将DNA的特定碱基序列烷基化的新吲哚衍生物和使用其的烷基化剂以及药剂

摘要

本发明提供一种可以由比现有的杂交分子更短的反应步骤合成、而且兼具反应性高的DNA烷基化能力和序列识别能力的将DNA的特定碱基序列烷基化的吡咯－咪唑聚酰胺类的新化合物和使用其的烷基化剂以及药剂功能分子。该吲哚衍生物如式(1)表示：其中，R1为将DNA烷基化的官能团，R2为氢原子、烷基或者酰基；X是以上图分子式作为结构单元(m为0～10的整数)、并由该结构单元之一构成的2价基团、或者由可以相同也可以不同的2个以上的该结构单元构成的2价基团。其中，在上述结构单元中，上述R2侧末端的结构单元由上图分子式表示，K为0～10的整数。

说明书

技术领域

本发明涉及将DNA的特定碱基序列烷基化的新吲哚衍生物和使用其的烷基化剂以及药剂，具体地，涉及通过将特定碱基序列烷基化而尤其抑制基因的异常表达、具有高的抗癌作用、反应性极其高的新吲哚衍生物和使用其的烷基化剂以及药剂。

背景技术

在人类基因序列的破解基本上完成的今天，对某一特定的碱基序列具有特异性的结合能力的分子受到很多研究者的注目。在非专利文献1等中报道了Dervan等人发现逆平行取向的“N-甲基吡咯(以下，简称为“吡咯”或称为“Py”)”-“N-甲基咪唑(以下，简称为“咪唑”或称为“Im”)”聚酰胺对碱基序列特异地结合到DNA的小沟(minor groove)。此外，导出如下的一般规则：Py-Im识别C-G碱基对、Im-Py识别G-C碱基对、Py-Py识别A-T碱基对或T-A碱基对。

此外，为了在Py-Im聚酰胺中引入共价键，以防止结合中的熵损失并得到更强的结合和识别能力，合成了各种发夹结构和环状的聚酰胺。作为代表性的物质，已知β连接体(β-linker)(-NHCH₂CH₂CO-)、γ连接体(-NHCH₂CH₂CH₂CO-)。其中具有γ连接体(-NHCH₂CH₂CH₂CO-)的发夹结构具有优异的结合能力和识别能力，其与DNA的复合体的结构也已被确定(参照非专利文献2)。另外，β-β识别A-T碱基对或T-A碱基对。γ连接体也同样地识别A-T碱基对或T-A碱基对，γ连接体形成以折弯发夹型的鼎的部分为代表的γ-转角(γ-turn)结构。

这些分子具有与转录因子等匹配的结合常数以及特异性，但由于基因表达的控制是通过抑制转录因子的结合而进行的，因此可作为靶的碱基序列极端受限制(例如，参照非专利文献3)。

本发明人开发出在Py-Im聚酰胺上结合抗生物质DuocarmycinA的烷基化部位的区段A(Du)而成的杂交分子，并申请了专利(例如，参照专利文献1)。该杂交分子基于Py-Im聚酰胺的序列识别能力而将450碱基对的DNA片段的一处进行选择性烷基化(例如，参照非专利文献4)。但完成反应需要数天，反应效率也低，是数％。

相对于此，本发明人发现：在对DNA进行烷基化的官能团(以下，也称为“烷基化反应部位”)和Py-Im聚酰胺之间插入乙烯连接体(L)而制成的ImPyLDu86成为二聚体后，在低浓度下，与序列5’-YG(A/T)CR-3’(这里，Y表示嘧啶碱基，R表示嘌呤碱基)中相隔5碱基对的链的两处选择性地反应，以70％的高效率进行烷基化。即，发现通过连接体部分的导入，使得反应性以及效率剧增(例如，参照非专利文献5)。

专利文献1：国际公开第00/15641号

非专利文献1：J.Am.Chem.Soc.1997，119，7636

非专利文献2：J.Am.Chem.Soc.1997，119，7909

非专利文献3：J.Am.Chem.Soc.2000，122，4856

非专利文献4：J.Am.Chem.Soc.1999，121，4961

非专利文献5：J.Am.Chem.Soc.2000，122，1602

发明内容

发明要解决的课题

但是，上述非专利文献5记载的杂交分子在合成的困难度、连接体部位不稳定性、烷基化部位的反应性等方面存在问题。

因此，本发明的目的在于提供一种可以由比现有的杂交分子更短的反应步骤合成、而且兼有反应性高的DNA烷基化能力和序列识别能力的、将DNA的特定碱基序列烷基化的吡咯-咪唑聚酰胺类新型化合物以及使用其的烷基化剂以及药剂功能分子。

解决课题的手段

本发明人为了实现上述目的而进行了积极的研究，其结果发现，通过制作成在吡咯-咪唑聚酰胺的末端隔着吲哚连接体具有烷基化反应部位的化合物，可以解决上述课题，从而完成了本发明。

即，本发明的吲哚衍生物，其特征在于，以下述通式(1)表示：

(式中，R¹为将DNA烷基化的官能团，R²为氢原子、烷基或者酰基；X是以下式

为结构单元(m是0～10的整数)并由该结构单元之一构成的2价基团或者由可以相同或可以不同的2个以上的该结构单元构成的2价基团。其中，在上述结构单元中，上述R²侧末端的结构单元可以是下式

(K为0～10的整数))。

此外，本发明的DNA的烷基化剂，其特征在于，其是由上述本发明的吲哚衍生物构成。

进而，本发明的药剂，其特征在于，该药剂使用本发明的烷基化剂，并抑制或活化基因的表达。

发明效果

本发明的吲哚衍生物是对在基因上存在的特定的碱基序列选择性地进行烷基化的功能分子，通过改变分子内的咪唑、吡咯等的配置，可以改变所识别的碱基序列。此外，其合成方法从提供多品种方面出发也是实用的、应用性高。这在人类基因组上，作为针对重要的基因序列或者源自癌等疾病的基因异常的有用且合乎逻辑的药剂，可实现基因水平上的药物设计。

