多孔膜支持发育中的针叶树体细胞胚的用途

摘要

本发明提供用于发育针叶树子叶体细胞胚的方法。在一些实施方案中，本发明方法包括以下步骤：在至少间歇接触液体发育培养基的多孔膜上，将针叶树前子叶体细胞胚培养足够时段，以从前子叶体细胞胚制备针叶树子叶体细胞胚。

说明书

发明领域

本发明涉及用于体外制备植物胚、以及可选择地从植物胚中生产植物的方法。

发明背景

将针叶树例如松树和冷杉来生产木制品的需求在不断增长。一个建议的提供充足的针叶树供应问题的解决方案是鉴定具有期望特征例如生长速率快的针叶树，并通过体细胞克隆来生产大量的遗传上相同的优良树木。

体细胞克隆是从树的体细胞组织构建遗传上相同的树木的方法。树体细胞组织是不同于雄性和雌性配子的树组织。在一个体细胞克隆的方法中，树体细胞组织培养在包含激素例如生长素和/或细胞激动素的起始培养基中，其中激素可促进能发育成体细胞胚的胚性细胞的形成。然后在维持培养基中进一步培养胚性细胞，来促进胚性细胞增殖以形成前子叶(pre-cotyledonary)胚(即，没有子叶的胚)。随后将增殖的胚性细胞培养在可促进子叶体细胞胚发育的发育培养基中，其中所述的子叶体细胞胚，例如，能被置于人工种子中并播种在可萌发长成针叶树幼苗的土壤中。将幼苗移植到适于后续生长和最终收获的生长位置，来生产木材或木制品。也可在萌发培养基中萌发子叶体细胞胚，此后转入土壤以进一步生长。

有关针叶树胚的体细胞克隆的持续的问题是刺激可萌发生成植株的体细胞胚的有效形成。体外形成的针叶树体细胞胚优选是在针叶树种子中体内形成的、物理上或生理上相似的或相同的针叶树合子胚。因此，一直需要从针叶树胚性细胞制备可存活(viable)的针叶树体细胞胚的方法。

发明概述

本发明发现多孔膜例如尼龙膜，可用于在植物体细胞胚生产的发育期间支持植物组织。将发育中的体细胞胚放置在可连续或间歇接触液体发育培养基的多孔膜上。例如，多孔膜可放置在吸水垫上，其中吸水垫浸泡在发育培养基中以使得发育培养基穿过尼龙膜并接触胚。支撑胚的尼龙膜通常封入含有能使胚保持潮湿的湿气的密封空间中。不应将胚完全浸入发育培养基中。本申请描述了用于间歇性湿润膜的下表面的代表性的系统，其中该膜在其上表面支撑发育中的体细胞胚。当提起膜以便将体细胞胚从发育期转到体细胞胚生产过程的随后时期时，优选的多孔膜是足够结实以抗撕裂。

因此，在一个方面中，本发明提供用于发育针叶树子叶体细胞胚的方法。本发明该方面的每种方法包括以下步骤：在至少是间歇接触液体发育培养基的多孔膜上，将针叶树前子叶体细胞胚培养足够的时间，以从前子叶体细胞胚制备针叶树子叶体细胞胚。

在另一方面，本发明提供用于生产针叶树子叶体细胞胚的方法，其中每种方法包括步骤：(a)在诱导培养基中或上培养针叶树体细胞，来产生胚性细胞；(b)在维持培养基中或上培养步骤(a)中制备的胚性细胞，来生成针叶树前子叶体细胞胚；和(c)在至少是间歇接触液体发育培养基的多孔膜上，将步骤(b)中形成的针叶树前子叶体细胞胚培养足够的时间，来从前子叶体细胞胚制备针叶树子叶体细胞胚。

附图简述

当结合附图进行实施时，通过参考下列详细描述可更易理解和明白本发明的上述方面和许多所属优点，其中：

图1显示通过液体发育培养基间歇或连续湿润多孔膜的代表性的系统，其中膜支持发育中的植物体细胞胚。

优选实施方案的详细描述

本文中除非特别定义，本文使用的所有术语与本发明领域的技术人员所知的意思相同。

除非另外规定，所有以百分比表示的浓度值是重量体积百分比。

在本发明的一个方面中，提供用于发育针叶树子叶体细胞胚的方法。本发明该方面的每种方法包括以下步骤：在至少是间歇接触液体发育培养基的多孔膜上，将针叶树前子叶体细胞胚培养足够的时间，来从前子叶体细胞胚制备针叶树子叶体细胞胚。

