1-1511位核苷酸和自序列4的5′端的第1-437位核苷酸为1个ARE片段序列。将Kpn I和Hind III双酶切p18-ERE-1得到的mPC-19-ERE-1启动子插入到pGL3-Basic的Kpn I和Hind III酶切位点之间得到含有mPC-19-ERE-1启动子的重组载体，将测序鉴定正确的重组载体命名为p19-ERE-1。

用Kpn I和Hind III双酶切p18-ERE-2，得到1515bp的缺失了Repressor元件的MPP片段(插入了1个ARE片段和缺失ERE-2和Repressor元件的mPC-1启动子片段)，即mPC-19-ERE-2启动子，经测序表明，mPC-19-ERE-2启动子具有序列表中序列5的核苷酸序列，自序列5的5′端的第1-1515位核苷酸和自序列5的5′端的第1-437位核苷酸为1个ARE片段序列。将Kpn I和Hind III双酶切p18-ERE-2得到的mPC-19-ERE-2启动子插入到pGL3-Basic的Kpn I和Hind III酶切位点之间得到含有mPC-19-ERE-2启动子的重组载体，将测序鉴定正确的重组载体命名为p19-ERE-2。

按照TaKaRa点突变试剂盒(购自TaKaRa公司，D401)说明书将p17-ERE中的MPP片段，由AREcs(Androgen Response Element consensus sequence，Kitty B.J.M.Cleutjens，Conny C.E.M.van Eekelen，Hetty A.G.M.van der Korput，AlbertO.Brinkmann，and Jan Trapman.Two Androgen Response Regions Cooperate inSteroid Hormone Regulated Activity of the Prostate-specific Antigen Promoter.1996.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，271(11)：6379-6388，序列为GGTACAnnnTGTTCT，n表示任意碱基此处选用GGTACAGGGTGTTCT)替换Repressor或者由两个正向重复的AREcs(自序列7的5′端第1427-1454位核苷酸)替换近端两个ERE元件，ERE 3(自序列1的5′端第1003-1012位核苷酸)和ERE4(自序列1的5′端第1017-1026位核苷酸)，分别得到了含有AREcs替换Repressor的MPP的载体p20-ERE和由2个AREcs替换2个ERE元件的MPP片段的载体p21-ER。

用Kpn I和Hind III双酶切p20-ERE，得到1527bp的AREcs替换Repressor的MPP片段(插入了1个ARE片段、缺失ERE-2和由AREcs替换Repressor的mPC-1启动子片段)，即mPC-22-ERE启动子，经测序表明，mPC-22-ERE启动子具有序列表中序列6的核苷酸序列，自序列6的5′端的第1-1527位核苷酸和自序列6的5′端的第1-437位核苷酸为1个ARE片段序列，以及自序列6的5′端的第1070-1081位核苷酸为替换后AREcs的序列。将Kpn I和Hind III双酶切p20-ERE得到的mPC-22-ERE启动子插入到pGL3-Basic的Kpn I和Hind III酶切位点之间得到含有mPC-22-ERE启动子的重组载体，将测序鉴定正确的重组载体命名为p22-ERE。

用Kpn I和Hind III双酶切p21-ERE，得到1527bp的2个AREcs替换2个ERE(ERE3和ERE4)元件的MPP片段(插入了1个ARE片段、缺失ERE-2以及由2个AREcs替换ERE3和ERE4的mPC-1启动子片段)，即mPC-23-ERE启动子，经测序表明，mPC-23-ERE启动子具有序列表中序列7的核苷酸序列，自序列7的5′端的第1-1527位核苷酸；自序列7的5′端的第1-437位核苷酸为1个ARE片段序列，自序列7的5′端的第1427-1440位核苷酸和自序列7的5′端的1441-1454位核苷酸为替换ERE3和ERE4后2个AREcs的序列。将Kpn I和Hind III双酶切p21-ERE得到的mPC-23-ERE启动子插入到pGL3-Basic的Kpn I和Hind III酶切位点之间得到含有mPC-23-ERE启动子的重组载体，将测序鉴定正确的重组载体命名为p23-ERE。