附图说明

[图1]图1表示本发明化合物(4-1)以及(3-1)对长链DNA(pUC-II以及pUC-II’)的DNA序列特异性烷基化能力以及其碱基序列识别模型。

[图2]图2表示本发明化合物(3-2)以及(3-3)对长链DNA(pUC-II以及pUC-I’)的DNA序列特异性烷基化能力以及其碱基序列识别模型。

[图3]图3表示本发明化合物(3-2)的碱基序列特异性DNA烷基化模型。

[图4]图4表示本发明化合物(3-2)、(3-4)以及(3-5)对长链DNA(λ-F10906)的DNA序列特异性烷基化能力以及其碱基序列识别模型。

[图5]图5表示本发明化合物(3-6)对长链DNA(pQBI63)的DNA序列特异性烷基化。

[图6]图6表示本发明化合物(4-1)以及(3-1)在酸性、碱性条件下的稳定性。

[图7]图7表示本发明化合物(3-7)单体、或者在化合物(3-7)和(6)共存下对长链DNA(727bp)的DNA序列特异性烷基化。

[图8]图8表示本发明化合物(4-3)对具有24次端粒重复序列的DNA片段(446bp)的端粒序列特异性烷基化。

[图9]图9表示使用乳癌、前列腺癌等39种人工培养癌细胞评价本发明化合物(3-2)的抗癌活性的柱状图。

具体实施方式

以下，具体地说明本发明的最优实施形态。

本发明的吲哚衍生物以下述通式(1)表示，

X是以下式

为结构单元、并由该结构单元的一个构成的2价基团、或者由可以相同也可以不同的2个以上的该结构单元构成的2价基团。其中，

在上述结构单元中，上述R²侧末端的结构单元可以是下式：

其中，m或k为0～10、优选1～6、更加优选2～3的整数。此外，结构单元的数量并没有特别的限制，根据成为烷基化对象的DNA的序列来适当选择，但通常优选1～20、更优选2～7。另外，结构单元的顺序并没有特别的限制，根据成为烷基化对象的DNA的序列来适当选择而设计聚酰胺。)

本发明的吲哚衍生物所识别的DNA的序列，与现有已知的一般规则一样，作为原则，Py-Im识别C-G碱基对、Im-Py识别G-C碱基对、Py-Py识别A-T碱基对或T-A碱基对、β-β以及γ-γ等识别A-T碱基对或T-A碱基对。此外，β-β以及γ-γ等不仅识别碱基对，还构成折弯发夹型的鼎的部分。另外，如现有已知那样，根据D NA的靶序列的前后周围的序列状况，偶尔能观察到错配。例如，在富含AT(AT rich)的序列多时，发夹型分子中的γ转角结构旁边的Im-Py等常出现错配识别。

此外，成为本发明化合物的特征的吲哚连接体，针对1个吲哚，可以配对2个Im、Py等，但并不是必须是通常配对的2个Im、Py等，也可以是1个。另外，作为原则，吲哚本身存在进行与Py相同的识别的倾向，存在识别C或者T的倾向。进而，本发明的吲哚衍生物的烷基化反应部位是在嘌呤碱基的N-3位，特别是在腺嘌呤的N-3位烷基化。

作为上述式(1)中以R¹表示的烷基化反应部位，只要是对于在DNA上存在的特定的碱基序列兼有烷基化能力和序列识别能力的基团，就可以是任何基团而没有特别的限制。另外，作为R¹例如，作为适宜例子可以列举下式：

所表示的烷基化反应部位。另外，在不阻碍烷基化反应的范围内，上述式(2)～(5)中可以引入取代基，或者可以将结构简单化。

上述式(2)和(5)是源自Duocarmycin A的CPI，以下称式(2)为DU86，称式(5)为Du。此外，将式(3)所示的1，2，2，9a-四氢环丙[c]苯并[e]吲哚-4-酮称为CBI。另外，式(3)存在下式(3-S)以及(3-R)所示的旋光异构体。

上式(4)中，R³表示氢原子、肽链、糖链、聚乙二醇基。作为具体例可以列举肽链、蛋白质、单糖类、二糖类，多糖类、聚乙二醇类等。E表示卤素原子、甲磺酰基、甲苯磺酰基等的离去性高的取代基；卤素的具体例可列举溴、氟、碘，优选氯。

上述(4)式的具体例可列举以下式(4-A)

表示的seco-CBI(1-氯甲基-5-羟基-1，2-二氢-3H-苯并[e]吲哚)的残基。另外，式(4-A)存在下式(4-A-S)以及(4-A-R)所示的旋光异构体。

上式(3-S)以及(3-R)，如下述反应式所示那样，可以通过用弱碱处理(4-A-S)以及(4-A-R)而得到。

其中，式(3-S)所表示的S-CBI，其三元环具有与上述式(5)表示的天然型Du同样的配置，R¹为式(3-S)的式(1)所示的吲哚衍生物具有烷基化活性。另一方面，R¹为式(3-R)所示的R-CBI的式(1)所示的吲哚衍生物其烷基化活性很弱，是失活型。

上式(1)中，R²是氢原子、烷基或者酰基。其中，烷基或者酰基(除去CO的部分)通常可列举碳原子数1～20、优选1～10、更优选1～6的直链状或者支链状的低级烷基，作为具体例，例如可列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。另外，R²可以适宜地使用乙酰基。此外，烷基或酰基可以具有取代基。

作为通式(1)所表示的吲哚衍生物，例如可列举R¹是上式(3)、R²是酰基的下述化合物：

R¹是上式(4-A)、R²是酰基的下述化合物等：

以上述化合物(3-1)为例，按照下述合成路线1来说明本发明的吲哚衍生物的合成方法的概要。首先，将AcImImCO₂H(3-1-1)和5-硝基吲哚-2-羧酸乙脂经接触还原而得到的氨体(3-1-2)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，通过在该溶液中添加缩合剂O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、二异丙基乙胺(ⁱPr₂NEt)而进行缩合反应，转化成Py-Im吲哚乙基酯(3-1-3)。通过将化合物(3-1-3)供于碱性水解条件，可以得到羧酸(3-1-4)。接着，通过将得到的羧酸(3-1-4)与可由市售的1，3-萘二醇合成的seco-CBI(3-1-5)偶联，可以得到作为本发明化合物的开环体(4-1)。进一步，通过将开环体(4-1)在水中弱碱性条件(NaHCO₃)下进行处理，可以转化成作为本发明化合物的环化体(3-1)。

(合成路线1)