本发明方法可用于从任何针叶树，例如松属树种，如火炬松(Pinustaeda)和辐射松制备子叶体细胞胚。此外，作为实例，通过本发明方法可制备花旗松子叶体细胞胚。

用于实施本发明的膜是多孔的，没有基质电位(matrix potential)(或基本上没有基质电位)并且是无菌的。有用的膜的实例包括不吸收发育培养基的尼龙膜、尼龙纤维、金属丝网、塑料网和聚合物纤维。在多孔膜中有效孔径是介于约5微米至约1200微米范围之间，例如从约50微米到约500微米。

发育培养基是液体培养基。发育培养基含有维持体细胞胚的营养素。在发育培养基中可包含麦芽糖以作为体细胞胚的主要糖源或唯一糖源。麦芽糖有效浓度是介于约1％至约2.5％范围之间。合适的发育培养基通常不包含增殖激素，例如生长素和细胞激动素。

将发育培养基的摩尔渗透压浓度调至属于期望范围的值，例如从约250mM/Kg至约450mM/Kg。通常，350mM/Kg或更高的摩尔渗透压浓度是有利的。在本文实施例1中描述了合适发育培养基的实例。

作为实例，可在尼龙膜上培养针叶树前子叶体细胞胚，其中所述的尼龙膜与发育培养基在10℃至30℃温度中，例如15℃至25℃，或例如20℃至23℃，至少间歇接触5至12周的时段，例如8周至10周。

例如，可将液体发育培养基施加到吸收基片，如纤维素(如纤维素纤维)制成的基片，如一种或多种滤纸或一些其它吸收性纸质材料。基片吸收穿过位于基片上的多孔膜并接触尼龙膜上的针叶树前子叶体细胞胚的液体发育培养基。发育培养基促进针叶树前子叶体细胞胚的发育，以形成子叶体细胞胚。

此外，作为实例，使用喷雾器使多孔膜接触液体发育培养基，其中喷雾器用发育培养基喷洒多孔膜。通常，体细胞胚位于膜的上表面，并用液体发育培养基喷洒其反面，即膜的下表面。作为另外的实例，可将支撑体细胞胚的多孔膜放在液体发育培养基上，其中培养基中包含可充分快速旋转以将发育培养基向上喷洒到多孔膜的下表面的旋转搅拌棒。

图1显示用发育培养基连续或间歇湿润多孔膜的代表性系统10，其中膜支持植物体细胞胚。系统10包括第一室12，其包括下表面14、上表面16、前端18、后端20、第一侧面22和第二侧面24。后端20限定了三个气孔26。通过从第一室12的下表面14分别垂直伸到底部平板30的四个支柱部分28，来支持第一室12。每个支柱部分28包括连接第一室12的下表面14的近端32，和撑在底部平板30上的远端34。围绕支柱部分28的纵向轴线旋转调节每个支柱部分28的远端34，以调节第一室12相对于底部平板30的高度。

上表面16、下表面14、前端18、后端20、第一侧面22以及第二侧面24一起构成第一室空腔36。第一室空腔36的内部配置是两个框架38，每个包括通过四个垂直取向的框架支柱42所支持的框架主干40。拉伸跨越每个框架38的是水平取向的多孔尼龙膜44。

系统10包括第二室12’，其包括与第一室12相同的组件。除了所用到的、与第二室12’有关的组件编号包含撇号(’)之外，第二室12’的组件具有在第一室12中相同的编号的对应组件。

因此，第二室12’包括下表面14’、上表面16’、前端18’、后端20’、第一侧面22’以及第二侧面24’。后端20’限定了三个气孔26’。通过从第一室12’的下表面14’分别垂直伸到底部平板30’的四个支柱部分28’，来支持第二室12’。每个支柱部分28’包括连接第二室12’的下表面14’的近端32’，和撑在底部平板30’上的远端34’。围绕支柱部分28’的纵向轴线旋转调节每个支柱部分28’的远端34’附近的，以调节第二室12’相对于底部平板30’的高度。