4、启动于mPC-ARE-1.1、mPC-14-ERE、mPC-19-ERE-1、mPC-19-ERE-2、mPC-22-ERE、mPC-23-ER、mPC-0.6、mPC-0.7、mPC-0.8和mPC-0.998的转录活性分析

将人前列腺癌细胞LNCaP接种于装有含10％FBS的RPMI1640细胞培养基的24孔板中，待细胞生长至铺满80％的密度备用。

将分别含有启动子mPC-14-ERE、mPC-ARE-1.1、mPC-1、mPC-0.998、mPC-0.8、mPC-0.7、mPC-0.6、mPC-0.45、mPC-19-ERE-1、mPC-19-ERE-2、mPC-22-ERE、mPC-23-ER的载体p14-ERE、pARE-1.1、pm1.1-Luc、pm0.998-Luc、pm0.8-Luc、pm0.7-Luc、pm0.6-Luc、pm0.45-Luc、p19-ERE-1、p19-ERE-2、p22-ERE或p23-ERE分别与pRL-TK(内标对照，Renilla荧光素酶载体)按照摩尔数比为1/10的比例混合后，再与脂质体Lipfectamin 2000试剂(购自Invitrogen公司)混合(按照脂质体Lipfectamin 2000说明书进行)，然后分别转染上述培养好的人前列腺癌细胞LNCaP，48h后收集细胞，然后按照实施例1中步骤2所述的方法进行荧光素酶的相对活性检测。

p14-ERE、pARE-1.1、pm1.1-Luc、pm0.998-Luc、pm0.8-Luc、pm0.7-Luc、pm0.6-Luc、pm0.45-Luc转染细胞的荧光素酶的相对活性检测结果如图5所示，结果表明，p14-ERE、pARE-1.1、pm1.1-Luc、pm0.998-Luc、pm0.8-Luc、pm0.7-Luc、pm0.6-Luc和pm0.45-Luc转染的细胞的荧光素酶相对活性分别是778、726、648、724、740、510、403和15。说明当启动子DNA序列长度为0.8kb时(pm0.8-Luc)其活性已经达到高峰，长度分别为0.998kb(pm0.998-Luc)和1.1kb(pm1.1-Luc)时仍能维持比较高的启动子活性，pm0.7-Luc、pm0.6-Luc也有较高的活性。而pARE-1.1和p14-ERE的启动子活性与pm1.1-Luc相比稍有提高。

p19-ERE-1、p19-ERE-2、p22-ERE和p23-ERE转染的前列腺癌细胞LNCaP的荧光素酶的相对活性检测结果如图6所示，结果表明，与p14-ERE相比，缺失远端ERE(ERE1)序列的p19-ERE-1启动子活性提高了1.66倍；Repressor序列缺失的p19-ERE-2启动子活性提高了约1.8倍，Repressor序列缺失并被ARE序列替换后的p22-ERE启动子活性基本与p19-ERE-2相当。但是当用两个ARE序列替换掉近端两个ERE序列后的p23-ERE启动子活性比p14-ERE提高了2.6倍。结果也表明，在LNCaP细胞中ERE和Repressor序列可能起一定的负调控作用，这两种负调控元件缺失后会显著提高启动子的强度。

5、mPC-1、mPC-ARE-1.1和mPC-14-ERE启动子对雄激素的敏感性分析

由于在PSA启动子、mPC-1、mPC-ARE-1.1和mPC-14-ERE启动子序列中都存在雄激素受体作用元件ARE，因此检测了添加雄激素对上述几个启动子活性的影响。

将人前列腺癌细胞LNCaP分别接种于装有含5％的经过活性碳处理的血清的无酚红的RPMI 1640细胞培养液(无激素培养液)(无酚红的RPMI 1640+5％血清(活性炭处理后不含任何雄激素))、含10％胎牛血清的含酚红的RPMI 1640细胞培养液(正常培养液)的24孔板中，待细胞生长至铺满80％的密度备用。