此外，以上述化合物(3-2)为例，按照下述合成路线2说明本发明的吲哚衍生物的其它合成方法的概要。首先，运用使用肟树脂(oxime resin)的Py-Im聚酰胺的Fmoc固相合成法，合成到目前为止的发夹型Py-Im聚酰胺所对应的羧酸(3-2-1)。接着，使用羧酸(3-2-1)和HATU在反应系中转化成活性At酯(3-2-2)后，通过在其中添加氨基吲哚羧酸(3-2-3)，一举合成吲哚羧酸(3-2-4)。将化合物(3-2-4)与可由市售的1，3-萘二醇合成的seco-CBI(3-1-5)偶联，可以得到作为本发明化合物的开环体(4-2)。进一步，通过将开环体(4-2)在水中弱碱性条件(NaHCO₃)下进行处理，可以转化成作为本发明吲哚衍生物的环化体(3-2)。另外，作为本发明吲哚衍生物的环化体(3-3)、(3-4)以及(3-5)等也可以按照同样的方法进行合成。

(合成路线2)

此外，本发明的DNA的烷基化剂的特征在于，是由通式(1)所示的本发明的吲哚衍生物形成。

另外，作为烷基化剂而使用时，本发明的吲哚衍生物通过形成发夹型结构来识别DNA，此外，也可以通过形成二聚体而识别DNA。

此外，不仅是发夹型结构或者形成二聚体，也可以通过添加以下式：

(式中，n是0～10的整数)为结构单元、并具有由该结构单元之一构成的2价基团或者由可以相同或不同的2个以上的该结构单元构成的2价基团的化合物(其中，在上述结构单元中，N端侧末端的结构单元可以是下式：

(q是0～10的整数))来识别DNA。即，可以与不同种类的本发明的吲哚衍生物(1)配对并识别碱基对，进一步也可以与已知的小沟结合物(minor groove binder，MGB)配对并识别碱基对。

本发明的药剂的特征在于，抑制或活化使用本发明的烷基化剂的基因的表达。

作为抑制或者控制表达的基因，可以列举异常基因、单核苷酸多态性(SNPs)、癌基因等。此外，作为本发明的药剂的有效成分化合物而使用的本发明的吲哚衍生物，可以是其药学上可接受的盐，作为该盐，可以列举通常使用的盐例如盐酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐等与酸形成的盐、或者与甲胺、乙二胺等有机盐等的碱形成的盐。

本发明的吲哚衍生物或其药学上可接受的盐具有以下特征：

(a)向癌细胞内的导入很高，少量即可以看到效果；

(b)对酸或者碱性稳定，可以期待口服吸收性；

(c)可以控制特定基因的表达；

(d)比起现有的DNA烷基化剂，对正常细胞无损伤。

本发明的药剂通过控制基因的表达，期待对各种疾病有治疗效果，特别是对于癌症的治疗、预防是有用的，也可用于深部癌症。作为抗癌剂使用时，可以制剂成注射剂、锭剂、散剂、胶囊剂等通常使用的剂型。在制剂化时，可以使用通常使用的药学上可接受的载体例如结合剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、分散剂、稳定剂、色素、香料等。制剂中的吲哚衍生物的量根据吲哚衍生物的种类和剂型而不同，通常为0.2～50重量％。

此外，将本发明的药剂作为抗癌剂使用时的投药量根据年龄、体重、病情、治疗效果、投药方法、投药时期、投药天数、投药期间而不同，通常以一天一次10～400mg投药1、2或3周后停药一周的方法作为一个疗程反复投药。进而，通过改变咪唑、吡咯、β连接体的配置而可以适应各个种类的癌细胞。此外，用于更多地表达基因异常的癌、特别是用于现有的抗癌剂难以发挥效果的癌的基因异常。

实施例

以下，通过实施例具体说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

合成例1、2

化合物(4-1)以及(3-1)的合成(路线1)

(1)AcImImCO₂H(3-1-1)的合成

化合物(3-3-1)按照如下的文献记载方法合成：

[(a)Tao，Z.-F.；Fujiwara，T.；Saito，I.；Sugiyama，H.J.Am.Chem.Soc.1999，121，4961.(b)Tao，Z.-F.；Saito，I.；Sugiyama，H.J.Am.Chem.Soc.2000，122，1602.(c)Bando，T.；Narita，A.；Saito，I.；Sugiyama，H.Chem.Eur.J.2002，8，4781.]

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：10.37(s，1H；NH)，9.60(s，1H；NH)，7.63(s，1H；CH)，7.48(s，1H；CH)，3.96(s，3H；NCH₃)，3.93(s，3H；NCH₃)，2.03(s，3H；COCH₃)；

对C₁₂H₁₅N₆O₄进行ESIMS m/e测定：[M⁺+H]307.1，

计算值：307.3

(2)H₂N-吲哚-CO₂Et(3-1-2)的合成

化合物(3-1-2)将市售的5-硝基吲哚-2-羧酸乙脂用作起始原料，利用Pd-C通过在氢气气氛下的接触还原而合成。不进行精制而作为(3-1-3)的合成原料使用。

(3)AcImIm-吲哚-CO₂Et(3-1-3)的合成

将化合物(3-1-1)(305mg，1.05mmol)和化合物(3-1-2)(215mg，1.05mmol)溶于DMF(2mL)中，添加ⁱPr₂NEt(550μL，3.15mmol)、HATU(480mg，1.26mmol)，在氮气气氛下，室温搅拌15小时。反应结束后，减压下蒸馏除去反应溶液的溶剂，用硅胶柱色谱(3～5％MeOH的CH₂Cl₂溶液，梯度洗脱)精制所得到的残留物，通过蒸馏除去溶剂而得到黄色粉末(3-1-3)(326mg，52％)。

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：11.83(s，1H；NH)，10.32(s，1H；NH)，10.08(s，1H；NH)，9.40(s，1H；NH)，8.16(s，1H；CH)，7.60(s，1H；CN)，7.56(d，1H，J＝9.0Hz；CH)，7.50(s，1H；CH)，7.40(d，1H，J＝9.0Hz；CH)，7.12(s，1H；CH)，4.33(q，2H，J＝7.0Hz；OCH₂)，4.01(s，3H；NCH₃)，3.98(s，3H；NCH₃)，2.03(s，3H；COCH₃)，1.33(t，3H，J＝7.0Hz；CH₃)；

