一种嗜热耐高温的甘油酸激酶及其制备方法与应用

摘要

一种嗜热耐高温的甘油酸激酶及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。该酶的最适酶活温度为45℃，具有较为宽的酶适应温度，在20－50℃具有很高的酶活；该酶的最适酶活pH为2.5，在酸性条件下具有很高的酶活。该酶能够利用ATP，GTP，CTP，UTP及ADP作为磷酸供体。该酶的制备方法，包括质粒、菌株与培养基的选择，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。该酶具有极高的热稳定性，可用于医药、生物工程领域2－磷酸甘油酸的制备。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种新的嗜热及耐高温的甘油酸激酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。

(二)背景技术

根据生物对周围生存环境温度的适应性，可将生物分为嗜冷生物(＜15℃)，嗜温生物(15-60℃)，嗜热生物(60-80℃)，极端嗜热生物(80-110℃)。大部分生物体内的蛋白质的最适活性温度一般为或者接近于该生物的最适生长温度(optimum growthtemperature，OGT)。因此，根据蛋白质对于温度的依赖性可将其分为嗜冷蛋白、嗜温蛋白、嗜热蛋白、极端嗜热蛋白。由于大部分嗜热与极端嗜热蛋白为一些酶类(如糖苷水解酶，DNA聚合酶等)，它们在高温环境中能消除底物污染等因素带来的负面效果，而且往往使反应的催化速率和效率大大提高，因此极端嗜热酶的开发及利用是当前生物技术的一个前沿领域。迄今已有75种极端酶已经投入工业应用，每年产生的经济效益达4-5亿美元，较为典型的如TagDNA聚合酶、嗜热木聚糖酶等等。

2-磷酸甘油酸(2-phospho-D-glycerate，2-PGA)是一种珍贵的有机化合物，它可以作为许多酶促化学反应如磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)、烯醇化酶(enolase)等的底物。2-PGA还可以作为某些细菌的转运分子或能量来源。另外，2-PGA因具有刺激蛋白质磷酸化的功能而有望应用于胰岛素分泌过程。最后，2-PGA还可用于其他糖酵解酶类的晶体化研究中。目前，2-PGA主要由三种途径获得：1.有机合成；2.经磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)催化由3-磷酸甘油酸(3-PGA)转化而来；3.经烯醇化酶(enolase)催化由磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)转化而来。但是，该化合物的有机合成过程具有费时、工序多等缺点，而由酶促转化则面临2-PGA与3-PGA的分离纯化及其他较为难以获得的酶(如磷酸甘油酸变位酶，烯醇化酶)和底物(如3-磷酸甘油酸，磷酸烯醇式丙酮酸)等问题。

掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)生存于冲绳岛附近海底约1395米火山口，发现并报道于1998年。其最适生长温度为摄氏95～105℃，分类上属广古菌。许多嗜热酶类陆续在该菌中被发现，如纤维素酶，DNA聚合酶，几丁二糖脱乙酰酶，外切氨基葡萄糖甘酶等。这些嗜热与热稳定极端酶在工业，食品，纺织及生物工程等领域已经被广泛使用或具有广泛的应用前景。

(三)发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种新颖的嗜热、耐高温的甘油酸激酶(产物为2-磷酸甘油酸)(2-phosphoglycerate forming glycerate kinase)及其制备方法。

本发明还提供了嗜热、耐高温的甘油酸激酶的酶学性质与应用。

1、一种嗜热耐高温的甘油酸激酶，具有DNA序列如下(ORF：PH0495，基因序列号：BAA29583)：

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2、一种嗜热耐高温的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)，具有氨基酸序列如下：

MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA

    5    10    15    20    25    30    35    40    45    50    55    60

CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR

   65    70    75    80    85    90    95   100   105   110   115   120

ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK

  125   130   135   140   145   150   155   160   165   170   175   180

LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH

  185   190   195   200   205   210   215   220   225   230   235   240

IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA

  245   250   255   260   265   270   275   280   285   290   295   300

GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA

  305   310   315   320   325   330   335   340   345   350   355   360

LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP

  365   370   375   380   385   390   395   400   405   410   415   420

TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT

  425   430   435   440。

3、嗜热耐高温的甘油酸激酶的制备方法

嗜热耐高温的甘油酸激酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下：

(1)菌株、质粒、酶与培养基：

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、限制性内切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接kit ver.2.1购自TakaRa公司；克隆与表达质粒载体pET15b、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-codonPlus(DE3)-RIL购自Novagen公司；LB培养基：每升含Tryptone 10g，Yeastextract 5g，NaCl 10g；氨苄青霉素浓度为100mg/L，氯霉素浓度为34mg/L。

(2)PCR扩增及重组质粒的构建：

设计一对引物，以Pyrococcus horikoshii(掘越氏热球菌)全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。

上述引物优选如下：

上游[5′-attcgctgattcatatgattgccatggatattagggag-3′]，

下游[5′-gtgaacagtcgacttaagtacggcctcgtttcgatgtgac-3′]，

其中，划线部分为上游引物Nde I酶切位点及下游引物Sal I酶切位点。

酶切用内切酶选用Nde I和Sal I两种。

(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将重组质粒转化E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入0.5-1mol/L IPTG于37℃继续培养3-5h，诱导表达的蛋白经过热处理，亲和层析，阴离子交换层析得到纯化的酶蛋白。

优选的，所述亲和层析为镍柱亲和层析。

4、甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)的酶学性质分析鉴定

酶反应方程式为：

酶反应体系为：100ul反应体系中D-甘油酸(Sigma公司产)1mM；纯化的酶蛋白500ng；ATP(BBI公司产)1mM；MgCl₂ 10mM；50mM磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲液(pH 7)。反应温度为40℃，反应时间为10min。

在上述反应体系中加入3U烯醇化酶、5U乳酸脱氢酶、3.5U丙酮酸激酶(Sigma公司产品)，3mM NADH(Sigma公司产品)，于40℃反应10min。

通过对甘油酸激酶进行分析鉴定，得到该酶的主要以下酶学性质：

(1)得到编码甘油酸激酶的基因序列(ORF：PHO495，基因序列号：BAA29583)：基因序列如上所述。

(2)得到编码甘油酸激酶的氨基酸序列：氨基酸序列如上所述。

(3)得到的纯化的甘油酸激酶蛋白电泳图如图1所示。

(4)该酶能够催化D-甘油酸生成2-磷酸甘油酸(在2-磷酸甘油酸存在的情况下，反应体系中加入烯醇化酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶可催化NADH生成NAD⁺，使反应溶液在340nm的光吸收值下降)，因此鉴定为一种甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)。

(5)该酶具有较为宽的酶适应温度，在20-50℃具有很高的酶活，在100℃时的酶活能达最大酶活的50％左右，该酶的最适酶活温度为45℃(见图2)。

(6)该酶是一种嗜酸性酶，在酸性条件下具有很高的酶活，最适酶活pH为2.5(见图3)。

(7)该酶除能够利用ATP作为磷酸供体外，还能利用GTP，CTP，UTP及ADP作为磷酸供体。与ATP作为磷酸供体(100％)相比，酶活分别为GTP(64％)，CTP(73％)，UTP(29％)ADP(32％)。

(8)单价金属离子KCl，NaCl，NH₄Cl and LiCl(50mM)能明显的促进该酶的酶活，与未加金属离子(100％)相比，酶活分别为KCl(795％)，NaCl(349％)，NH₄Cl(783％)，LiCl(228％)。