将pm1.1-Luc、p14-ERE、pARE-1.1、p61-PSA、pGL3-Control或pGL3-Basic与pCMV-gal(购自Promega公司)按照摩尔数比为10∶1的比例混合后，再与脂质体Lipfectamin 2000试剂(购自Invitrogen公司)混合(按照脂质体Lipfectamin 2000说明书进行)，然后分别转染上述培养好的人前列腺癌细胞LNCaP，转染5个小时后，换细胞培养液，即将转染后的细胞分别在上述正常培养液(含10％胎牛血清的含酚红的RPMI 1640细胞培养液)中添加雄激素R1881(Perkin-Elmer Life andAnalyticai Sciences，Boston，MA)至终浓度为10nM的培养基(10nM R1881组)，不添加雄激素R1881的含10％胎牛血清的含酚红的RPMI 1640细胞培养液(正常培养液对照组)或含5％的经过活性碳处理的血清的无酚红的RPMI 1640细胞培养液(无激素培养液对照组)中培养48小时后收集细胞，按照实施例1的步骤3的方法通过荧光光度计来检测荧光素酶的活性，并检测荧光素酶的相对活性(RLA，即荧光素酶活性/β-半乳糖苷酶活性)，从而测定报告基因的表达和启动子活性。

结果如图7所示，结果表明，pm1.1-luc、pARE-1.1和p14-ERE在10nM R1881组中明显比在无激素培养液组和正常培养液组的转录活性高，说明雄激素R1881，明显提高了pm1.1-luc、pARE-1.1和p14-ERE转录活性，对pARE-1.1和p14-ERE刺激作用更明显。进一步证明该ARE调控区的作用。图7中“NO stimulus”为无激素培养液组，“normal”为正常培养液组，“10nM R1881”为10nM R1881组。

6、mPC-1启动子的衍生启动子细胞特异性分析

按照实施例1中的步骤2的方法用pm1.1-luc、pARE-1.1和p14-ERE分别与pRL-TK(购自Promega公司)(内标对照，Renilla荧光素酶载体)按照摩尔数比为1/10的比例混合后，转染小鼠成纤维NIH3T3(购自中科院上海细胞所)、人肝癌HepG2(购自中科院上海细胞所)、人乳腺癌MCF-7(购自中科院上海细胞所)、雄激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP、和雄激素非依赖型前列腺癌细胞PC3、DU145，检测转染细胞的荧光素酶的相对活性，用其分析mPC-1、mPC-ARE-1.1、mPC-14-ERE分别在小鼠成纤维NIH3T3、人肝癌HepG2、人乳腺癌MCF-7、雄激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP、和雄激素非依赖型前列腺癌细胞PC-3、DU145中的转录活性。荧光素酶的相对活性检测结果如图8所示，结果表明，与mPC-1启动子相比，pARE-1.1和p14-ERE启动子活性在LNCaP细胞中显著上升，而在其他细胞中没有明显变化。

同样，按照实施例1中的步骤2的方法，用pm1.1-luc、pARE-1.1、p14-ERE和经人工改造后活性最强的p23-ERE启动子分别与pRL-TK(购自Promega公司)(内标对照，Renilla荧光素酶载体)按照摩尔数比为10∶1的比例混合后，转染前列腺癌细胞LNCaP、黑色素瘤B16、非洲绿猴肾COS7和人乳腺癌MCF-7，检测转染细胞的荧光素酶的相对活性，其中，以p14-ERE为对照，分析了mPC-23-ERE启动子的细胞特异性转录活性。结果如图9所示，结果表明，mPC-23-ERE启动子活性在雄激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP中比p14-ERE启动子活性高出2倍以上，比在黑色素瘤B16、非洲绿猴肾COS7和人乳腺癌MCF-7中的转录活性提高5倍以上。这一结果也说明，在p14-ERE基础上缺失近端的两个ERE并用ARE替换，不仅提高了启动子的活性，而且增强了该启动子的前列腺肿瘤细胞特异性，表明该启动子在构建转基因小鼠和基因治疗中应有较好的应用前景。