对C₂₃N₂₅N₈O₅进行ESIMS m/e测定：[M⁺+H]493.2，

计算值：493.2

(4)AcImIm-吲哚-CO₂H(3-1-4)的合成

在化合物(3-1-3)(326mg，0.66mmol)中添加MeOH(8mL)和1N氢氧化钠水溶液(8mL)后，在室温下搅拌30分钟。减压下蒸馏除去MeOH后，在0℃下加入10％HCl水溶液使成为酸性(pH＝2)。将生成的沉淀物用桐山漏斗收集，水洗后干燥，得到化合物(3-1-4)(297mg，96％)。

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：11.71(s，1H；NH)，10.35(s，1H；CH)，10.08(s，1H；NH)，9.49(s，1H；NH)，8.13(d，1H，J＝1.0Hz；CH)，7.60(s，1H；CH)，7.54(dd，1H，J＝2.0，9.0Hz；CH)，7.49(s，1H；CH)，7.38(d，1H，J＝9.0Hz；CH)，7.06(d，1H，J＝2.0Hz；CH)，4.01(s，3H；NCH₃)，3.97(s，3H；NCH₃)，2.03(s，3H；COCH₃)；

对C₂₁H₂₁N₈O₅进行ESIMS m/e测定：[M⁺+H]465.2，

计算值：465.2

(5)seco-CBI(3-1-5)的合成

化合物(3-1-5)按照如下文献记载的方法，作为盐酸盐进行合成。光谱数据已在文献中报道。

[(a)Boger，D.L.；Yun，W.Y.；Teegarden，B.R.J.Org.Chem.1992，57，2873.(b)Boger，D.L.；McKie，J.A.J.Org.Chem.1995，60，1271.(c)Boger，D.L.；Ishizaki，T.；Kitos，P.A.；Suntornwat，O.J.Org.Chem.1990，55，5823.]

(6)AcImIm-吲哚-seco-CBI(4-1)的合成

在化合物(3-1-4)(60.3mg，0.13mmol)的反应容器中添加seco-CBI(3-1-5)(32.7mg，0.13mmol)和EDCI(50.3mg，0.26mmol)、NaHCO₃(41.9mg，0.52mmol)，溶于DMF(700μL)中，在8小时氮气气氛下室温搅拌。确认反应结束后，蒸馏除去溶剂，用硅胶柱色谱(5～10％MeOH的CH₂Cl₂溶液，梯度洗脱)精制残留物。将得到的固体用CHCl₃洗净、干燥后，得到茶色粉末(4-1)(85.2mg，96％)。

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：11.71(s，1H；NH)，10.43(s，1H；OH)，10.34(s，1H；NH)，10.11(s，1H；NH)，9.41(s，1H；NH)，8.16(s，1H；CH)，8.12(d，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.97(brs，1H；CH)，7.85(d，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.62(m，1H；CH)，7.61(s，1H；Im-H)，7.52(t，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.51(s，1H；Im-H)，7.45(d，1H，J＝9.0Hz；CH)，7.36(t，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.19(s，1H；CH)，4.81(t，1H，J＝11.0Hz；NCHH)，4.56(d，1H，J＝11.0Hz；NCHH)，4.23(brt，1H；CH)，4.03(s，3H；NCH₃)，3.99(s，3H；NCH₃)，3.87(dd，2H，J＝7.0，11.0Hz；CH₂)，2.04(s，3H；COCH₃)；

对C₃₄H₃₁ClN₉O₅进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]680.22，

计算值：680.23

(7)AcImIm-吲哚-CBI(3-1)的合成

在化合物(4-1)(6.3mg，9.28mmol)的DMF(150μL)溶液中添加5％aq.NaHCO₃(100μL)，在1小时氮气气氛下室温搅拌。确认反应结束后，蒸馏除去溶剂，用硅胶柱色谱(5～15％MeOH的CH₂Cl₂溶液，梯度洗脱)精制残留物。蒸馏除去溶剂、干燥后，得到茶色粉末(3-1)(6.0mg，quant.)。

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：11.85(s，1H；NH)，10.35(s，1H；NH)，10.16(s，1H；NH)，9.41(s，1H；NH)，8.17(s，1H；CH)，8.00(d，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.94(s，1H；CH)，7.62(s，1H；Im-H)，7.52(m，2H；CHx2)，7.51(s，1H；Im-H)，7.43(m，2H；CH)，7.25(d，1H，J＝8.0Hz；CH)，6.95(s，1H；CH)，4.64(m，1H；NCHH)，4.49(d，1H，J＝10.0Hz；NCHH)，4.02(s，3H；NCH₃)，3.98(s，3H；NCH₃)，3.27(brt，1H；CH)，2.03(s，3H；COCH₃)，1.75(m，1H；CHH)，1.70(m，1H；CHH)；

对C₃₄H₃₀N₉O₅进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]644.23，

计算值：644.21

合成例3

化合物(3-2)的合成反应(路线2)

(1)AcImImPyPy-γ-ImPyCO₂H(3-2-1)的合成

化合物(3-2-1)通过Fmoc固相合成仪合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC的条件(0～50％0.1％醋酸-乙腈线性梯度，40min，254nm)下进行，作为合成原料使用。

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：10.32(s，1H；NH)，10.29(s，1H；NH)，10.23(s，1H；NH)，10.00(s，1H；NH)，9.91(s，1H；NH)，9.32(s，1H；NH)，8.02(s，1H；NH)，7.56(s，1H；Im-H)，7.50(s，1H；Im-H)，7.45(s，1H；Py-H)，7.44(s，1H Im-H)，7.27(s，1H；Py-H)，7.16(s，1H；Py-H)，7.14(s，1H；Py-H)，6.92(s，1H；Py-H)，6.89(s，1H；Py-H)，4.00(s，3H；NCH₃)，3.97(s，3H；NCH₃)，3.93(s，3H；NCH₃)，3.84(s，3H；NCH₃)，3.81(s，3H；NCH₃)，3.79(s，3H；NCH₃)，3.19(m，2H；CH₂)，2.34(m，2H；CH₂)，2.03(s，3H；COCH₃)，1.78(m，2H；CH₂)；

对C₃₉H₄₅N₁₆O₉进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]881.35，

计算值：881.36

(2)H₂N-吲哚-CO₂H(3-2-3)的合成

化合物(3-2-3)是通过将市售的5-硝基吲哚-2-羧酸乙脂用作起始原料的二工序反应((i)1N NaOH的碱水解、(ii)使用Pd-C的氢气气氛下的接触还原)来合成。

