检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因多态的方法

摘要

本发明涉及一种检测与人类原发性高血压相关的基因的方法，该方法包括检测Ala486/Val(rsl801058)多态基因型，其中Ala等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。

说明书

技术领域

本发明涉及检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的方法。

背景技术

GRK4基因即G蛋白偶联受体激酶4亚型，蛋白产物为G蛋白偶联受体激酶4亚型α型异构体(G protein-coupled receptor kinase 4isoform alpha)，G蛋白偶联受体激酶4亚型β型异构体(Gprotein-coupled receptor kinase 4 isoform beta)，G蛋白偶联受体激酶4亚型γ型异构体(G protein-coupled receptor kinase 4 isoformgamma)，G蛋白偶联受体激酶4亚型δ型异构体(G protein-coupledreceptor kinase 4 isoform delta)。

高血压与机体排除过多盐分的机能发生障碍有关。众所周知，多巴胺是参与情绪调节的大脑化学物质。然而，多巴胺在肾脏行使的功能是协同维持血液中的水、电解质平衡。研究发现，当GRK4蛋白活性增高时，多巴胺受体蛋白失去正常功能，结果导致血液中的水盐潴留。

GRK4为G蛋白偶联受体激酶超家族成员。本基因目前定位在人类染色体4p16.3。G蛋白偶联受体激酶通过使丝氨酸磷酸化使G蛋白偶联受体的脱敏。在高血压个体的肾近区小管中GRK4活性增加导致了D1样受体活性降低，对于多巴胺的促尿钠排泄功能产生影响；从而影响原发性和继发性高血压的发生。

通过研究在肾近曲小管中的GRK4所有异构体的mRNA发现：在肾近曲小管细胞中表达得各GRK4异构体在高血压和非高血压个体间不存在差异；然而，在高血压个体的肾近曲小管细胞中，其被D1激动剂激活后的GRK4的活性较非高血压个体强。研究发现，能识辨GRK4γ和δ异构体的抗体能削弱D1样激动剂对于GRK4活性的激活作用；由此说明，在高血压个体中GRK4活性的增强是由于其γ和δ异构体的作用。但是，研究并没有发现GRK4δ异构体对于D1样受体的功能有影响；因此，目前认为主要是GRK4γ异构体的作用。

目前已有动物模型研究了GRK4γ中的突变对于中国仓鼠卵巢细胞D1样受体磷酸化的影响，发现转染了A486V位点两种基因型突变的细胞的D1样受体的磷酸化程度有明显的差异。这也就表明此位点显著影响G蛋白偶联受体的脱敏，从而减弱多巴胺对于钠重吸收的阻碍作用，从而可能影响到高血压的发生。

通过识别出的这A486V基因多态，可以用来对遗传性高血压患者进行早期诊断，而且通过减少GRK4产物也能纠正高血压基因缺陷，也将有助于更好地治疗这种疾病。

此多态性位点已被世界权威的生物医学数据库-美国国立卫生研究院(NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)收录，为C/T的变异。SnpID：rs1801058，位于GRK4基因的第17个外显子，外显子序列如下，其中黑体字标出的第50位为A486V(参看图1)。此多态性位点在人类基因组上能被唯一确定，定位于基因编码的73607位。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测与人类原发性高血压相关的基因的方法，该方法包括检测Ala486/Val(rs1801058)多态基因型，其中Ala等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关，即，Ala等位基因的分布频率越高，患原发性高血压的风险越高。该多态基因位点位于GRK4基因的第73607位。

在另一个方面，本发明提供了检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的方法，该方法包括采用PCR扩增目标基因和利用限制性片断长度多态性方法鉴定Ala486/Val(rs1801058)多态基因型，其中Ala等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。

在本发明中使用的引物包括足够长度和适当序列的寡核苷酸，用于为靶核苷酸合成提供特异开始。该引物可以包括例如15-30个核苷酸，并且与所要扩增的核苷酸序列的每条链大致地互补，例如是5’AGAGTGGCGGTGTTTATGCG 3’，5’GGTGTCCAGGTAGATCCCTTTCAGC 3’。