                                    序列表

<160>1

<210>1

<211>1101

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>1

ctcaggtttc tgagtaatgt gattatggca tgagccacca tgcctggctt gacctatttc      60

ctccttttaa cttagttcca ccaagggcct gcaagcgctg ttgggtcaca gcaatagcca     120

tggagagagc atgagcaggg tctctggagg cctgggatgg aggaagtgga cttggtgatt     180

gtaaagtttt accagccagc tccctttctg cctggagggt gtgccaaaga aacaagttct     240

ttgtagagcc ctgagggcat gcctgacttt gcttaaacaa aggagctgaa acaccccctg     300

cccccagctg tgggagtttc agccccccca ccccccaccc cggaagcggt gggagctgcc     360

tgcaccttcc agctacttcc tatgaaaacc tcattcttcc aaagagtcag tttaaaattg     420

tttgacagtt attcagattc tgctttagaa aaaaaaaaaa ggatgatggg tctagcttta     480

tttttgtatt aggttctgct taaaaggctg cttgctaaac acgggatgcc aagctctcag     540

aatcctgtat aatatagggt gcaagaaaag tatcacccag atggcatttt cggggagatt     600

actgacagat aatcctctct tgtcctagaa gattaagtct gccccgccga cgatgtggtc     660

agatgaccgg tctaaaaaag ttgtatttta aacaatattc ctgctagtgt ctagtgtttg     720

tacaactgaa tggggctcca gagtgggggg cctcctttgt gtacagaggg aaggccactc     780

cctctgcccc ggttattctt tgttcagtga attagcgaca ggtggtgact agggccctcc     840

taagggagga gtcactacag acctgctcgt gggagccgga gccacgccgg ggccggagct     900

gggcggggct ttaagcccgg ttcctctggg ccggagctgg gcggggcttt aagcccggtt     960

cctctgggcc ggagctgggc ggggctttaa gcccggttcc tcttctcacc tgggctgcac    1020

aggtcagccg gatctccctc agcccggggc tcccaggctg ccgcagcgcc atgctcgcct    1080

tgctcgctgccttcagctag c                                               1101

<210>2

<211>1544

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ggtgaccaga gcagtctagg tggatgctgt gcacacgggg tttgtgccac tggtgagaaa      60

cctgagatta ggaatcctca atcttatact gggacaactt gcaaacctgc tcagcctttg     120

tctctgatga agatattatc ttcatgatct tggattgaaa acagacctac tctggaggaa     180

catattgtat cgattgtcct tgacagtaaa caaatctgtt gtaagagaca ttatctttat     240

tatctaggac agtaagcaag cctggatctg agagagatat catcttgcaa ggatgcctgc     300

tttacaaaca tccttgaaac aacaatccag aaaaaaaaag gtgttgctgt ctttgctcag     360

aagacacaca gatacgtgac agaaccatgg agaattgcct cccaacactg ttcagccaga     420

ggcttccacc cttgtctggt accctcaggt ttctgagtaa tgtgattatg gcatgagcca     480

ccatgcctgg cttgacctat ttcctccttt taacttagtt ccaccaaggg cctgcaagcg     540

ctgttgggtc acagcaatag ccatggagag agcatgagca gggtctctgg aggcctggga     600

tggaggaagt ggacttggtg attgtaaagt tttaccagcc agctcccttt ctgcctggag     660

ggtgtgccaa agaaacaagt tctttgtaga gccctgaggg catgcctgac tttgcttaaa     720

caaaggagct gaaacacccc ctgcccccag ctgtgggagt ttcagccccc ccacccccca     780

ccccggaagc ggtgggagct gcctgcacct tccagctact tcctatgaaa acctcattct     840

tccaaagagt cagtttaaaa ttgtttgaca gttattcaga ttctgcttta gaaaaaaaaa     900

aaaggatgat gggtctagct ttatttttgt attaggttct gcttaaaagg ctgcttgcta     960

aacacgggat gccaagctct cagaatcctg tataatatag ggtgcaagaa aagtatcacc    1020

cagatggcat tttcggggag attactgaca gataatcctc tcttgtccta gaagattaag    1080

tctgccccgc cgacgatgtg gtcagatgac cggtctaaaa aagttgtatt ttaaacaata    1140

ttcctgctag tgtctagtgt ttgtacaact gaatggggct ccagagtggg gggcctcctt    1200

tgtgtacaga gggaaggcca ctccctctgc cccggttatt ctttgttcag tgaattagcg    1260

acaggtggtg actagggccc tcctaaggga ggagtcacta cagacctgct cgtgggagcc    1320

ggagccacgc cggggccgga gctgggcggg gctttaagcc cggttcctct gggccggagc    1380

tgggcggggc tttaagcccg gttcctctgg gccggagctg ggcggggctt taagcccggt    1440

tcctcttctc acctgggctg cacaggtcag ccggatctcc ctcagcccgg ggctcccagg    1500

ctgccgcagc gccatgctcg ccttgctcgc tgccttcagc tagc                     1544

<210>3

<211>1527

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggtgaccaga gcagtctagg tggatgctgt gcacacgggg tttgtgccac tggtgagaaa      60