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：11.22(s，1H；NH)，7.11(d，1H，J＝8.5Hz；CH)，6.75(d，1H，J＝2.0Hz；CH)，6.67(s，1H；CH)，6.65(dd，1H，J＝2.0，8.5Hz；CH)，3.31(brs，2H；NH₂，H₂O)

(3)AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-CO₂H(3-2-4)的合成

将由固相合成得到的化合物(3-2-1)(3.5mg，3.98mmol)溶于DMF(75μL)中，添加Pr₂NEt(1.4μL，8.04mmol)、HATU(1.4mg，3.68mmol)，在氮气气氛下室温搅拌4小时。确认反应结束后，添加化合物(3-2-3)(1.3mg，7.38mmol)和iPr₂NEt(1.3μL，7.46mmol)，在氮气气氛下室温进行整夜搅拌。反应后，蒸馏除去反应溶液的溶剂，边用桐山漏斗过滤提取、边将残留物分别用CH₂Cl₂和H₂O洗净。其结果得到化合物(3-2-4)的粗结晶(3.0mg，73％)。

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：11.33(brs，1H；NH)，10.34(s，1H；NH)，10.33(s，1H；NH)，10.27(s，1H；NH)，9.92(s，2H；NH)9.73(s，1H；NH)，9.32(brs，1H；NH)，8.01(brt，1H；NH)，7.94(s，1H；CH)，7.56(s，1H；Im-H)，7.50(s，1H；Im-H)，7.46(s，1H；Im-H)，7.40(brd，1H，J＝8.5Hz；CH)，7.31(brd，1H，J＝8.5Hz；CH)，7.30(d，1H，J＝1.5Hz；Py-H)，7.26(d，1H，J＝1.5Hz；Py-H)，7.17(d，1H，J＝1.5Hz；Py-H)，7.16(s，2H；y-Hx2)，6.90(d，1H，J＝1.5Hz；Py-H)，6.85(brs，1H；CH)，4.00(s，3H；NCH₃)，3.97(s，3H；NCH₃)，3.95(s，3H；NCH₃)，3.85(s，3H；H₃)，3.84(s，3H；NCH₃)，3.80(s，3H；NCH₃)，3.20(dt，2H，J＝6.0，7.5Hz；CH₂)，2.36(t，2H，J＝7.5Hz；CH₂)，2.04(s，3H；COCH₃)，1.79(qu，2H，J＝7.5Hz；CH₂)；

对C₄₈H₅₁N₁₈O₁₀进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]1039.40，

计算值：1039.39

(4)AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-CBI(3-2)的合成

在装有粗结晶(3-2-4)(3.0mg，2.89mmol)的反应容器中继续添加seco-CBI(3-1-5)(1.4mg，6.01mmol)和EDCI(1.2mg，6.25mmol)、NaHCO₃(1.0mg，12.0mmol)，溶解于DMF(100μL)中，在氮气气氛下室温搅拌2小时。确认反应结束后，添加300μL的5％NaHCO₃、DMF(300μL)，搅拌30分钟。反应后，蒸馏除去溶剂，用硅胶柱色谱(5～15％MeOH的CH₂Cl₂溶液，梯度洗脱)精制残留物，通过蒸馏除去溶剂而得到粗结晶(3-2)(1.33mg，两步骤27％)。进一步，通过HPLC(0～50％0.1％醋酸-乙腈线性梯度，40min，254nm)进行精制，减压浓缩、冷冻干燥后，得到黄色结晶(3-2)(0.5mg，0.41μmol：两步骤11％)。

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：11.77(s，1H；NH)，10.32(s，1H；NH)，10.29(s，1H；NH)，10.26(s，1H；NH)，9.95(s，1H；NH)，9.92(s，1H；NH)，9.82(s，1H；NH)，9.33(s，1H；NH)，8.08(s，1H；CH)，8.01(brs，1H；NH)，8.00(d，J＝7.5Hz，1H；CH)，7.60(t，J＝7.5Hz，1H；CH)，7.56(s，1H；CH)，7.53(d，J＝8.5Hz，1H；CH)，7.50(s，1H；CH)，7.46(s，1H；CH)，7.43(t，J＝7.5Hz，1H；CH)，7.42(s，1H；CH)，7.31(s.1H；CH)，7.27(s，1H；CH)，7.24(d，J＝8.5Hz，1H；CH)，7.22(s，1H；CH)，7.19(s，1H；CH)，7.16(d，J＝7.5Hz，1H；CH)，7.06(s，1H；CH)，6.95(s，1H；CH)，6.89(s，1H；CH)，4.62(dd，J＝10.0，5.0Hz，1H；NCH₂)，4.48(d，J＝10.0Hz，1H；NCH₂)，4.00(s，3H；NCH₃)，3.97(s，3H；NCH₃)，3.95(s，3H；NCH₃)，3.86(s，3H；NCH₃)，3.84(s，3H；NCH₃)，3.80(s，3H；NCH₃)，3.20(m，2H；CH₂)，2.90(m，1H；CH)，2.35(m，2H；CH₂)，2.03(s，3H；COCH₃)，1.79(m，2H；CH₂)，1.76(dd，J＝7.5，5.0Hz，1H；CH)，1.70(t，J＝5.0Hz，1H；CH)；

对C₆₁H₆₀N₁₉O₁₀进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]1218.48，

计算值：1218.48

另外，得到AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-seco-CBI(4-2)的情况下，反应后，不经5％NaHCO₃处理而蒸馏除去溶剂，用硅胶柱色谱(5～15％MeOH的CH₂Cl₂溶液，梯度洗脱)、HPLC(0～100％0.1％醋酸-乙腈线性梯度，20min，254nm)精制残留物。减压浓缩、冷冻干燥后，可得到黄色结晶(4-2)。

对C₆₁H₆₁ClN₁₉O₁₀进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]1254.45，

计算值：1254.50

合成例4

AcImImPy-γ-Im-吲哚-CBI(3-3)的合成

化合物(3-3)通过与合成例3相同的合成顺序进行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC条件(0～50％0.1％醋酸-乙腈线性梯度，40min，254nm)下进行，用于DNA烷基化反应。

对C₄₉H₄₈N₁₅O₈进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]974.37，

计算值：974.26

合成例5

AcImImPyPy-γ-PyPy-吲哚-CBI(3-4)的合成

化合物(3-4)通过与合成例3相同的合成顺序进行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC条件(0～50％0.1％醋酸-乙腈线性梯度，40min，254nm)下进行，用于DNA烷基化反应。