(9)该酶具有极高的热稳定性，分别在70℃，80℃，90℃热处理12个小时后，酶活力能保持起始酶活的95％以上。

(10)该酶的在实验条件下的比活力为50-100U/mg。

5、甘油酸激酶的应用

本发明的甘油酸激酶的酶可用于医药、生物工程领域2-磷酸甘油酸的制备。

(1)利用本发明的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)，可以用D-甘油酸来生产2-磷酸甘油酸，由于该酶所具有的独特的嗜热及热稳定性，可以提高反应速率并消除反应可能带来的污染物等负面影响。

(2)可以利用ADP作为磷酸供体来生产2-磷酸甘油酸。在反应体系中加入单价金属离子可以有效的促进酶反应速率及效率。

(3)该酶的嗜酸特性与宿主菌Pyrococcus.horikoshii的生长pH(5-8)范围不一致，说明该酶可能具有独特生理学性质，这对于该菌代谢途径等理论研究也具有一定的参考价值。

本发明甘油酸激酶的技术特点如下：

1.本发明得到了嗜热及耐高温的甘油酸激酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在嗜热球古菌(Thermococcales)中发现并制备获得的第一个甘油酸激酶。

2本发明首次获得了嗜热的甘油酸激酶。

3.本发明首次获得了热稳定性良好的耐高温甘油酸激酶。

4.本发明首次获得了能利用ADP作为磷酸供体的甘油酸激酶。

5.单价金属离子能够明显的促进该酶的酶活。

(四)附图说明

图1是蛋白质表达的电泳照片，其中：M.标准蛋白质分子量；1.细胞总提取物；2.可溶性细胞提取物；3.经热处理以后的粗酶提取液；4.经镍柱亲和层析纯化的酶蛋白；5.经阴离子交换层析得到纯化的酶蛋白。

图2是该酶的酶活与温度变化关系曲线。

图3是该酶的酶活与pH变化关系曲线。

(五)具体实施方式

实施例1、一种嗜热耐高温的甘油酸激酶，具有DNA序列如下：

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gcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaag    540

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taa                                                                  1323。

实施例2、一种甘油酸激酶，其特征在于，具有氨基酸序列如下：

MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA

    5    10    15    20    25    30    35    40    45    50    55    60

CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR

   65    70    75    80    85    90    95   100   105   110   115   120

ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK

  125   130   135   140   145   150   155   160   165   170   175   180

LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH

  185   190   195   200   205   210   215   220   225   230   235   240

IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA

  245   250   255   260   265   270   275   280   285   290   295   300

GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA

  305   310   315   320   325   330   335   340   345   350   355   360

LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP

  365   370   375   380   385   390   395   400   405   410   415   420

TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT

  425   430   435   440。

实施例3、嗜热耐高温的甘油酸激酶的制备

嗜热耐高温的甘油酸激酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下：

(1)菌株、质粒、酶与培养基：

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、限制性内切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接kit ver.2.1购自TakaRa公司；克隆与表达质粒载体pET15b、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-codonPlus(DE3)-RIL购自Novagen公司；LB培养基：每升含Tryptone 10g，Yeastextract 5g，NaCl 10g，氨苄青霉素浓度为100mg/L，氯霉素浓度为34mg/L。

(2)PCR扩增及重组质粒的构建：

设计一对引物：上游[5′-attcgctgattcatatgattgccatggatattagggag-3′]，下游[5′-gtgaacagtcgacttaagtacggcctcgtttcgatgtgac-3′]，划线部分为上游引物Nde I酶切位点及下游引物Sal I酶切位点。以Pyrococcus horikoshii(掘越氏热球菌)全基因组序列为模板进行扩增，用Nde I和Sal I两种酶切后连接到经同样酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。

(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将重组质粒转化E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入1mol/L IPTG于37℃继续培养4h，诱导表达的蛋白经过超声破壁，85℃热处理半小时，离心，取上清液进行镍柱亲和层析(Novagen公司产品)和阴离子交换层析柱(Amersham公司产品)得到纯化的酶蛋白。电泳图如图1所示。