上表面16’、下表面14’、前端18’、后端20’、第一侧面22’以及第二侧面24’一起构成第一室空腔36’。第一室空腔36’的内部配置是两个框架38’，每个包括通过四个垂直取向的框架支柱42’所支持的框架主干40’。拉伸跨越每个框架38’的是水平取向的多孔尼龙膜44’。

系统10也包括发育培养基储存器46，其包括构成空腔50的储存器主体48。一些发育培养基52位于空腔50中。气孔54可穿透培养基储存器主体48。系统10也包括培养基输出管56，其包括在储存器空腔50中浸入发育培养基52中的近端58。输出管56连接受计时器61控制的泵60。计时器61是任意可编程的。

输出管56分叉形成输出管第一部分62和输出管第二部分64。输出管第一部分62连接穿过第一室12的下表面14并伸入第一室空腔36的发育培养基第一输出口66。输出管第二部分64连接穿过第二室12’的下表面14’并伸入第二室空腔36’的发育培养基第二输出口66’。

系统10还包括具有位于培养基储存器空腔50中的近端70的第一排水管68。第一排水管68分叉形成第一排水管第一部分72和第一排水管第二部分74。第一排水管第一部分72连接穿过第一室12的下表面14的培养基第一输出口76。第一排水管第二部分74连接穿过第二室12’的下表面14’的培养基第一输出口76’。

系统10还包括具有位于培养基储存器空腔50中的近端80的第二排水管78。第二排水管78分叉形成第二排水管第一部分82和第二排水管第二部分84。第二排水管第一部分82连接穿过(并齐平于)第一室12的下表面14的培养基第二输出口86。第二排水管第二部分84连接穿过(并齐平于)第二室12’的下表面14’的培养基第二输出口86’。

放置在尼龙膜44上显示的是发育中的松树体细胞胚88。

操作中，泵60驱使发育培养基52从储存器46穿过培养基输出管56，再分别经过输出管第一部分62和输出管第二部分64泵入第一室12和第二室12’。泵入的发育培养基52上升到培养基第一输出口76和76’的水平线，并从该处分别排入可指引发育培养基流回培养基储存器46的第一排水管第一部分72和第一排水管第二部分74。可连续或间歇操作泵60。在第一室12和第二室12’中的发育培养基52液面通常是足够高的，以使得发育培养基52接触尼龙膜44，从而湿润位于尼龙膜44上的各体细胞胚88的一部分。不应将体细胞胚88完全浸入发育培养基52中。储存器空腔50和50’中的湿气连续湿润体细胞胚88。

当关闭泵60时，发育培养基52通过培养基第二输出口86和86’从第一室12和第二室12’排出，并经过第二排出管78直接流回储存器46。

在第一室12和第二室12’中分别设定培养基第一输出口76和76’与第一室12和第二室12’中发育培养基52的期望水平线相对应的高度。通常培养基第一输出口76和76’的高度是分别相同于、或略大于第一室下表面14和第二室下表面14’与膜44和44’的距离。因此，当开动泵60时，至少部分发育体细胞胚88接触发育培养基52。泵60包含开动和关闭泵60的编程式计时器。

培养基第二输出口86和86’分别与第一室下表面14和第二室下表面14’一样高，使得当未开动泵60时，发育培养基52全部、或几乎全部从第一室12和第二室12’排出。

在一些实施方案中，本发明提供用于生产针叶树子叶体细胞胚的方法，其中每种方法包括步骤：(a)在诱导培养基中或上培养针叶树体细胞，来产生胚性细胞；(b)在维持培养基中或上培养步骤(a)中制备的胚性细胞，来生成针叶树前子叶体细胞胚；和(c)在至少是间歇接触液体发育培养基的多孔膜上，将步骤(b)中形成的针叶树前子叶体细胞胚培养足够的时间，来从前子叶体细胞胚制备针叶树子叶体细胞胚。针叶树体细胞和所得到的子叶体细胞胚是遗传上相同的。

因此，在一些实施方案中，在诱导培养基中或上培养针叶树体细胞，以产生胚性细胞。胚性细胞能生成一种或多种子叶针叶树体细胞胚。胚性细胞的实例是胚性胚柄团(ESM)。诱导培养基通常包括无机盐和有机营养物质。诱导培养基的摩尔渗透压浓度通常是约160mM/Kg或甚至更低，但其可高达170mM/Kg。诱导培养基通常包括生长激素。培养基中包含的激素实例是生长素(如，2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))和细胞激动素(如，6-苄基氨基嘌呤(BAP))。例如，以浓度1mg/L至200mg/L使用生长素。例如，以浓度0.1mg/L至10mg/L使用细胞激动素。