对C₆₂H₆₁N₁₈O₁₀进行ESI MS m/e测定：[M⁺+H]1217.5，

计算值：1217.4

合成例6

AcImPyPyPy-γ-ImPy-吲哚-CBI(3-5)的合成

化合物(3-5)通过与合成例3相同的合成顺序进行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC条件(0～50％的0.1％醋酸-乙腈线性梯度，40min，254nm)下进行，用于DNA烷基化反应。

对C₆₂H₆₁N₁₈O₁₀进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]1217.5，

计算值：1217.4

合成例7

AcImImPyPyβPyPy-γ-ImPyβImPy-吲哚-CBI(3-6)的合成

化合物(3-6)通过与合成例3相同的合成顺序进行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC条件(0～50％的0.1％醋酸-乙腈线性梯度，40min，254nm)下进行，用于DNA烷基化反应。

对C₉₀H₉₃N₃₀O₁₆进行ESI MS m/e测定：[M⁺+H]1849.7，

计算值：1850.1

合成例8

AcImImPy-β-ImPy-吲哚-CBI(3-7)的合成

化合物(3-7)通过与合成例3相同的合成顺序进行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC条件(0～50％的0.1％醋酸-乙腈线性梯度，40min，254nm)下进行，用于DNA烷基化反应。

对C₅₄H₅₂N₁₇O₉进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]1082.5，

计算值：1082.4

合成例9

AcImImIm-γ-PyPy-吲哚-seco-CBI(4-3)的合成

化合物(4-3)应用已报道的Py-Im聚酰胺的液相合成法进行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC条件(0～100％的0.1％醋酸-乙腈线性梯度，20min，254nm)下进行，用于DNA烷基化反应。

对C₅₅H₅₅ClN₁₇O₉进行ESI-TOFMS m/e测定：[M⁺+H]1132.5，

计算值：1132.4

合成例10

AcImImPyPy-β-PyPyPy-β-Dp(6)的合成

化合物(6)使用fmoc固相合成仪合成，用二甲基氨基丙胺加热并从固相载体中分离出来。精制是在使用Chemcobond5-ODS-H柱的HPLC条件(0～100％的0.1％醋酸-乙腈线性梯度，20min，254nm)下进行。

对C₅₃H₆₇N₂₀O₁₀进行ESI-MS m/e测定：[M⁺+H]1143.9，

计算值：1143.5

在上述合成例1～10中，试剂“ⁱPr₂NEt(N，N-二异丙基乙胺)”、HATU(O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲)”、溶剂“DMF(N，N-二甲基甲酰胺)”类主要从Aldrich等试剂公司购入且未经精制而使用。在没有特别标明的情况下，反应踪迹通过254nm UV条件下的高效液相色谱(HPLC)来监控。¹H-NMR光谱使用JEOL JNM-A 500(500MHz)，使用TMS(四甲基硅烷)作为内标物。此外，记号中的多重性省略为s(单峰)、d(双重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、qu(五重峰)、m(多重峰)、br(宽峰)。电喷雾电离质谱(ESIMS)使用PE SCIEX API 165。电离飞行时间质谱仪(ESI-TOFMS)使用Bio TOFII(Bruker Daltonics)质谱仪。聚丙烯酰胺凝胶电泳使用HITACHI 5500-S DNA序列分析仪，其加样缓冲液(loading dye)(fushin red的二甲基甲酰胺溶液)从Amersham Co.Ltd.购入。50％Long Ranger^TM凝胶溶液从FMCBioproducts购入，小牛肠碱性磷酸酶(AP，1000unit/mL)从Boehringer Mannheim购入。

5’-德州红标记的DNA片段的合成

以5’-德州红标记的DNA片段(pUC-I’：序列号1)是使用以5’-德州红标记的20碱基对引物：5’-TexRed-AGAATCAGGGGATAACGCAG-3’(pUC18正向，780-799：序列号2)和20碱基对引物：5’-TTACCAGTGGCTGCTGCCAG-3’(pUC18反向，1459-1478：序列号3)，以puc18作为模板，通过PCR法合成的(450bp)。DNA片段是含有互补链的双链体状态(以下同样)。

以5’-德州红标记的DNA片段(pUC-II：序列号4)是使用以5’-德州红标记的21碱基对引物：5’-TexRed-TGCTGGCCTTTTGCTCACATG-3’(pUC18反向，1861-1881：序列号5)和19碱基对引物：5-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3’(pUC18正向，328-345：序列号6)，以puc18作为模板，通过PCR法合成的(450bp)。

以5’-德州红标记的DNA片段(pUC-II’：序列号7)是使用以5’-德州红标记的19碱基对引物(pUC18正向，328-345：序列号6)和21碱基对引物(pUC18反向，1861-1881：序列号5)，以puc18作为模板，通过PCR法合成的(450bp)。

以5’-德州红标记的DNA片段(λ-F10906：序列号8)是使用以5’-德州红标记的23碱基对引物：5’-TexRed-ATCAGGGCAACTCAACCCTGTCC-3’(λ-DNA正向，10960-10982：序列号9)和20碱基对引物：5’-CAGGACGACCAATATCCAGC-3’(λ-DNA反向，37007-37026：序列号10)，以λ-DNA作为模板，通过PCR法合成的(537bp)。

以5’-德州红标记的DNA片段(pQBI63：序列号11)是使用20碱基对引物：5’-GGTGATGTCGGCGATATAGG-3’(序列号12)和以5’-德州红标记的20碱基对引物：5’-TexRed-CCCCAAGGGGTTATGCTAGT-3’(序列号13)，以pQBI63质粒作为模板，通过PCR法合成的(994bp)。

以5’-德州红标记的727bp DNA片段(序列号14)是以在MLP中插入了人β-珠蛋白的编码碱基序列的质粒作为模板，使用以5’-德州红标记的20碱基对引物：5’-TexRed-CCCATTCTAAACTGTACCCT-3’(序列号15)和21碱基对引物：5’-GGCATCAAGGAAGGTGATTGG-3’(序列号16)，通过PCR法合成的。

具有24次端粒重复序列的以5’-德州红标记的DNA片段(序列号17)是以从EcoRI切割点插入了包含端粒重复序列的低聚物的pCR2.1质粒作为模板，使用以5’-德州红标记的20碱基对引物：5’-TexRed-GGCCAGTGAATTGTAATACG-3’(序列号18)和20碱基对引物：5’-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3’(序列号19)，通过PCR法合成的(446bp)。所得到的各个DNA片段用Suprec-02过滤精制后，测定UV吸收来确定其浓度。

