罗布麻与大叶白麻的DNA分子鉴别方法

摘要

本发明公开了罗布麻与大叶白麻的DNA分子鉴别方法。该方法分别提取罗布麻与大叶白麻待测样品的基因组DNA，用提取的基因组DNA作为模板、利用特异性引物在两个不同退火温度的情况下进行两轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，根据两轮PCR产物的不同电泳行为进行罗布麻和大叶白麻的鉴别。该方法不受环境因素影响、与个体发育阶段无关、没有组织器官特异性、也不受实验时的人为影响，具有重现性好、稳定性高等优点。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及罗布麻与大叶白麻的DNA分子鉴别方法。

背景技术

罗布麻是夹竹桃科(Apocynaceae)罗布麻属(Apocynum)的一种多年生宿根草本植物，入药历史已逾千年，《中药大辞典》罗布麻内含类黄酮、强心甙、氨基酸等药物成分，对预防和缓解高血压、高血脂、冠心病、哮喘病、气管炎等症均有良好的作用；罗布麻叶片亦作茶用和烟用，据《中华人民共和国药典》及《本草纲目》记载，罗布麻茶有平肝安神、清热利水、止眩晕、消炎止咳、强心利尿等功能，罗布麻烟等可治疗高血压等症。然而同样俗称“罗布麻”而非药典收载的大叶白麻叶片也以同样药效和茶效等目的出现于市场，因此急需找到鉴别这两种植物的方法。

植物中草药及其伪品的鉴别方法较多，有从形态学进行鉴别，有从特有的物质进行鉴别，有从特定的化学反应进行鉴别，有利用指纹图谱进行鉴别等等，但这些鉴别方法均没有通过基因分析鉴别来得重复性高，不受环境与人为条件影响。前人已从罗布麻与大叶白麻叶片的形态、显微特征以及有效化学成份等方面做了一些鉴别研究，但形态解剖结果显示罗布麻和大叶白麻叶两面均可见栅栏组织，气孔以同样密度存在于两面，气孔微观性状十分相似，叶片质地均属草质；而且罗布麻叶片在药用和茶用时，还要经过进一步的加工处理，这更增加了形态鉴别的难度；前人也曾对两种“罗布麻”叶中的类黄酮物质种类和含量进行过比较研究，但发现它们所含主要化学成份大同小异，且化学成份与含量易受环境、个体发育阶段以及组织器官等的影响，准确鉴定也存在相当的难度，因此采用基因分析方法对罗布麻与大叶白麻进行鉴别是比较可行的方法。目前对于罗布麻与大叶白麻的基因分析鉴别方法尚没有文献报导。

测定并分析罗布麻和大叶白麻的trnL内含子和trnL-F间隔区的具体序列可见，它们共有三个位点的碱基发生稳定性变异[罗布麻的GenBank序列号为DQ463213(trnL内含子)和DQ463212(trnL-F间隔区)；大叶白麻的GenBank序列号为DQ463216(trnL内含子)和DQ463217(trnL-F间隔区)]，根据它们碱基位点的差异设计序列特异性引物以鉴别罗布麻和大叶白麻。

发明内容

本发明的目的是提供一种罗布麻与大叶白麻的DNA分子鉴别方法。

本发明的目的是通过下列措施实现的：

罗布麻与大叶白麻的DNA分子鉴别方法，该方法通过分别提取罗布麻与大叶白麻待测样品的基因组DNA，用提取的基因组DNA作为模板、利用特异性引物在两个不同退火温度的情况下进行两轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，根据两轮PCR产物的不同电泳行为进行罗布麻和大叶白麻的鉴别。

所述的方法，其中特异性引物中上游引物是SEQ ID No.1，下游引物是SEQ ID No.2。

所述的方法中针对同一样本进行两轮PCR反应，两轮PCR反应仅在退火温度存在不同，分别为50～62℃和62.7℃，其余步骤相同。

所述的方法，其中根据两轮PCR产物的不同电泳行为对罗布麻和大叶白麻进行鉴别的判断标准是第二轮PCR产物用常规琼脂糖凝胶电泳，若电泳图谱中没有任何条带，则所测样品为罗布麻，若在220bp处有清晰单条带，则所测样品为大叶白麻。

所述的方法的具体步骤如下：

a.分别提取待测样品的基因组DNA；

b.利用引物SEQ ID No.1与引物SEQ ID No.2对提取的基因组DNA首先进行第一轮PCR扩增反应，具体程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，50～62℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸7min；PCR产物用常规琼脂糖凝胶电泳，若电泳图谱中没有任何条带，则显示所测样品不是罗布麻或大叶白麻；如果在220bp处有清晰单条带，则所测样品为罗布麻或大叶白麻；

c.若所测样本已经确定为罗布麻或白麻，而非其他植物，进一步利用引物SEQ IDNo.1与引物SEQ ID No.2对提取的基因组DNA继续进行第二轮PCR反应，具体程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，62.7℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸7min；PCR产物用常规琼脂糖凝胶电泳，若电泳图谱中没有任何条带，则所测样品为罗布麻，若在220bp处有清晰单条带，则所测样品为大叶白麻。