诱导培养基可含有吸附性组合物，特别是当使用很高浓度的生长激素时。吸附性组合物可以是以实施本发明中所用的浓度对胚性细胞是无毒的任何组合物，并能吸附存在于培养基中的促进生长的激素和在胚发育期间植物细胞所产生的有毒化合物。有用的吸附性组合物的非限制性实例包括活性碳、可溶性聚(乙烯吡咯烷酮)、不可溶性聚(乙烯吡咯烷酮)、活性氧化铝和硅胶。例如，吸附性组合物以约0.1g/L至约5g/L而大量存在。诱导培养基通常是固态，并可通过包含胶凝剂而凝固。

通常在诱导培养基中或上，以温度10℃至30℃，例如15℃至25℃、或例如20℃至23℃将针叶树体细胞培养3周至10周的时段，例如6周至8周。

维持培养基可以是固体培养基，或是可被搅拌以促进胚性组织的生长和增殖的液体培养基。维持培养基的摩尔渗透压浓度通常高于诱导培养基的摩尔渗透压浓度，通常介于120-180mM/Kg的范围。维持培养基可含有供养胚性组织的营养物质，并可以包含促进胚性组织的细胞分裂和生长的激素，例如一种或多种生长素和/或细胞激动素。通常，维持培养基中的激素浓度低于诱导培养基中的激素浓度。

尽管不必要，通常期望在维持培养基中包含作为唯一或主要代谢糖源的麦芽糖。有用的麦芽糖浓度实例是介于约1％至约3.0％范围之间。通常将针叶树胚性细胞每周一次转入新鲜的维持培养基中。

前文描述了有用的发育培养基。以连续性或周期性接触发育培养基进行培养之后，将子叶体细胞胚任选转入成熟培养基，然后转入成层培养基进行另外一段时间的培养。

例如，使用本发明的方法来制备具有一种或多种期望性状(例如快速生长率)的单个针叶树克隆。因此，在一个方面中，本发明提供用于生产遗传上相同的针叶树子叶体细胞的群体的方法。本发明的该方面的方法各自包括步骤：在可连续性或周期性接触发育培养基的多孔膜(如，多孔尼龙膜)上，将遗传上相同的针叶树前子叶体细胞胚培养一段充足时间，以从前子叶体细胞胚产生遗传上相同的针叶树子叶体细胞胚，其中发育培养基穿过多孔膜并接触体细胞胚。

如果需要，使用本发明的方法所生产的针叶树子叶体细胞胚可随意进行萌发，以生产可长成针叶树的针叶树植株。也可将子叶胚置于人工种子中以用于以后的萌发。例如，可在固态萌发培养基，如本文实施例1中描述的萌发培养基上萌发针叶树子叶体细胞胚。将萌芽的植株转移到土壤中以用于进一步生长。例如，将萌芽的植株种植在温室土壤中，并让其在转移到户外前进行生长。通常，对针叶树子叶体细胞胚进行光照以刺激萌发。通常，除了萌发，在暗处实施本发明方法的所有步骤。

在另一方面中，本发明提供用于培育植物体细胞胚的系统，其中各系统包括：(a)含有液体发育培养基的培养基储存器；(b)包含限定发育培养基输入口和发育培养基输出口的主体的培养室，其中发育培养基输出口连接培养基储存器；(c)在培养室中，位于膜支架上的多孔膜；和(d)连接培养基储存器和连接培养室的发育培养基输入口的泵，其中，泵在操作中可将发育培养基从储存器经过发育培养基输入口而泵入培养室，并且发育培养基从培养室经过发育培养基输出口排出，并返回发育培养基储存器。图1显示本发明的系统的实例。系统任选包括连接(如，电子连接)泵并且开动和关闭泵的计时器(如，编程式计时器)。

在本发明的系统中，发育培养基输出口位于相对于膜支架的位置，使得发育培养基不会完全覆盖位于多孔膜上发育中的植物体细胞胚(即，在培养基完全浸没位于多孔膜上的胚之前，发育培养基输出口允许发育培养基排出培养室)。