对直链DNA(400bp～)的烷基化能力

使用长链DNA(pUC-II’：序列号7)研究上述合成例中合成的化合物(3-1)、(4-1)与DNA的反应。烷基化反应是在23℃下进行8小时，利用测序用聚丙烯酰胺电泳来解析烷基化序列的结果示于图1。其结果，开环体(4-1)、成环体(3-1)具有相同的序列特异性，在nM浓度下，对位点1(5’-CGGCCA-3’)的腺嘌呤进行选择性烷基化。该序列特异性可以根据在DNA小沟内二聚化而识别碱基序列的模型来说明。

另外，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的解析是按照如下方法进行的：将在总量为10μL的5mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)中含有5’末端以德州红标记的DNA片段10nM、DMF10％(v/v)和在先标明浓度的药剂的标准反应溶液放入微量离心分离管(Eppendorf)中，在23℃下静置8小时。反应结束后，加入小牛胸腺(calf thymus)DNA(1mM，1μL)进行淬灭(quench)，在90℃下震荡5分钟。在离心减压下得到的DNA中加入8μL的加样缓冲液(颜料填充剂loading dye)(fushin red的DMF溶液)，溶解后，在94℃震荡20分钟。立即在0℃急剧冷却后，对其中的2μL使用HITACHI5500-S DNA序列分析仪在6％改性聚丙烯酰胺凝胶下进行电泳。以下的实验也同样。

使用长链DNA(pUC-II：序列号4、pUC-I’：序列号1)研究上述合成例中合成的化合物(3-2)、(3-3)与DNA的反应。进行8小时的烷基化反应，利用测序用聚丙烯酰胺电泳来解析的结果示于图2。其结果，化合物(3-2)、(3-3)都可以在nM浓度下观察到即使与以前的具有乙烯连接体的Py-Im聚酰胺相比都毫不逊色的高效的DNA烷基化。但是，在序列识别能力方面观察到了不同之处。即，化合物(3-3)中，尽管可以观察到作为匹配序列的位点4(5’-AGCCA-3’)的烷基化，但另一方面，也观察到了位点1(5’-AGCTA-3’)、位点2(5’-AGTCA-3’)、位点5(5’-TACCA-3’)等一个碱基对错配序列。对照性地，在化合物(3-2)中，仅可以观察到位点3(5’-TGACCA-3’)、位点6(5’-AGTCCA-3’)的匹配序列的烷基化，在序列识别能力方面，化合物(3-2)的分子设计是优异的。更有意思的是，pUC-I’(序列号1)中也含有相当于化合物(3-3)的匹配序列的位点(5’-TGCCG-3’)，但完全观察不到对鸟嘌呤的烷基化。

结合图2的结果考虑，该吲哚连接体和CBI的组合可以认为是以高的序列特异性对腺嘌呤的N-3位进行烷基化。可以认为，在序列识别中，吲哚连接体边起到Py的作用，边将CBI的环丙烷环和腺嘌呤的N-3位的距离调整到发生烷基化的距离(图3)。

使用长链DNA(λ-F10906：序列号8)对化合物(3-2)、(3-4)、(3-5)与DNA的反应进行研究。评价其DNA烷基化能力的结果示于图4。与图2结果同样地观察到化合物(3-2)在nM浓度下的序列特异性DNA烷基化(位点2，3：5’-TGACCA-3’，位点4：5’-AGACCA-3’，位点5：5’-TGTCCA-3’)。也可以观察到化合物(3-4)在nM浓度下的序列特异性DNA烷基化(位点6：5’-AATCCA-3’，位点7：5’-TAACCA-3’)。另一方面，化合物(3-5)仅观察到对错配序列(位点1：5’-TGCTCA-3’)的烷基化。这些结果显示，在含有吲哚连接体的发夹型Py-Im聚酰胺的分子设计中，仅通过改变Py-Im的配置，就可以自由地制作成具备不同的序列识别能力的烷基化剂。

此外，通过确立使用吲哚连接体的合成路线，在现有的乙烯连接体中不能合成的具有更长的碱基序列识别能力的烷基化剂的合成也成为可能。例如，使用肟树脂的Py-Im聚酰胺的Fmoc固相合成法，由于可以提供具有长的序列识别能力的Py-Im羧酸，因此合成例7所示的化合物(3-6)的合成成为可能。对来自pQBI63的D NA片段(序列号11)进行烷基化研究的结果，可以确认nM浓度下的化合物(3-6)对1000碱基对DNA进行高效的烷基化(图5)。另一方面，观察到了1bp错配(mis-match)识别引起的烷基化(位点2)，还可以观察到对富含AT的(AT-rich)碱基序列(位点1，3)的烷基化。在化合物(3-6)这样具有长的识别能力的Py-Im聚酰胺中，保持高的特异性是重要的课题。可以认为，今后，通过对目前的分子设计进行最优化，通用性优异的具有10碱基对以上的序列识别能力的实用的烷基化会成为可能。

发夹型聚酰胺的稳定性

按照如下方法，使用HPLC对酸性、碱性条件下的稳定性进行。将总量10μL的5％HCl水溶液(pH＝1，DMF∶H₂O＝1∶9)或者5％NaHCO₃水溶液(pH＝9，DMF∶H₂O＝1∶9)中含有化合物(3-1)或者(4-1)(100μM)的反应溶液放入微量离心分离管(Eppendorf)中，在37℃下静置。从开始静置起，在30分钟、2小时、24小时之后，分别以HPLC(0～100％50mM甲酸铵-乙腈线性梯度，20min，流速：1.0mL/min，254nm)分析化合物(4-1)(16.8min)、化合物(3-1)(15.1min)。

使用化合物(4-1)、(3-1)，通过HPLC的产品分析(productanalysis)来评价含有吲哚连接体的Py-Im聚酰胺的稳定性，其结果示于图6。明确了化合物(4-1)针对HCl酸性(pH＝1)水溶液(37℃、静置24小时)条件，完全不会水解。此外，针对NaHCO₃碱性(pH＝9)水溶液(37℃、静置24小时)条件，化合物(4-1)转化成化合物(3-1)(30分钟：50％、2小时：78％)，但完全不会生成其它水解产物。另一方面，如果将化合物(3-1)置于HCl酸性(pH＝1)水溶液(37℃)条件，则迅速转化成化合物(4-1)(30分钟：96％)。即，明确了：含有吲哚连接体的Py-Im聚酰胺在酸性(pH＝1)中以化合物(4-1)这样的seco-CBI的形态、在碱性(pH＝9)中以化合物(3-1)这样的CBI的形态稳定地存在。