cctgagatta ggaatcctca atcttatact gggacaactt gcaaacctgc tcagcctttg     120

tctctgatga agatattatc ttcatgatct tggattgaaa acagacctac tctggaggaa     180

catattgtat cgattgtcct tgacagtaaa caaatctgtt gtaagagaca ttatctttat     240

tatctaggac agtaagcaag cctggatctg agagagatat catcttgcaa ggatgcctgc     300

tttacaaaca tccttgaaac aacaatccag aaaaaaaaag gtgttgctgt ctttgctcag     360

aagacacaca gatacgtgac agaaccatgg agaattgcct cccaacactg ttcagccaga     420

ggcttccacc cttgtctggt accctcaggt ttctgagtaa tgtgattatg gcatgagcca     480

ccatgcctgg cttgacctat ttcctccttt taacttagtt ccaccaaggg cctgcaagcg     540

ctgttatgga gagagcatga gcagggtctc tggaggcctg ggatggagga agtggacttg     600

gtgattgtaa agttttacca gccagctccc tttctgcctg gagggtgtgc caaagaaaca     660

agttctttgt agagccctga gggcatgcct gactttgctt aaacaaagga gctgaaacac     720

cccctgcccc cagctgtggg agtttcagcc cccccacccc ccaccccgga agcggtggga     780

gctgcctgca ccttccagct acttcctatg aaaacctcat tcttccaaag agtcagttta     840

aaattgtttg acagttattc agattctgct ttagaaaaaa aaaaaaggat gatgggtcta     900

gctttatttt tgtattaggt tctgcttaaa aggctgcttg ctaaacacgg gatgccaagc     960

tctcagaatc ctgtataata tagggtgcaa gaaaagtatc acccagatgg cattttcggg    1020

gagattactg acagataatc ctctcttgtc ctagaagatt aagtctgccc cgccgacgat    1080

gtggtcagat gaccggtcta aaaaagttgt attttaaaca atattcctgc tagtgtctag    1140

tgtttgtaca actgaatggg gctccagagt ggggggcctc ctttgtgtac agagggaagg    1200

ccactccctc tgccccggtt attctttgtt cagtgaatta gcgacaggtg gtgactaggg    1260

ccctcctaag ggaggagtca ctacagacct gctcgtggga gccggagcca cgccggggcc    1320

ggagctgggc ggggctttaa gcccggttcc tctgggccgg agctgggcgg ggctttaagc    1380

ccggttcctc tgggccggag ctgggcgggg ctttaagccc ggttcctctt ctcacctggg    1440

ctgcacaggt cagccggatc tccctcagcc cggggctccc aggctgccgc agcgccatgc    1500

tcgccttgct cgctgccttc agctagc                                        1527

<210>4

<211>1511

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ggtgaccaga gcagtctagg tggatgctgt gcacacgggg tttgtgccac tggtgagaaa      60

