海狗油中OMEGA3不饱和脂肪酸的测定方法

摘要

本发明涉及一种海狗油中OMEGA3不饱和脂肪酸的测定方法，该方法采用液相色谱法，对海狗油中的不饱和脂肪酸如海狗油原油中EPA、DHA、DPA进行衍生化后用高效液相色谱法对其进行含量测定，根据标准品的图谱和样品的图谱比较来判定海狗油中的不饱和脂肪酸的含量，特别是EPA、DHA、DPA的含量，本发明的方法包括下列步骤：1.制定标准对照指纹图谱；2.测定海狗油及含有海狗油的制剂的指纹图谱；3.将上述指纹图谱进行比较；4.测算海狗油及含有海狗油的制剂中不饱和脂肪酸的量。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种海狗油及其用海狗油制得的软胶囊中OMEGA3不饱和脂肪酸的测定方法。

背景技术

海狗为海豹科动物竖琴海豹(Harp seal)的俗称，栖居于北极和大西洋的北部。由于加拿大政府采取的保护措施，海狗的数量以每年5％的速度稳定增长。为保持海狗与鱼群之间的生态平衡，经联合国和加拿大政府批准，每年可以少量地捕杀海狗。

海狗油取材于新捕猎的北极海狗皮下脂肪，经过真空蒸馏等工艺，在低温条件下除去蛋白、碳水化合物等物质，得到呈微黄色、透明液体状的精炼海狗油。

海狗油中富含人体所需的OMEGA3不饱和脂肪酸(简称：Ω-3PUFA或ω-3多不饱和脂肪酸)，其营养价值要优于其他食用油类。在海狗油中除发现鱼油中通常含有的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)外，还有含量可观的二十二碳五烯酸(DPA)。理想条件下提炼加工的海狗油，其中EPA、DHA和DPA的含量可高达25％以上。

由于海狗油中富含OMEGA3不饱和脂肪酸使海狗油具有调节血脂，抗动脉粥样硬化、降血压、抑制血小板聚集和抗血栓作用，研究表明海狗油对前列腺疾病及糖尿病亦有一定疗效。因为其成分复杂，各成分含量参差不齐，所以用一般分离、分析手段对OMEGA3不饱和脂肪酸难以定性、定量。《江苏药学与临床研究》杂志2001年第9卷第3期报道了用气相色谱法测定海狗油中的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)与二十二碳五烯酸(DPA)。但由于此方法采用的为气相色谱法，其准确率不高，另外，《药学进展》杂志2002年24卷4期报道了气相色谱-质谱测定海狗油中不饱和脂肪酸的方法，但该方法主要从分离角度解决不饱和脂肪酸的分离问题，没有涉及含量测定问题。本发明根据海狗油中不饱和脂肪酸的特点，选择适合的色谱条件，制定标准指纹图谱，以控制海狗油产品的质量，利于工业生产。

发明内容：

本发明的目的在于，提供一种海狗油及其制剂的质量控制方法。

本发明是通过比较海狗油中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)与二十二碳五烯酸(DPA)的指纹图谱对海狗油及其制剂的质量进行控制的。

本发明采用液相色谱法，对海狗油中的不饱和脂肪酸如海狗油原油中EPA、DHA、DPA进行衍生化后用高效液相色谱法对其进行含量测定，根据标准品的图谱和样品的图谱比较来判定海狗油中的不饱和脂肪酸的含量，特别是EPA、DHA、DPA的含量，本发明所述标准指纹图谱是对海狗油中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)与二十二碳五烯酸(DPA)的纯化的标准对照品，采用本发明的高效液相色谱条件进行测定，得到的高效液相图谱。而海狗油及含有海狗油的制剂的指纹图谱是指对海狗油产品中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)与二十二碳五烯酸(DPA)，采用本发明的高效液相色谱条件进行测定，得到的高效液相图谱。

所述纯化的标准对照品可以从市场上买到，也可以通过已知的提取方法提取得到。

本发明的质量控制方法可包括下列步骤：

1、制定标准对照指纹图谱；

2、测定海狗油及含有海狗油的制剂的指纹图谱；

3、将上述指纹图谱进行比较；

4、测算海狗油及含有海狗油的制剂中不饱和脂肪酸的量；

根据本发明，步骤1中制定标准对照指纹图谱；具体操作步骤如下：

(a)对照溶液的制备：

(1)取二十碳五烯酸甲酯(EPAM)对照品1ml(含EPAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加异丙醇定容至刻度，制成每1ml中含EPAM 1mg的溶液，摇匀，作为EPAM储备液。