利用异二聚体型聚酰胺进行的DNA序列特异性烷基化

Py-Im聚酰胺的Fmoc固相合成法可以提供具有序列识别能力的Py-Im羧酸或小沟结合物，所以如合成例8以及10所示那样，还可以合成化合物(3-7)、(6)。就727bp DNA片段(序列号14)，研究了化合物(3-7)的DNA烷基化，其结果可以确认：化合物(3-7)在nM浓度下，高效地进行基于发夹型识别的烷基化(位点1，2)和基于直链型识别的烷基化(位点3)(图7)。有意思的是，在作为小沟结合物的化合物(6)(500nM)的共存下形成异二聚体，可以观察到基于正确的10碱基对识别的烷基化(位点4)。化合物(3-7)以及(6)那样的二个分子通过共同作用而可以证实长的碱基对识别能力，这从扩大Py-Im聚酰胺的识别的角度考虑，是重要的想法。

以端粒序列作为靶的DNA烷基化

在细胞内的DNA末端上存在有由5’-GGGTTA-3’组成的连续的碱基序列，已有启示其与细胞的增殖、复制非常相关。研究了化合物(4-3)对具有24次端粒重复序列的DNA片段(446bp：序列号17)的烷基化，其结果，观察到化合物(4-3)在nM浓度下高效地进行基于发夹型识别的端粒序列选择性烷基化(5’-ACCCTA-3’)(图8)。利用含有吲哚连接体的Py-Im聚酰胺的烷基化剂，其分子设计富于通用性，可以认为能够进行各种靶碱基序列识别。

发夹型聚酰胺的体外抗癌作用

为了调查显示出最优良的序列特异性烷基化的包含吲哚连接体的Py-Im聚酰胺(3-2)对癌细胞的效果，使用乳癌到前列腺癌的39种人培养癌细胞进行评价(图9)。柱状图的纵轴表示39种人培养癌细胞的种类，横轴的“0”值表示IC₅₀的对数的平均值。若柱延伸到右侧，则表示对于该癌种类的效果好，若延伸到左侧，则表示效果差。化合物(3-2)对人培养癌细胞具有比较强的活性[39种的平均logIC₅₀值约为-7(100nM)]，显示出令人感兴趣的抗癌活性。此外，使用乳癌到前列腺癌的39种人培养癌细胞的抗癌活性评价是按照癌研究会进行的筛选试验来进行评价。

进而，用含0.1％DMF的10^-5～10^-8M的AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-CBI(3-2)，对HCT-116(源自人大肠癌的细胞)、HeLa(源自人子宫癌的细胞)、HLC-2(源自人肺癌的细胞)、SH-SY-5Y(源自人成神经的细胞)进行48小时的处理，评价该化合物作为抗癌剂的效果。其结果，对HCT-116、HeLa、HLC-2、SH-SY-5Y的50％细胞增殖抑制浓度(IC₅₀)分别为7.42×10^-8、5.97×10^-8、5.35×10^-8、7.43×10^-9M。此外，对293T(源自人肾脏的正常细胞)、WI-38(源自人正常成纤维细胞)也进行了同样的评价，其结果，IC₅₀分别为6.99×10^-8、6.79×10^-8M，显示出与正常细胞相比对癌细胞大约高10倍的高抗癌作用(IC₅₀值是以用0.1％DMF处理48小时的体系作为对照来计算的)。

另外，抗癌活性的评价是根据如下方法进行的。在96孔平底板中，将HCT-116、HeLa、HLC-2、SH-SY-5Y细胞分别以4.0×10³、3.6×10³、1.6×10³、7.0×10²、5.0×10²、8.0×10²细胞/孔的细胞密度在完全培养基[含10％的胎牛血清的RPMI1640(HCT-116、SH-SY-5Y细胞；Sigma-Aldrich公司)、以及Dulbecco’s改良培养基(HeLa、HLC-2、239T、WI-38；Sigma-Aldrich公司)]中接种，在CO₂培养箱内进行24小时预培养。接着，将培养基换成含有0.1％的DMF和10^-5～10^-8M的AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-CBI(3-2)的完全培养基，在CO₂培养箱内进行48小时的处理。之后，加入每孔10μL的细胞增殖分析试剂盒(cell counting kit-8)试剂(同仁化学)，在CO₂培养箱内放置2小时，通过酶标仪(Micro plate reader)MPR-A4I(TOSOH公司)测定吸光度。

发夹型聚酰胺的体内抗癌作用

研究了化合物(4-2)对裸鼠可移植性人ER(+)乳癌Br-10的抗肿瘤效果。用套管针在8周岁BALB/cA-nu/nu小鼠的背侧部皮下移植人ER(+)乳癌Br-10。对移植Br-10的小鼠，同时肌肉内投药E·P·缓释型激素(hormone depot)0.1mL。肿瘤体积大约达到100mm³时，分成5只/组开始投药。

将化合物(4-2)溶于乙醇中，稀释到生理盐水中，1天1次、每三天3次，分在肿瘤附近的三、四处投药。化合物(4-2)的投药量是以0.05mL/10g的容量注射50mg/kg(大约1mg/鼠)。此外，对照组中，在皮下注射生理盐水。每三天测定肿瘤的长径(L)以及短径(W)，通过下式求得肿瘤的体积。

肿瘤体积(mm³)＝L(mm)×W²(mm²)/2

将化合物(4-2)投药组与对照组的肿瘤体积的对比结果示于下表1中。表中的数值表示以各组在1天后的肿瘤体积设为1.0时的各组中的相对评价、以及以(化合物(4-2)投药组的肿瘤体积：T)/(对照组的肿瘤体积：C)×100％表示的组之间的相对评价。

                 [表1]

由上述表1可知，在皮下注射化合物(4-2)的组中，第一次投药就显示出增殖的抑制，随着以后的投药，显示出更显著的增殖抑制效果。另外，本试验中，并没有观察到小鼠的体重减少等毒性。