限制性片段长度多态性是用某一种限制性内切酶切割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，由于多态基因型，而得到不同长度和数目的DNA片段，通过检测酶切后的DNA长度和数目的不同来确定不同多态基因型。

在另一个方面，本发明提供了检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的方法，该方法包括采用PCR扩增目标基因和采用直接测序法测定Ala486/Val(rs1801058)多态基因型，其中Ala等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。

在另一个方面，本发明提供了检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的方法，该方法包括采用PCR扩增目标基因和采用标记的核酸探针测定Ala486/Val(rs1801058)多态基因型，其中Ala等位基因的分布频率与原发性高血压患病风险呈正相关。

核酸探针可以用放射性同位素、酶、发光材料(例如荧光和磷光材料)标记。用于标记的这些放射性同位素、酶、发光材料等是本领域的技术人员所已知的，例如、但不限于³²P，¹²⁵I，¹⁴C，辣根过氧化物酶、荧光素等。核酸探针可以与多态基因位点为C的基因序列互补，也可以与多态基因位点为T的基因序列互补。或者，可以同时存在与多态基因位点为C的基因序列互补和与多态基因位点为T的基因序列互补的两种核酸探针。探针的长度例如可以是10-50个或更多碱基，或15-30个碱基。例如，在一个实施方案中，探针可以是与图1的核酸序列互补的核酸片段。

除了以上方法以外，还可以采用本领域技术人员已知的其它检测多态位点的方法。

本发明还提供了可用于检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于限制性片断长度多态方法的内切酶，例如Hin6I内切酶。

另外，本发明提供了可用于检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于检测基因多态位点的标记核酸探针。

另外，本发明提供了可用于检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的试剂盒，该试剂盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于检测基因多态位点的测序试剂盒。

例如，根据一个具体的实施方案，试剂盒含有用于PCR以下试剂：

引物：

5’AGAGTGGCGGTGTTTATGCG 3’，

5’GGTGTCCAGGTAGATCCCTTTCAGC 3’各0.5μl(10μM)，

dNTP MIX 0.2μl(10mM)，

HotStartTaq酶0.1μl(10u/μl)，

PCR buffer 1.0μl(10X)，

DNA模板1.0μl(50ng/μl)；

另外含有用于限制性片段长度多态方法的下列试剂：

Hin6I buffer 1.1μl(10X)；和

Hin6I 0.3μl(10u/μl)。

本发明的用于检测与人类原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的试剂盒的使用方法包括下列步骤：A、从活体获取生物样本，通过上述PCR引物，进行PCR扩增反应；B、纯化PCR反应产物，用限制性内切酶内切PCR反应产物；C、电泳鉴定酶切DNA片段。

在实验中，本发明通过采集样本，设计引物5’AGAGTGGCGGTGTTTATGCG 3’，5’GGTGTCCAGGTAGATCCCTTTCAGC 3’，利用PCR方法扩增出目标基因，然后用Hin6I内切酶进行酶切，然后电泳，由凝胶电泳图谱获得此基因位点的基因型。结果发现，Ala等位基因频率(％)在原发性高血压组中为55.5％，而在对照组中仅为42.7％，其中Ala/Ala基因型的患原发性高血压的风险性最高，Ala/Val患原发性高血压的风险性次之，Val/Val基因型患原发性高血压的风险性最低。由此判断，Ala486/Val(rs1801058)多态Ala等位基因携带者发生原发性高血压的相对危险性显著升高，本发明的与原发性高血压的多态位点的发现对于高血压的诊断、预防和治疗具有重要的意义。