出于举例说明而不是限制本发明的目的，提供下列实施例。

实施例1

本实施例显示本发明用于从火炬松制备松树体细胞胚的代表性方法。

在受精后四到五周，从种子中除去含有合子胚的雌配子体。除去种皮，但不同于切开珠心端(nucellar end)，对胚不再剖开周围配子体。将松果在4℃保存直至使用。在除去未成熟胚之前，使用最初水洗和洗涤剂处理随即在15％H₂O₂中消毒十分钟，立即对种子消毒。每次处理后，用无菌蒸馏水彻底洗涤外植体。

表1和表2列出适用于制备松树体细胞胚的培养基的组成。

表1

     火炬松基本培养基(BM)  组分  浓度(mg/L)  NH₄NO₃  150.0  KNO₃  909.9  KH₂PO₄  136.1  Ca(NO₃)₂·4H₂O  236.2  CaCl₂·4H₂O  50.0  MgSO₄·7H₂O  246.5  Mg(NO₃)₂·6H₂O  256.5  MgCl₂·6H₂O  50.0  KI  4.15  H₃BO₃  15.5  MnSO₄·H₂O  10.5  ZnSO₄·7H₂O  14.4  NaMoO₄·2H₂O  0.125  CuSO₄·5H₂O  0.125  CoCl₂·6H₂O  0.125 FeSO₄·7H₂O  27.86 Na₂EDTA  37.86 麦芽糖  30,000 肌醇  200 酪蛋白氨基酸  500 L-谷氨酰胺  1000 盐酸硫胺素  1.00 盐酸吡哆醇  0.50 烟酸  0.50 甘氨酸  2.00 水晶洋菜⁺(Gelrite⁺)  1600 pH调至5.7

如果要求固体培养基时，则使用水晶洋菜⁺。

表2

             用于不同处理时期的培养基组成  BM₁-诱导培养基  BM+2，4-D(15μM)+激动素(kinetin)  (2μM)+BAP(2μM)。  BM₂-维持培养基  BM+2，4-D(5μM)+激动素(0.5μM)+BAP(0.5μM)。  当要求固体培养基时，添加水晶洋菜(1600  mg/L)。  BM₃-发育培养基  BM+25mg/L脱落酸+12％PEG-8000+800mg/L  附加肌醇+0.1％活性炭+1％葡萄糖+2.5％麦芽  糖。加入下列氨基酸混合物：L-脯氨酸  (100mg/L)、L-天冬酰氨(100mg/L)、L-精氨酸  (50mg/L)、L-丙氨酸(20mg/L)和L-丝氨酸  (20mg/L)。当要求固体培养基时，添加水晶洋菜  (2500mg/L)。  BM₅-成层培养基  省略脱落酸和PEG-8000而改良的BM₃。当要求  固体培养基时，添加水晶洋菜(2500mg/L)。  BM₆-萌发培养基     用2％蔗糖代替麦芽糖而改良的BM。肌醇降至  100.0mg/L，谷氨酰胺和脱落酸降至0.0mg/L。  FeSO₄·7H₂O降至13.9mg/L以及Na₂EDTA降至  18.6mg/L。琼脂加到0.8％和活性炭加到0.25％。

诱导：将具有完整胚的无菌配子体放置在固体BM₁培养基上，并在22-25℃的环境中以24小时暗周期维持3-5周的时间。时长取决于所培养的具体基因型。在该时段末期，形成与初始外植体相关的白色粘液块。显微镜检查通常显示许多与粘液块相关的早期胚。通常它们特征在于具有长的薄壁胚柄，并具有稠密的细胞质和大细胞核的顶部。

诱导培养基的摩尔渗透压浓度有时候可高达150mM/kg。通常浓度是约120mM/kg和更低(例如110mM/kg)。

维持和增殖：将从诱导期所产生的块取下的早期胚首先放在BM₂胶质的维持和增殖培养基上。该培养基不同于诱导培养基之处在于生长激素(生长素和细胞激动素)至少降低完整的数量级。该培养基的摩尔渗透压浓度是130mM/kg或更高(对于火炬松，通常在约120-150mM/kg的范围内)。将暗场温度再次调至22-25℃。在转入液体培养基进一步继代培养前，将胚在BM₂固体培养基上培养12-14天。液体培养基具有与BM₂相同的组成，但缺少胶凝剂。在固体培养末期，胚在外表上通常与诱导期的胚相似。在液体维持培养基继代培养5至6周后，形成早期高等胚。它们特征在于具有多胚柄的光滑胚顶部，估计通常具有超过100个单细胞。