上述的方法中提取待测样品的基因组DNA的方法为：

称取待测样品干燥叶片15mg或新鲜叶片100mg于研钵中，加液氮充分研磨；在液氮未挥发干前连同液氮将材料转移至50mL离心管中，待液氮挥发后，加入0.5～1mL裂解液，该裂解液主要成分为浓度按重量体积百分比(mg/mL，下同)计均为2％的CTAB和SDS，同时还含有1.4mol/L NaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、pH 8.00.1mol/LTrisHCl，裂解时裂解液中还要加入DTT至终浓度为40mg/mL、10mg/mL RNaseA4～6μL、木瓜蛋白酶至终浓度40～60mg/mL，35～45℃条件下振荡温浴12～24h；

将溶液转入dolph管中，加入0.6～1mL体积比为25∶24∶1的酚-氯酚-异戊醇混合溶液，抽提5～10min后，7000g离心5min；上清再次用体积比为25∶1的氯仿-异戊醇混合溶液多次抽提直至两相界面没有白色物质为止，取上清；

向上清中加入上清体积1/10的1～3mol/L醋酸钠以去除多糖，再在此基础上加入4℃预冷的无水乙醇使乙醇终浓度达70％，或加入异丙醇使异丙醇终浓度达50％，-20℃冰箱中2～12h；15000g离心1min所得沉淀即为基因组DNA，加50～100L的TE溶解备用。

本发明的有益效果：

本技术通过提取检测样本的基因组DNA，并应用特异性引物通过两轮PCR，通过两轮PCR产物的电泳行为，鉴别罗布麻与大叶白麻。该方法不受环境因素影响、与个体发育阶段无关、没有组织器官特异性、也不受实验时的人为影响，具有重现性好、稳定性高等优点。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

以下实施例中提取样品基因组DNA的方法是：

称取样品干燥叶片15mg或新鲜叶片100mg于研钵中，加液氮充分研磨；在液氮未挥发干前连同液氮将材料转移至50mL离心管中，待液氮挥发后，加入0.5～1mL裂解液，该裂解液主要成分为浓度均为2％的CTAB和SDS，同时还含有1.4mol/L NaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、pH 8.00.1mol/L Tris HCl，裂解时裂解液中还要加入DTT至终浓度为40mg/mL、10mg/mL RNaseA 4～6μL、木瓜蛋白酶至终浓度40～60mg/mL，35～45℃条件下振荡温浴12～24h；

将溶液转入dolph管中，加入0.6～1mL体积比为25∶24∶1的酚-氯酚-异戊醇混合溶液，抽提5～10min后，7000g离心5min；上清再次用体积比为25∶1的氯仿-异戊醇混合溶液多次抽提直至两相界面没有白色物质为止，取上清；

向上清中加入上清体积1/10的1～3mol/L醋酸钠以去除多糖，再在此基础上加入4℃预冷的无水乙醇使乙醇终浓度达70％，或加入异丙醇使异丙醇终浓度达50％，-20℃冰箱中2～12h；15000g离心1min，所得沉淀即为基因组DNA，加50～100L的TE溶解备用。

实施例1

来源于新疆、内蒙、河南、吉林等12省的罗布麻样品47份和来源于新疆、甘肃、青海等三省的大叶白麻样本17份(均通过专家鉴定)，首先通过提取基因组DNA后；利用引物SEQ ID No.1与引物SEQ ID No.2对提取的基因组DNA进行PCR扩增反应，具体程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，50～62℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸7min。PCR产物用常规琼脂糖凝胶电泳检测，发现所有样品均在220bp处有清晰单条带。

进一步利用引物SEQ ID No.1与引物SEQ ID No.2对提取的基因组DNA继续进行第二轮PCR反应，具体程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，62.7℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸7min。PCR产物经常规琼脂糖凝胶电泳检测，发现所有大叶白麻样本的电泳图谱中在220bp处均有清晰单条带，而在所有罗布麻样本的电泳图谱中均没有清晰条带。

实施例2

分别从市场上购得两种罗布麻茶以及两份罗布麻干燥叶片共4份样品。分别提取各样品的基因组DNA。首先利用特异性引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行第一轮PCR扩增反应，具体反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，50～62℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸7min。PCR反应结束后，常规琼脂糖电泳检测，发现电泳图谱中在220bp处均有清晰单条带。显示待检测的4个样品都是罗布麻或大叶白麻，而非其他种属植物。

进步利用引物SEQ ID No.1与引物SEQ ID No.2对提取的基因组DNA继续进行第二轮PCR反应，具体程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，62.7℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸7min。PCR产物经常规琼脂糖凝胶电泳检测，发现其中两个罗布麻干燥叶片样品和一种罗布麻茶样品在220bp处有清晰的单条带，另一个罗布麻样品茶在电泳图谱中没有发现条带。说明市售的两个罗布麻样本以及一个罗布麻茶样本的基源植物是大叶白麻，而非罗布麻。

                        序列表

<110>南京师范大学生命科学学院

<120>罗布麻与大叶白麻的DNA分子鉴别方法

<160>2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物

<400>1

actccatagt ctgttgatgc 20

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物

<400>2

gggcgagtgt ataaggac 18