应用于猪链球菌2型毒力因子MRP检测的荧光PCR引物和探针序列

摘要

本发明涉及针对猪链球菌2型毒力因子一溶菌酶释放蛋白(MRP)编码基因设计的用于猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)荧光PCR检测的引物和探针序列。本发明针对MRP基因设计引物进行PCR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，通过对反应的退火温度和镁离子浓度进行优化，建立了猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)多重实时荧光PCR的检测方法。

说明书

技术领域：

本发明涉及针对猪链球菌2型的毒力因子-溶菌酶释放蛋白(MRP)基因设计的用于荧光PCR检测用的引物和探针序列。

背景技术

猪链球菌病(Swine Streptococcosis)是由猪链球菌(Streptococcus suis)侵害猪的上呼吸道、生殖道、消化道等组织而引起的一种疾病，可引起猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突发性死亡。同时，本病也是一种严重的人兽共患传染病，可引起相关从业人员脑膜炎并致死，对公共卫生尤其是相关从业人员的生命构成威胁，所以引起世界范围内的高度重视。国内外均有2型猪链球菌引起人、猪死亡的报道。1968年丹麦首次报道了人体感染猪链球菌导致脑膜炎的病例。目前全球已有200余例猪链球菌感染病例报告。1990年我国广东省首次分离到猪链球菌2型(黄毓茂等，1991)。1998-1999年，江苏省部分地区发生人—猪链球菌感染，导致25人发病，死亡14人。

2005年7月，我国四川省资阳市部分地区再次发生猪链球菌2型的人类感染。截至8月6日，全国有四川、重庆、广东、香港、江西、江苏等省市和地区发生人感染猪链球菌病事件，导致43人死亡。仅四川省就累计报告病例214例，其中实验室确诊43例，疫情涉及到11个市，34个县。常规的猪链球菌血清学检测方法不但费时，而且只能鉴定到血清型。而根据国内外研究报道，猪链球菌2型不同株之间的致病力差别很大，可分为强致病株、弱致病株和非致病株。非致病的猪链球菌2型在健康猪扁桃体的带菌率还可高达76％(143/188)(Davies，1991)。故在疫情发生时，只确定病原是猪链球菌2型还远不够，还必须弄清其致病性，以利于有针对性地采取应对措施，防止疫情的蔓延。

研究表明，猪链球菌2型的致病性与溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素、荚膜多糖以及44kDa蛋白、IgG结合蛋白、纤毛粘着素等毒力因子有关。其中，溶菌酶释放蛋白(MRP)是猪链球菌2型的主要致病因子，国内外发生的危害人和猪健康的猪链球菌病的病原均是表达MRP蛋白的2型猪链球菌，这包括1998年发生在我国江苏省部分地区和今年在四川资阳市发生的严重的人—猪链球菌2型感染。

采用常规的PCR检测方法，可以对病原菌的MRP基因进行扩增以确定分离菌株的致病性。荧光PCR技术是一种新型扩增待检基因的方法，采用“闭管”操作，灵敏度比常规PCR高出100倍以上，而且整个过程只需要0.5-2h，还可避免常规PCR操作时EB染色的危害及PCR后处理可能带来的假阳性，是目前为广大科研工作者所青睐的一种病原的快速鉴定方法。

本发明选择MRP设计引物进行PCR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，采用荧光PCR仪，反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因，从而确定待检菌是否为猪链球菌2型致病株。本方法的建立，为疫情发生后，有针对性地采取紧急防控措施、减少国际贸易摩擦，从而严把进出口关奠定基础。

发明内容：

本发明目的在于提供用于猪链球菌2型毒力因子MRP检测用的荧光PCR引物和探针序列。

本发明的目的通过下述技术方案实现：在分析已报道猪链球菌2型的毒力因子MRP基因序列(GenBankNo.X64450)的基础上、采用探针设计软件Beacon Designer2.1设计PCR引物和荧光探针。在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，二者构成能量转移结构。当探针完整时，报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，在荧光PCR反应的退火过程中，探针优先结合到DNA模板上，当引物延伸到探针结合位置时，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对猪链球菌2型的MRP毒力因子基因的检测。