cctgagatta ggaatcctca atcttatact gggacaactt gcaaacctgc tcagcctttg     120

tctctgatga agatattatc ttcatgatct tggattgaaa acagacctac tctggaggaa     180

catattgtat cgattgtcct tgacagtaaa caaatctgtt gtaagagaca ttatctttat     240

tatctaggac agtaagcaag cctggatctg agagagatat catcttgcaa ggatgcctgc     300

tttacaaaca tccttgaaac aacaatccag aaaaaaaaag gtgttgctgt ctttgctcag     360

aagacacaca gatacgtgac agaaccatgg agaattgcct cccaacactg ttcagccaga     420

ggcttccacc cttgtctgag ctcctcaggt ttctgagtaa tgtgattatg gcatgagcca     480

ccatgcctgg cttttaactt agttccacca agggcctgca agcgctgtta tggagagagc     540

atgagcaggg tctctggagg cctgggatgg aggaagtgga cttggtgatt gtaaagtttt     600

accagccagc tccctttctg cctggagggt gtgccaaaga aacaagttct ttgtagagcc     660

ctgagggcat gcctgacttt gcttaaacaa aggagctgaa acaccccctg cccccagctg     720

tgggagtttc agccccccca ccccccaccc cggaagcggt gggagctgcc tgcaccttcc     780

agctacttcc tatgaaaacc tcattcttcc aaagagtcag tttaaaattg tttgacagtt     840

attcagattc tgctttagaa aaaaaaaaaa ggatgatggg tctagcttta tttttgtatt     900

aggttctgct taaaaggctg cttgctaaac acgggatgcc aagctctcag aatcctgtat     960

aatatagggt gcaagaaaag tatcacccag atggcatttt cggggagatt actgacagat    1020

aatcctctct tgtcctagaa gattaagtct gccccgccga cgatgtggtc agatgaccgg    1080

tctaaaaaag ttgtatttta aacaatattc ctgctagtgt ctagtgtttg tacaactgaa    1140

tggggctcca gagtgggggg cctcctttgt gtacagaggg aaggccactc cctctgcccc    1200

ggttattctt tgttcagtga attagcgaca ggtggtgact agggccctcc taagggagga    1260

gtcactacag acctgctcgt gggagccgga gccacgccgg ggccggagct gggcggggct    1320

ttaagcccgg ttcctctggg ccggagctgg gcggggcttt aagcccggtt cctctgggcc    1380

ggagctgggc ggggctttaa gcccggttcc tcttctcacc tgggctgcac aggtcagccg    1440

gatctccctc agcccggggc tcccaggctg ccgcagcgcc atgctcgcct tgctcgctgc    1500

cttcagctag c                                                         1511

<210>5

<211>1515

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ggtgaccaga gcagtctagg tggatgctgt gcacacgggg tttgtgccac tggtgagaaa     60

cctgagatta ggaatcctca atcttatact gggacaactt gcaaacctgc tcagcctttg    120

tctctgatga agatattatc ttcatgatct tggattgaaa acagacctac tctggaggaa    180

catattgtat cgattgtcct tgacagtaaa caaatctgtt gtaagagaca ttatctttat    240

tatctaggac agtaagcaag cctggatctg agagagatat catcttgcaa ggatgcctgc    300

tttacaaaca tccttgaaac aacaatccag aaaaaaaaag gtgttgctgt ctttgctcag    360

aagacacaca gatacgtgac agaaccatgg agaattgcct cccaacactg ttcagccaga    420

ggcttccacc cttgtctggt accctcaggt ttctgagtaa tgtgattatg gcatgagcca    480

ccatgcctgg cttgacctat ttcctccttt taacttagtt ccaccaaggg cctgcaagcg    540

ctgttatgga gagagcatga gcagggtctc tggaggcctg ggatggagga agtggacttg    600

gtgattgtaa agttttacca gccagctccc tttctgcctg gagggtgtgc caaagaaaca    660

agttctttgt agagccctga gggcatgcct gactttgctt aaacaaagga gctgaaacac    720

cccctgcccc cagctgtggg agtttcagcc cccccacccc ccaccccgga agcggtggga    780

gctgcctgca ccttccagct acttcctatg aaaacctcat tcttccaaag agtcagttta    840

aaattgtttg acagttattc agattctgct ttagaaaaaa aaaaaaggat gatgggtcta    900

gctttatttt tgtattaggt tctgcttaaa aggctgcttg ctaaacacgg gatgccaagc    960

tctcagaatc ctgtataata tagggtgcaa gaaaagtatc acccagatgg cattttcggg   1020

gagattactg acagataatc ctctcttgtc ctagaagatt aagtctgccc cgccggatga   1080

ccggtctaaa aaagttgtat tttaaacaat attcctgcta gtgtctagtg tttgtacaac   1140

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ccccggttat tctttgttca gtgaattagc gacaggtggt gactagggcc ctcctaaggg   1260

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ctgccttcag ctagc                                                    1515