胚发育：使用如图1所示的系统进行胚发育。

提高该发育培养基的渗透势以实质上超过维持培养基的渗透势。发现具有高达350mM/kg或甚至更高的摩尔渗透势是有利的。优选在完全黑暗中以温度22-25℃进行培育直至子叶胚已经发育。发育时间通常是几周，例如7至12周。

成层：分离子叶胚并转入成层培养基BM₅。该培养基与发育培养基相似，但缺少脱落酸、PEG-8000以及结冷胶(gellan gum)。黑暗中，将胚在成层培养基上于约1℃和约10℃之间培养三至六周。

调节水分：将留在尼龙膜支架上的成熟胚从垫上拔出，并在水分相对湿度97％的密闭容器中放置约三周的时段。

萌发：当留在尼龙膜支架时，通过将干的成熟胚在用萌发培养基饱和的垫上放置约24小时，使它们得以再水合。然后将胚单独放在固体BM₆培养基上进行萌发。该培养基是通过减少蔗糖、肌醇和有机氮所改良的、缺少生长激素的基本培养基。在23-25℃和16小时亮周期-8小时暗周期的环境条件下，将胚在BM₆培养基上培养约12周，直到得到的幼苗具有发育良好的胚根和下胚轴、绿色子叶结构以及上胚轴。

由于碳水化合物浓度的降低，可进一步降低萌发培养基的渗透势直至低于发育培养基的渗透势。通常它低于约150mM/kg(例如约100mM/kg)。

实施例2

该实施例显示火炬松体细胞胚可在置于吸收了液体发育培养基的纤维素垫上的多孔尼龙膜上发育。

胚的处理：将基因型A、B和C的火炬松分散在大烧瓶中。将0.75ml细胞施加到Whatman No.4滤纸或尼龙膜上(SeFar Co.，产品号0-100-44，孔径100μm)，再放置在Petir平板中双层吸附垫上。每个垫直径2”，并用约40ml发育培养基浸泡双层垫。

处理后，将所有平板于低温进行成层四周。然后在干滤纸上分离胚，并在大盒的水中悬浮三周，以使得调节胚。然后将胚在液体萌发培养基中吸收24小时，随后植入固体萌发培养基。七天黑暗处理后，将含有萌芽胚的萌发盒放到光处。

发育处理后生成的胚：在调节处理的开始时计数胚。对于每个基因型，计算所铺平板的每毫升细胞的胚数。对于滤纸上培育的胚(组合全部基因型)，胚数量是48±28。对于尼龙膜上培育的胚(组合全部基因型)，胚数量是55±14。

对于滤纸上培养的胚(组合全部基因型)，平均萌发率是30±5。对于尼龙膜上培养的胚(组合全部基因型)，平均萌发率是32±7。

因此，与使用尼龙膜相比，在使用滤纸进行发育或萌发后所得到的胚数量并没有统计上的显著差异。

实施例3

该实施例描述了在可间歇接触发育培养基的尼龙膜上培育火炬松体细胞胚的生物反应器的成功应用。

使用火炬松基因型A。每次处理将12ml铺在Cambro盒的一半面积。每平板有0.5ml细胞。

图1中所示的生物反应器系统用于实施本实施例中所述的实验。

使用四个发育处理：处理1具有10％C.C.(纤维素)垫和安置在垫上的尼龙膜(100μm孔径)；处理2具有10％C.C.(纤维素)垫和代替尼龙膜的滤纸(Whatman#4f.p.)；处理3具有安置在尼龙膜(没有垫子)顶层的滤纸；处理4只有尼龙膜(没有垫子、滤纸)。

将发育培养基泵入Cambro盒直到培养基接触尼龙膜。在停止泵送后，培养基开始排出15分钟。每24小时泵输送一次培养基。

8周后停止实验。每个处理产生胚。具体地说，在未受到纤维素垫支持的膜上可发育高品质(合子样)胚。

当举例说明和描述本发明的优选实施方案时，可以理解的是在不脱离本发明的内涵和外延的前提下，可对本发明进行各种变化。