一个方面，本发明提供了用于猪链球菌2型毒力因子—溶菌酶释放蛋白(MRP)检测的实时荧光PCR的引物对及探针。其中所述的特异性地针对MRP编码基因的引物对和探针的核苷酸序列为：

MRP正向引物序列为AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC，正向引物的反向互补序列为GGTAAGGTACTTTTGGACGGTCT；MRP反向引物序列为CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG，反向引物的反向互补序列为CCAACGACACCAGGAACAAATG；以及该引物对的上游引物向5’延伸10个碱基、下游引物向3’延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物序列及互补序列；MRP探针序列为TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC，探针的反向互补序列为GGCTCGTCTGGCTCTGTTGGGTCA，以及该探针向5’延伸10个碱基、向3’延伸10个碱基区域内得到的探针序列及互补序列。

MRP的PCR引物和探针设计完成后，采用在线BLAST分析其序列特异性。结果表明MRP引物和探针设计区域为猪链球菌2型MRP毒力因子所特有，没有发现同源或序列一致性生物基因信息，可以保证扩增产物的特异性。

所述探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。可用于本发明的报告荧光染料包括但不限于，例如，FAM、JOE和HEX。可用于本发明的报告荧光染料包括但不限于，例如，Eclipse和TAMRA。

在本发明的一个优选实施方案中，引物扩增产物长度为80bp，探针设计于待扩增序列间的高GC含量区，5’端标记报告荧光染料为JOE，3’端标记淬灭荧光染料为Eclipse。

本发明通过下述操作建立了猪链球菌2型毒力因子MRP荧光PCR检测方法：根据猪链球菌2型毒力因子MRP编码基因的公开序列设计引物对和探针，采用软件分析所设计引物对和探针的特异性，引物对和探针合成后分别进行稀释并确定反应需要量，通过调整反应体系中的镁离子浓度和对退火温度进行优化，以培养菌液或者带菌组织DNA为检测样本，确定荧光PCR检测培养菌液或者带菌组织中MRP毒力因子最佳反应体系和反应条件，采用倍比稀释的猪链球菌2型培养菌液及带菌组织DNA作为模板进行敏感性试验，采用其它的猪体致病菌为对照进行特异性试验，以确保所建立检测方法的实际应用效果。

另一方面，本发明提供了一种用于检测猪链球菌2型毒力因子MRP基因的实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤：

1)使用本发明所述的特异性地针对MRP引物对及荧光素标记探针，与PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液及聚合酶混合，得到检测预混液；

2)向上述检测预混液中加入待检菌液或以待检组织提取的基因组DNA作为模板；

3)将步骤2)中建立的扩增反应体系置于荧光PCR仪上；

4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，按照本发明确立的反应条件进行荧光PCR扩增，反应结束后读取并记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；

5)根据各样本的反应Ct值，按照建立的判定标准判定待检样本中猪链球菌2型是否含有待检测的MRP基因。

本发明所述方法可以直接对培养菌液进行检测，也可以对组织中携带的猪链球菌2型实施检测。在采用培养菌液作为检测材料时，菌体分离及培养须在P3实验室、按照CDC(中国疾病预防控制中心)推荐的猪链球菌分离培养程序进行。即采用扁桃体拭子采取待检猪的病料，实验室内，分别接种绵羊鲜血琼脂平板。37℃培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，再接种血清肉汤，37℃摇床培养后，灭活备用。在对带菌的组织，如猪扁桃体、肌肉等进行检测时，须首先采用商品化的基因组提取试剂盒提取其基因组DNA作为荧光PCR检测用模板。