<210>6

<211>1527

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

ggtgaccaga gcagtctagg tggatgctgt gcacacgggg tttgtgccac tggtgagaaa     60

cctgagatta ggaatcctca atcttatact gggacaactt gcaaacctgc tcagcctttg    120

tctctgatga agatattatc ttcatgatct tggattgaaa acagacctac tctggaggaa    180

catattgtat cgattgtcct tgacagtaaa caaatctgtt gtaagagaca ttatctttat    240

tatctaggac agtaagcaag cctggatctg agagagatat catcttgcaa ggatgcctgc    300

tttacaaaca tccttgaaac aacaatccag aaaaaaaaag gtgttgctgt ctttgctcag    360

aagacacaca gatacgtgac agaaccatgg agaattgcct cccaacactg ttcagccaga    420

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ccatgcctgg cttgacctat ttcctccttt taacttagtt ccaccaaggg cctgcaagcg    540

ctgttatgga gagagcatga gcagggtctc tggaggcctg ggatggagga agtggacttg    600

gtgattgtaa agttttacca gccagctccc tttctgcctg gagggtgtgc caaagaaaca    660

agttctttgt agagccctga gggcatgcct gactttgctt aaacaaagga gctgaaacac    720

cccctgcccc cagctgtggg agtttcagcc cccccacccc ccaccccgga agcggtggga    780

gctgcctgca ccttccagct acttcctatg aaaacctcat tcttccaaag agtcagttta    840

aaattgtttg acagttattc agattctgct ttagaaaaaa aaaaaaggat gatgggtcta    900

gctttatttt tgtattaggt tctgcttaaa aggctgcttg ctaaacacgg gatgccaagc    960

tctcagaatc ctgtataata tagggtgcaa gaaaagtatc acccagatgg cattttcggg   1020

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gtggtcagat gaccggtcta aaaaagttgt attttaaaca atattcctgc tagtgtctag   1140

tgtttgtaca actgaatggg gctccagagt ggggggcctc ctttgtgtac agagggaagg   1200

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ccggttcctc tgggccggag ctgggcgggg ctttaagccc ggttcctctt ctcacctggg   1440

ctgcacaggt cagccggatc tccctcagcc cggggctccc aggctgccgc agcgccatgc   1500

tcgccttgct cgctgccttc agctagc                                       1527

<210>7

<211>1527

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ggtgaccaga gcagtctagg tggatgctgt gcacacgggg tttgtgccac tggtgagaaa     60