(2)取二十二碳六烯酸甲酯(DHAM)对照品1ml(含DHAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加异丙醇定容至刻度，制成每1ml中含DHAM 1mg的溶液，摇匀，作为DHAM储备液。

(3)取二十二碳五烯酸甲酯(DPAM)对照品1ml(含DPAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加异丙醇定容至刻度，制成每1ml中含DPAM 1mg的溶液，摇匀，作为DPAM储备液。

精密量取上述各储备液各1ml，置10ml的棕色量瓶中，加0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，摇匀，作为对照溶液；

(b)色谱条件：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例为6∶2∶2；检测波长210±2nm；

(c)测定：精密吸取对照品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到对照品指纹图谱。

以上所述对照品，是纯化的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)与二十二碳五烯酸(DPA)经过衍生化后的二十碳五烯酸甲酯(EPAM)、二十二碳六烯酸甲酯(DHAM)与二十二碳五烯酸甲酯(DPAM)样品。

步骤2中测定海狗油及含有海狗油的制剂的指纹图谱；具体操作步骤如下：

(a)供试品的制备：

取海狗油原油或含有海狗油的制剂如海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸内容物，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇钠，不断振摇，至小油滴完全消失，加冰乙酸，用甲醇BHT溶液定容至刻度，摇匀，滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液；

(b)色谱条件：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例为4～7∶1～3∶1～3；检测波长200～400nm；

(c)测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到供试品指纹图谱。

其优选的色谱条件和操作步骤如下：

(a)供试品的制备：

取海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸内容物或海狗油原油约100mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加0.5mol/L的甲醇钠4ml，不断振摇，至小油滴完全消失，加0.2ml冰乙酸，用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，续滤液作为供试溶液；

(b)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例为6∶2∶2；检测波长210±2nm；

(c)测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到供试品指纹图谱。

本发明中，色谱条件与系统适应性照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VD)进行的。

步骤3中是将供试品指纹图谱和标准对照品指纹图谱进行图谱比较。以外标峰面积法计算供试品中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)与二十二碳五烯酸(DPA)总百份含量。

根据本发明，以上色谱条件是经过筛选得到的，具体筛选情况如下：

1.波长选择

取EPAM、DHAM、DPAM对照品，加异丙醇适量，以0.005％甲醇BHT溶液，在200～400nm范围内进行全波长扫描，结果EPAM、DHAM、DPAM均在210nm±2nm波长处有最大吸收，见图9A。

2.流动相摸索

采用乙腈-甲醇-水(7∶1∶2)为流动相，流速1.2ml/min，检测波长210nm的条件进行检测时，检测时间较长，见图9B。

在此流动相的基础上，对流动相的极性稍加调整，采用乙腈-甲醇-水(6∶2∶2)为流动相，流速1.5ml/min，在保证各个组分的分离度符合要求的同时，缩短了分析时间，提高了工作效率，见图10。

3.溶剂空白

取空白溶剂20u1注入液相色谱仪，记录色谱图，结果空白溶剂峰均在t_R10.068min之前，见图11。

4.专属性试验

4.1酸、碱破坏

因海狗油样品经酸碱破坏后无法进行酯化，在流动相中也不溶解，无法进行测定。

4.2高温试验

取海狗油原油，于60℃条件下放置，于0、24小时取样，按含量测定法进行测定，结果经高温后，胶丸外观变硬，但与0天相比未出现其它杂质峰，见图12、图13。

4.3高湿试验

取海狗油原油，置RH92.5％条件下放置，于24小时取样按含量测定法进行测定，与0天相比未出现其它杂质峰，见图14。

4.4光照试验

取海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸，置4500Lx±500Lx强光下照射，于24小时取样，按含量测定法进行测定，结果与0天相比未出现其它杂质峰，结果见图15。

4.5氧化试验

取海狗油原油约100mg，通入氧气，密闭放置，于24小时取样按含量测定法进行测定，结果海狗油颜色明显加深，但与0天相比未出现其它杂质峰，见图16。

5.EPAM、DHAM、DPAM线性

精密量取标准曲线下各浓度的供试溶液各20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别绘制标准曲线。结果EPAM的标准曲线方程为Y＝43890x+180.65，r＝0.9998；DHAM的标准曲线方程为Y＝46333x+145.85，r＝0.9999；DPAM的标准曲线方程为Y＝40385x+116.13，r＝0.9999。结果见表2。

              表2  EPAM、DHAM、DPAM线性测定结果

  浓度(mg/ml)                    峰面积  EPAM  DHAM  DPAM  0.005  238.436  246.908  203.097  0.01  482.902  499.227  421.454  0.02  950.034  982.299  852.703  0.04  1902.805  1960.194  1698.315  0.1  4695.976  4884.396  4238.288  0.2  9359.842  9749.983  8490.771  1  43683.895  46406.273  40437.172