在利用本发明所述方法对待检样本实施检测时，可直接取一定量的本发明所述检测试剂，按照确立的反应体系和条件进行检测并判定结果。

在本发明中，荧光PCR扩增时优选使用的Mg²⁺浓度为5mMol/l。

一个优选实施方案中，所述荧光PCR扩增扩增条件为：94℃5s；55℃10s，40个循环。

在本发明中，所述的猪链球菌2型毒力因子MRP基因是否存在的判定标准为：如果待检测基因的反应曲线呈对数增长而且Ct＜30，判定为阳性；30＜Ct＜40，判定为可疑，可加大模板量重复扩增，如果得到相同的试验结果，则判为阳性，否则为阴性；如果反应曲线Ct＞40或者为一条直线，则为阴性。

附图说明

图1.猪链球菌2型MRP基因的荧光PCR检测体系最佳Mg²⁺浓度的确定(单位：mMol/l)。其中，曲线1-7依次分别代表体系中含有的Mg²⁺浓度为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0mmol/l，曲线8为阴性对照。

图2.检测猪链球菌2型菌株MRP基因的荧光PCR反应最佳退火温度的确定。图中各曲线代表的不同的退火温度，其中曲线1-8依次分别为采用46℃、47℃、48℃、50℃、52℃、54℃、55℃和56℃作为退火温度时的反应曲线。

图3.荧光PCR检测培养菌液中猪链球菌2型MRP基因的特异性试验结果

图4.荧光PCR检测组织中猪链球菌2型MRP基因的特异性试验结果

图5.荧光PCR检测培养菌液中的猪链球菌2型MRP基因的敏感性试验结果。其中，曲线1-8依次分别为PCR扩增时作为模板的菌落数(CFU)为5000、1000、500、100、50、20、10和5时的扩增曲线，曲线9为阴性对照。

图6.荧光PCR检测组织样品中猪链球菌2型MRP基因的敏感性试验结果。其中，曲线1表示荧光PCR反应体系中对应的组织中菌落数(CFU)为1×10⁴、曲线2代表菌落数为5×10³、曲线3代表PCR扩增时掺入组织中的菌落数(CFU)为1×10³、曲线4代表菌落数为500、曲线5代表菌落数为100、曲线6代表菌落数为50、曲线7为阴性对照。

图7图示的是用本发明所述的猪链球菌2型MRP基因荧光PCR检测方法对所采集扁桃体样本进行检测的结果。

本发明的优点：

本发明的试剂及检测方法充分利用了PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否含有MRP基因。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

                                实施例

                       实施例1引物和探针的制备

1.1引物和探针的设计和合成

根据猪链球菌2型的毒力因子MRP编码基因的公开序列(GenBank No.X64450)，采用探针设计软件Beacon Designer 2.1设计PCR引物对，引物对的序列为：正向引物P1：5’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC-3’；反向引物P2：5’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG-3’。针对待扩增序列间的高GC含量区设计MRP探针，探针序列为5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC-3’，并且在探针5’端标记报告荧光染料JOE，3’端标记淬灭荧光染料Eclipse。合成的引物对及荧光标记探针用于下面的试验。

      实施例2猪链球菌2型荧光PCR检测体系及检测条件的建立和优化

2.1猪链球菌2型荧光PCR检测体系的建立和优化

由于镁离子是影响反应特异性和扩增效率的主要因素，本实施例着重对反应体系中Mg²⁺浓度进行了优化，在反应体系中其它成分不变的条件下，采用的Mg²⁺浓度梯度见下表1：

                 表1.猪链球菌2型荧光PCR检测体系中Mg²⁺的梯度

  管号  1  2  3  4  5  6  7  [Mg²⁺]   (mMol/l)   3   3.5   4   4.5   5   5.5   6

采用的反应体系为：10×PCR缓冲液(Mg²⁺Free)2.5μl，25mM MgCl₂ 1-7μl，2.5mMdNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探针0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μl。

结果见图1。自图1可以看出，Mg²⁺浓度对PCR反应有明显的影响，Mg²⁺浓度越低，反应的特异性越强，但是扩增效率则明显下降；反之，Mg²⁺浓度升高，虽然扩增效率有所提高，但是特异性却受到影响。本研究选择Mg²⁺浓度5mMol/l作为实际采用的Mg²⁺浓度，目的是兼顾反应的特异性和扩增效率。