本实施例所得的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)的分析鉴定如下：

酶反应方程式为：

酶反应体系为：100ul反应体系中D-甘油酸(Sigma公司产)1mM；纯化的酶蛋白500ng；ATP(BBI公司产)1mM；MgCl₂ 10mM；50mM磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲液(pH 7)。反应温度为40℃，反应时间为10min。

在上述反应体系中加入3U烯醇化酶、5U乳酸脱氢酶、3.5U丙酮酸激酶(Sigma公司产品)，3mM NADH(Sigma公司产品)，于40℃反应10min。

该酶的主要酶学性质如下：

(1)该酶能够催化D-甘油酸生成2-磷酸甘油酸(在2-磷酸甘油酸存在的情况下，反应体系中加入烯醇化酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶可催化NADH生成NAD⁺，使反应溶液在340nm的光吸收值下降)，因此鉴定为一种甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)。

(2)该酶具有较为宽的酶适应温度，在20-50℃具有很高的酶活，在100℃时的酶活能达最大酶活的50％左右，该酶的最适酶活温度为45℃(见图2)。

(3)该酶是一种嗜酸性酶，在酸性条件下具有很高的酶活，最适酶活pH为2.5(见图3)。

(4)该酶除能够利用ATP作为磷酸供体外，还能利用GTP，CTP，UTP及ADP作为磷酸供体。与ATP作为磷酸供体(100％)相比，酶活分别为GTP(64％)，CTP(73％)，UTP(29％)ADP(32％)。

(5)单价金属离子KCl，NaCl，NH₄Cl and LiCl(50mM)能明显的促进该酶的酶活，与未加金属离子(100％)相比，酶活分别为KCl(795％)，NaCl(349％)，NH₄Cl(783％)，LiCl(228％)。

(6)该酶具有极高的热稳定性，分别在70℃，80℃，90℃热处理12个小时后，酶活力能保持起始酶活的95％以上。

(7)该酶的在实验条件下的比活力为50-100U/mg。

                              序列表

<110>山东大学

<120>一种嗜热耐高温的甘油酸激酶及其制备方法与应用

<140>

<141>

<160>1

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>1323

<212>DNA

<213>掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)

<400>1

gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagct   60

gcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgtt  120

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gaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttcca  420

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gcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaag  540

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cacaacttcc tgatagccag taattcaatc tcctgcgagg ccatagccag ggaagctcag  840

aggcttgggt tcaaagcata tataatgacg actactttgg agggagaagc caaggatgcc  900

gggttattca taggatctat agtccaggaa atagctgaaa ggggaaggcc gttcgaacct  960

ccggtagttc tagtgttcgg tggagagacc accgtaacaa tagaaggtaa agggggaaag 1020

ggagggccca accaagaaat agcgctgagt gctaccagga agatctcgga tctagaagcc 1080

ctgatcgtgg ccttcgacac cgatggaacc gatggtccca ctgatgcggc cgggggaata 1140

gtggatggaa caacgtacaa gaagcttagg gaaaagggaa tagatgttga gaaagtattg 1200

aaagagcata actcgtatga agccttaaag aaagttgggg gcttgctatt cactgggccc 1260

actggaacga acgtcaactc tattgttata gcgatagtca catcgaaacg aggccgtact 1320

taa                                                               1323

<210>2

<211>440

<212>PRT

<213>掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)

<400>2

MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA

    5    10    15    20    25    30    35    40    45    50    55    60

CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR

   65    70    75    80    85    90    95   100   105   110   115   120

ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK

  125   130   135   140   145   150   155   160   165   170   175   180

LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH

  185   190   195   200   205   210   215   220   225   230   235   240

IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA

  245   250   255   260   265   270   275   280   285   290   295   300

GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA

  305   310   315   320   325   330   335   340   345   350   355   360

LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP

  365   370   375   380   385   390   395   400   405   410   415   420

TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT

  425   430   435   440