cctgagatta ggaatcctca atcttatact gggacaactt gcaaacctgc tcagcctttg    120

tctctgatga agatattatc ttcatgatct tggattgaaa acagacctac tctggaggaa    180

catattgtat cgattgtcct tgacagtaaa caaatctgtt gtaagagaca ttatctttat    240

tatctaggac agtaagcaag cctggatctg agagagatat catcttgcaa ggatgcctgc    300

tttacaaaca tccttgaaac aacaatccag aaaaaaaaag gtgttgctgt ctttgctcag    360

aagacacaca gatacgtgac agaaccatgg agaattgcct cccaacactg ttcagccaga    420

ggcttccacc cttgtctggt accctcaggt ttctgagtaa tgtgattatg gcatgagcca    480

ccatgcctgg cttgacctat ttcctccttt taacttagtt ccaccaaggg cctgcaagcg    540

ctgttatgga gagagcatga gcagggtctc tggaggcctg ggatggagga agtggacttg    600

gtgattgtaa agttttacca gccagctccc tttctgcctg gagggtgtgc caaagaaaca    660

agttctttgt agagccctga gggcatgcct gactttgctt aaacaaagga gctgaaacac    720

cccctgcccc cagctgtggg agtttcagcc cccccacccc ccaccccgga agcggtggga    780

gctgcctgca ccttccagct acttcctatg aaaacctcat tcttccaaag agtcagttta    840

aaattgtttg acagttattc agattctgct ttagaaaaaa aaaaaaggat gatgggtcta    900

gctttatttt tgtattaggt tctgcttaaa aggctgcttg ctaaacacgg gatgccaagc    960

tctcagaatc ctgtataata tagggtgcaa gaaaagtatc acccagatgg cattttcggg   1020

gagattactg acagataatc ctctcttgtc ctagaagatt aagtctgccc cgccgacgat   1080

gtggtcagat gaccggtcta aaaaagttgt attttaaaca atattcctgc tagtgtctag   1140

tgtttgtaca actgaatggg gctccagagt ggggggcctc ctttgtgtac agagggaagg   1200

ccactccctc tgccccggtt attctttgtt cagtgaatta gcgacaggtg gtgactaggg   1260

ccctcctaag ggaggagtca ctacagacct gctcgtggga gccggagcca cgccggggcc   1320

ggagctgggc ggggctttaa gcccggttcc tctgggccgg agctgggcgg ggctttaagc   1380

ccggttcctc tgggccggag ctgggcgggg ctttaagccc ggttccgtac agggtgttct   1440

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tcgcct tgct cgctgccttc agctagc                                      1527

<210>8

<211>437

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

ggtgaccaga gcagtctagg tggatgctgt gcacacgggg tttgtgccac tggtgagaaa     60

cctgagatta ggaatcctca atcttatact gggacaactt gcaaacctgc tcagcctttg    120

tctctgatga agatattatc ttcatgatct tggattgaaa acagacctac tctggaggaa    180

catattgtat cgattgtcct tgacagtaaa caaatctgtt gtaagagaca ttatctttat    240

tatctaggac agtaagcaag cctggatctg agagagatat catcttgcaa ggatgcctgc    300

tttacaaaca tccttgaaac aacaatccag aaaaaaaaag gtgttgctgt ctttgctcag    360

aagacacaca gatacgtgac agaaccatgg agaattgcct cccaacactg ttcagccaga    420

ggcttccacc cttgtct                                                   437

<210>9

<211>595

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

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aaagtatcac ccagatggca ttttcgggga gattactgac agataatcct ctcttgtcct    120

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tttaaacaat attcctgcta gtgtctagtg tttgtacaac tgaatggggc tccagagtgg    240

ggggcctcct ttgtgtacag agggaaggcc actccctctg ccccggttat tctttgttca    300

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<210>10

<211>588

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

gctgcttgct aaacacggga tgccaagctc tcagaatcct gtataatata gggtgcaaga     60

aaagtatcac ccagatggca ttttcgggga gattactgac agataatcct ctcttgtcct    120

agaagattaa gtctgccccg ccggatgacc ggtctaaaaa agttgtattt taaacaatat    180

tcctgctagt gtctagtgtt tgtacaactg aatggggctc cagagtgggg ggcctccttt    240

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gggcggggct ttaagcccgg ttcctctggg ccggagctgg gcggggcttt aagcccggtt    480

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<210>11

<211>595

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

gctgcttgct aaacacggga tgccaagctc tcagaatcct gtataatata gggtgcaaga     60

aaagtatcac ccagatggca ttttcgggga gattactgac agataatcct ctcttgtcct    120

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ggggcctcct ttgtgtacag agggaaggcc actccctctg ccccggttat tctttgttca    300

gtgaattagc gacaggtggt gactagggcc ctcctaaggg aggagtcact acagacctgc    360

tcgtgggagc cggagccacg ccggggccgg agctgggcgg ggctttaagc ccggttcctc    420

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gggctcccag gctgccgcag cgccatgctc gccttgctcg ctgccttcag ctagc         595

<210>12

<211>595

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

gctgcttgct aaacacggga tgccaagctc tcagaatcct gtataatata gggtgcaaga     60

aaagtatcac ccagatggca ttttcgggga gattactgac agataatcct ctcttgtcct    120

agaagattaa gtctgccccg ccgacgatgt ggtcagatga ccggtctaaa aaagttgtat    180

tttaaacaat attcctgcta gtgtctagtg tttgtacaac tgaatggggc tccagagtgg    240

ggggcctcct ttgtgtacag agggaaggcc actccctctg ccccggttat tctttgttca    300

gtgaattagc gacaggtggt gactagggcc ctcctaaggg aggagtcact acagacctgc    360

tcgtgggagc cggagccacg ccggggccgg agctgggcgg ggctttaagc ccggttcctc    420

tgggccggag ctgggcgggg ctttaagccc ggttcctctg ggccggagct gggcggggct    480

ttaagcccgg ttcctcttct cacctgggct gcacaggtca gccggatctc cctcagcccg    540

gggctcccag gctgccgcag cgccatgctc gccttgctcg ctgccttcag ctagc         595