2.2荧光PCR反应条件的优化

为了提高检测的特异性和敏感性，参照引物设计软件推荐的退火温度(50℃)，本研究设置如下退火温度梯度进行PCR。

表2.猪链球菌2型荧光PCR检测条件中的最佳退火温度的选择

  管号  1  2  3  4  5  6  7  8  采用温度℃  46  47  48  50  52  54  55  56

采用的反应体系如下：

10×PCR缓冲液(Mg²⁺Free)2.5μl，25mM MgCl₂ 5.0μl，2.5mM dNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探针0.5μl，5U/μlrTaq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μl。

将样品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃，5s；(46-56)℃，10s，45个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线确定最佳退火温度。

将样品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃，5s；55℃，10s；45个循环。每个循环结束后采集数据。

结果见图2。自图2可以看出，退火温度对PCR反应有一定的影响，温度越高，反应的特异性越强，但是扩增效率则明显下降；反之，退火温度降低，虽然扩增效率有所提高，但是特异性却受到影响。本研究选择50℃作为实际采用的退火温度，目的是兼顾反应的特异性和扩增效率。

                             实施例3待检测样品制备

3.1菌体分离及培养

在P3实验室，按照CDC(中国疾病预防控制中心)推荐的猪链球菌分离培养程序进行。采用扁桃体拭子采取待检猪的病料，带回实验室后，分别接种绵羊鲜血琼脂平板。37℃培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，再接种血清肉汤，37℃摇床培养后，革兰氏染色、显微镜检查后，加热灭活备用。

3.2组织基因组DNA的提取

无菌采取待检猪及健康猪的扁桃体、肌肉等组织，实验室内，采用QIAGEN基因组提取试剂盒(DNeasy)，按DNeasy Tissue Handbook改进后分别提取其基因组DNA，具体步骤如下：

A.在无菌环境下(最好是在实验室生物安全柜中或超净工作台上进行操作)，将采集的组织样本(如淋巴结、扁桃体、肌肉等)除去包膜和其它结缔组织，选取内部实质部分，置玻璃匀浆器内充分磨成糊状后备用。

B.将研成糊状的20mg的动物组织放入离心管中，加180μl的buffer ATL。

C.加入20μl的蛋白酶K，利用旋涡混合器混匀，55℃孵育直至组织完全消化(为保证试验结果，消化时间应保持在1小时以上，如时间允许，过夜消化)，在消化的过程中需每隔一段时间振荡混合一次。

D.旋涡15s，在样品中加入200μl的buffer AL，旋涡混匀，70℃孵育30min。

E.在样品中加入200μl的无水乙醇，旋涡混匀。

F.将试剂盒中的DNeasy Mini Spin Column安置于2ml的收集管上，将上述操作E中的溶液转移至DNeasy Mini Spin Column中，≥6000g(8000rpm)离心1min，弃去滤液和收集管。

G.将DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW1，≥6000g(8000rpm)离心1min，弃去滤液和收集管。

H.将DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW2，≥20000g(14000rpm)离心3min使DNeasy膜完全干燥，弃去滤液和收集管。

I.将DNeasy Mini Spin Column安置于新的1.5ml的收集管上，将100μl buffer AE直接加至DNeasy膜上，室温孵育1min，≥6000g(8000rpm)离心1min洗脱DNA。

                实施例4荧光PCR检测猪链球菌2型MRP基因的特异性确定

4.1荧光PCR检测培养菌液中猪链球菌2型MRP基因的特异性试验

以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行荧光PCR扩增，根据扩增产物的有无判定本方法检测猪链球菌2型感染的特异性。

结果见图3。从图3可以看出，以马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株作为阴性对照，以猪链球菌2型四川株作为阳性对照，按照本研究建立的方法进行猪链球菌2型MRP毒力因子的荧光PCR扩增，结果表明，只有阳性对照有明显的扩增曲线，而其它几个对照菌株均没有扩增；