本发明所提出的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态可在人体样本比如血液、活组织中检出。本发明的方法可用来在人群中进行筛查，从而可以根据个体的Ala486/Val(rs1801058)多态基因型来判断患原发性高血压的风险率。同时，还可以采用该方法早期诊断遗传性高血压。通过检测该基因多态，对于高血压高风险个体，可以及早采取预防措施，防止高血压的发生。

原发性高血压是一种一旦患病需终生服药的顽固性疾病，目前尚无彻底的治疗手段。高血压是最常见的心血管疾病，不仅患病率高，而且可引起严重的心、脑、肾并发症，是一种对人类健康危害极大的疾病。本发明的与原发性高血压基因多态位点的提出，为彻底治疗原发性高血压提供了一种新的途径。通过矫正多态基因缺陷，或者通过减少或消除缺陷GRK4产物，可以达到预防或彻底治疗高血压的目的。因此，本发明的与原发性高血压相关的GRK4基因Ala486/Val(rs1801058)多态的提出为开发原发性高血压基因治疗药物及基因治疗方法提供了可能。而且，本发明的基因多态位点的提出，为原发性高血压的病因提出了新的观点，将对高血压的病因学的认识提高到了一个新的层次。

附图简述

图1显示了A486V多态位点，为C/T的变异，位于GRK4基因的第17个外显子，其中黑体字标出的第50位为A486V。

图2示出了基因型电泳示意图，M表示Marker，即标准电泳图谱。

具体实施方式

1  Ala486/Val(rs1801058)多态与人类原发性高血压的相关性

1.1病例对照样本临床特征描述

见表1。

表1病例对照样本临床特征描述

  病例(n＝503)  对照(n＝490)  P  性别，男/女年龄收缩压，mmHg舒张压，mmHgBMI，kg/m2高密度脂蛋白胆固醇，mmol/L低密度脂蛋白胆固醇，mmol/L甘油三酯，mmol/L血糖mmol/L血肌酐，μmol/L吸烟者饮酒者  262/24153.57±9.34177.07±28.05104.34±12.2826.32±3.851.25±0.303.19±0.861.70±1.065.93±1.7971.22±14.59204173  257/23353.51±9.23117.47±11.6475.05±8.0124.30±3.561.32±0.343.09±0.871.43±0.865.60±1.6846.35±11.56211164  NSNS＜0.0001＜0.0001＜0.00010.00120.0544＜0.00010.00260.0162NSNS

数值为均值±标准差。NS，无统计学意义；BMI，体重指数。

1.2Ala86/Val(rs1801058)多态在病例对照样本中的频率分布Ala486/Val(rs1801058)多态Ala等位基因在病例中的分布明显高于对照组，见表2。

表2  Ala486/Val(rs1801058)多态在病例对照样本中的频率分布

  基因型  病例(n＝503)合计[男/女]  对照(n＝490)合计[男/女]  P  Ala486/ValAla/AlaAla/ValVal/ValAla等位基因频率(％)169[92/77]218[120/98]116[50/66]55.5[58.0/52.3]96[45/51]226[118/108]168[94/74]42.7[40.5/45.1]＜0.0001[＜0.0001/0.048]＜0.0001[＜0.0001/0.116]

1.3Ala486/Val(rs1801058)多态对于原发性高血压的相对危险性Ala486/Val(rs1801058)多态Ala等位基因携带者发生原发性高血压的相对危险性显著升高。见表3。

表3  Ala486/Val(rs1801058)多态对于原发性高血压的相对危险性

  变量  OR(％95CI)  P  BMI，kg/m²甘油三酯，mmol/L血糖，mmol/LC/C vs.T/TC/T vs.T/T  1.16(1.12 to 1.21)1.19(1.03 to 1.38)1.12(1.03 to 1.21)2.92(2.03 to 4.20)1.13(1.04 to 1.96)  ＜0.0010.020.010.0010.03

2检测Ala486/Val(rs1801058)多态的试验样本和方法Ala486/Val(rs1801058)多态可通过PCR与限制性片断长度多态性方法结合进行检测