4.2荧光PCR检测组织中猪链球菌2型MRP基因的特异性试验

采用正常组织基因组DNA作为空白对照，以在扁桃体组织中定量加入马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌和大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等菌株后提取的DNA作为阴性对照，以加入猪链球菌2型四川株的扁桃体组织DNA作为阳性对照，进行荧光PCR，以检验本研究所建立方法的特异性。

结果见图4。采用正常组织基因组DNA作为空白对照，以在扁桃体组织中定量掺入对照菌株后提取的DNA作为阴性对照，以掺入猪链球菌2型四川株的扁桃体组织DNA作为阳性对照，进行荧光PCR结果表明，只有阳性对照有明显的扩增曲线，而其它几个对照菌株和阴性对照均没有扩增说明本研究所建立方法具有高度的特异性，适合应用于猪链球菌2型MRP毒力因子的检测。

            实施例5荧光PCR检测猪链球菌2型MRP基因的敏感性试验

5.1荧光PCR检测培养菌液中猪链球菌2型MRP基因的敏感性试验

以猪链球菌2型四川株培养菌液作为待检菌液，记数后，采用血清肉汤培养液进行梯度稀释，见表3。

表3.用于验证猪链球菌2型MRP基因荧光PCR检测方法的敏感性的培养菌液浓度(CFU/μl)

  管号  1  2  3  4  5  6  7  8  9  菌数(CFU/μl)  5000  1000  500  100  50  20  10  5  0

在确定的荧光PCR反应体系中加入1μl梯度稀释的菌液作为模板进行PCR扩增，扩增完成后，以Ct＝40作为检测低限，确定本方法可以检测的最少菌数。结果见图5。自图5中可以看出，第7管的Ct值为38.1，低于预设的Ct＝40的检测限，按照取样1μl计算，即采用本研究所建立的荧光PCR方法单独检测MRP基因的敏感性为10CFU。

5.2荧光PCR检测组织中猪链球菌2型MRP基因的敏感性试验

按照试剂盒组织用量说明，称取10mg扁桃体组织，在其中加入按照表4梯度稀释的猪链球菌2型培养菌液，按照DNA提取试剂盒操作提取其中的基因组DNA，并取1μl作为模板，按照实施实例1的反应体系和程序进行荧光PCR，PCR同时设置阴性对照。扩增后，分析Ct值，以Ct＝40作为检测低限，确定本方法可以检测的组织中猪链球菌2型菌株的最低数量。结果见图6。

表4.荧光PCR检测猪链球菌2型感染的敏感性实验的组织中对应菌数(CFU/μl DNA提取液)

  管号  1  2  3  4  5  6  加入菌数  CFU/μl  1×10⁶  1×10⁴  5×10⁵  5×10³  1×10⁵  1×10³  5×10⁴  500  1×10⁴  100  5×10³  50

自图6中可以看出，MRP单独可以检测组织中量为1×10⁵CFU/10mg组织，按照取样1μl计算，即采用本研究所建立的荧光PCR方法单独检测组织中的MRP基因的敏感性为100CFU。

                                实施例6

北京市某屠宰场扁桃体样品85份，按照实施例1中所述方法提取组织基因组DNA后用ddH₂O溶解。在各检测管内加入10×PCR缓冲液(Mg²⁺ Free)2.5μl，25mM MgCl₂ 5.0μl，2.5mM dNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探针0.5μl，5U/μlrTaq DNA聚合酶0.25μl，加入1μl上述提取的待检DNA，然后用ddH₂O补充反应体系至25μl。反应同时设置掺入猪链球菌2型(四川株)菌液的扁桃体提取的DNA 1μl作为模板进行的阳性对照和以ddH₂O作为阴性对照。

将样品管放入荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性3min；然后采用二步法进行反应：94℃5s；55℃10s，40个循环。每个循环结束后采集荧光信号，反应结束后仪器自动给出Ct值。分析Ct值发现，阳性样本的MRP扩增曲线的Ct值为21.5(图7)，阴性对照没有扩增曲线，表明试验成立；各样本均没有明显扩增曲线，表明各样本均没有检出猪链球菌2型毒力因子MRP，即所采集的所有扁桃体均不携带有致病性猪链球菌2型菌。