2.1试验样本的获得

所有的DNA样本和临床数据均是自亚洲国际心血管病合作研究计划的一部分。本计划通过了当地的伦理委员会的批准，并且每一位参与者都自愿签署了知情同意书。总共有15,838名有代表性的35到74岁的志愿者参加了此计划；从其中我们选择了吉林、北京和山东三地的503名独立的高血压个体和490名独立的对照个体。每位志愿者的血压都由训练有素和通过认证的调查人员测量三次。本次研究所选择的高血压的定义为收缩压≥160mmHg和或舒张压≥100mmHg。患有二型高血压、冠心病和糖尿病的个体不在调查范围之内。从吉林、北京和山东三个研究地区中随机选择符合以上标准的个体，并按年龄、性别和居住地匹配。

2.2Ala486/Val(rs1801058)多态扩增片断的获得通过设计的错配引物，使用ABI公司的9700PCR仪和TaKaRa公司的HotStart Taq酶进行聚合酶链反应(PCR)获得Ala486/Val(rs1801058)多态扩增片断(185bp)。扩增引物和扩增条件见表4和表5。Taq酶为宝生物公司出品的HotStart Taq酶，适宜于Touch-down方法。

表4  Ala486/Val(rs1801058)多态的扩增引物

  引物  序列  上游下游  5’AGAGTGGCGGTGTTTATGCG 3’5’GGTGTCCAGGTAGATCCCTTTCAGC 3’

表5  Ala486/Val(rs1801058)多态PCR扩增体系和扩增条件

  扩增体系  扩增条件10μl  dNTP MIX          0.2μl(10mM)引物              各0.5μl(10μM)HotStartTaq酶     0.1μl(10u/μl)PCR buffer        1.0μl(10x)DNA模板           1.0μl(50ng/μl)水补至10μl       (6.7μl)起始94℃5min，接下来38个循环(94℃15s，64℃15s，72℃30s，)，最后72℃保持7min

2.3限制性片断长度多态性方法鉴定Ala486/Val(rs1801058)多态基因型

含有Ala486/Val(rs1801058)多态的DNA片断扩增成功后，用限制性内切酶对产物进行酶切，从凝胶电泳图谱即可分辨出此位点的基因型。

用MBI公司生产的Hin6I内切酶使185bp的扩增产物在37℃酶切10h。酶切体系见表6。

表6  Ala486/Val(rs1801058)多态酶切体系和酶切条件

  酶切体系  酶切条件11μl  Hin6I buffer 1.1μl(10X)Hin6I      0.3μl(10u/μl)PCR产物    6μl水补至11μl37℃保温10个小时

2.4琼脂糖凝胶电泳检查酶切产物

在被溴乙锭染色后的浓度为3％的琼脂糖凝胶中电泳酶切产物，电压180伏，电泳时间为1小时。当Ala486/Val(rs1801058)多态出现T等位基因时，电泳为185bp的条带，出现C等位基因时，电泳为161bp和24bp的两条带。图2示出了基因型电泳示意图，M表示Marker，即标准电泳图谱。

3用于检测Ala486/Val(rs1801058)多态的试剂盒

3.1该试剂盒含有用于扩增目标基因的引物5’AGAGTGGCGGTGTTTATGCG 3’，5’GGTGTCCAGGTAGATCCCTTTCAGC 3’各0.5μl(10μM)，dNTP MIX 0.2μl(10mM)，HotStartTaq酶0.1μl(10u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板1.0μl(50ng/μl)。

3.2该试剂盒另外含有用于限制性片段长度多态方法的Hin6I buffer1.1μl(10X)和Hin6I 0.3μl(10u/μl)。

3.3操作步骤

3.3.1从活体获取生物样本，通过上述PCR引物，进行PCR扩增反应。

3.3.2纯化PCR反应产物，用限制性内切酶内切PCR反应产物。

3.3.3电泳鉴定酶切DNA片段。