结果表明：EPAM、DHAM、DPAM在0～1mg/ml的浓度范围内线性良好。

6.精密度

6.1重复性

精密吸取海狗油标准曲线下浓度为0.1mg/ml的EPAM、DHAM、DPAM溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次，分别以EPAM、DHAM、DPAM的峰面积计算RSD，结果见表3。

          表3  EPAM、DHAM、DPAM重复性测定结果

次数                       峰面积  EPAM  DHAM  DPAM  1  4695.976  4884.396  4238.288  2  4709.718  4890.443  4235.939  3  4706.634  4877.812  4234.947  4  4707.021  4871.290  4250.639  5  4708.336  4876.279  4224.900  6  4724.235  4869.240  4247.582  RSD(％)  0.19  0.16  0.22

结果表明：EPAM、DHAM、DPAM重复性良好。

6.2中间精密度

取重复性项下溶液，连续两天进样，以峰面积计算，结果见表4。

          表4  EPAM、DHAM、DPAM日间精密度测定结果

次数                    峰面积  EPAM  DHAM  DPAM  1  4695.976  4884.396  4238.288  2  4709.718  4890.443  4235.939  3  4706.634  4877.812  4234.947  4  4707.021  4871.290  4250.639  5  4708.336  4876.279  4224.900  6  4724.235  4869.240  4247.582  RSD(％)  0.19  0.16  0.22

结果表明：EPAM、DHAM、DPAM日间精密度良好。

6.3重现性

精密称取海狗油原油约100mg六份，按照含量测定项下操作，以含量计算，结果见表5。

     表5  EPAM、DHAM、DPAM重现性测定结果

次数                含量(％)  EPAM  DHAM  DPAM  1  9.31  12.67  6.13  2  9.32  12.65  6.11  3  9.26  12.61  6.07  4  9.35  12.62  6.06  5  9.48  12.54  6.05  6  9.45  12.51  6.08  RSD(％)  0.91  0.5  0.51

结果表明：EPAM、DHAM、DPAM重现性良好。

7.检测限

取线性项下浓度为0.005mg/ml的EPAM溶液，不断稀释取20ul进样，结果浓度为0.00005mg/ml的溶液峰高约为基线噪音的3倍，故EPAM最小检测限为1.0ng。

取线性项下浓度为0.005mg/ml的DHAM溶液，不断稀释取20ul进样，结果浓度为0.00005mg/ml的溶液峰高约为基线噪音的3倍，故DHAM最小检测限为1.0ng。

取线性项下浓度为0.005mg/ml的DPAM溶液，不断稀释取20ul进样，结果浓度为0.00005mg/ml的溶液峰高约为基线噪音的3倍，故DPAM最小检测限为1.0ng。

8.定量限

取线性项下浓度为0.005mg/ml的EPAM溶液，不断稀释取20ul进样，结果浓度为0.000125mg/ml的溶液峰高约为基线噪音的10倍，故EPAM最小检测限为2.5ng。见图17。

取线性项下浓度为0.005mg/ml的DHAM溶液，不断稀释取20ul进样，结果浓度为0.000125mg/ml的溶液峰高约为基线噪音的10倍，故DHAM最小检测限为2.5ng。见图18。

取线性项下浓度为0.005mg/ml的DPAM溶液，不断稀释取20ul进样，结果浓度为0.000125mg/ml的溶液峰高约为基线噪音的10倍，故DPAM最小检测限为2.5ng。见图19。

9.加样回收率

准确称取已准确定量的海狗油约50mg九份，精密称定，分别置50ml棕色量瓶中，分别定量加入EPAM、DHAM、DPAM贮备溶液(精密吸取各对照品1ml，分别用用异丙醇稀释至10ml)各4.0ml、5.0ml、6.0ml，每种浓度3份，衍生化后用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，续滤液作为供试溶液，进样测定，照下式计算回收率：

M：测得量(mg)    P：原样品液本底量(mg)    A：理论加入量(mg)

结果见表6。

                                 表6  海狗油加样回收率

名称水平  次数  本底量(mg)  理论加入量(mg)  测得加入量(mg)  回收率(％)  平均回收率(％)RSD％  EPAM  80％  1  3.78  4  3.98  99.5  101.06  0.89  2  3.78  4  4.04  101  3  3.78  4  4.01  100.25  100％  1  3.52  5  5.1  102  2  3.52  5  5.09  101.8  3  3.52  5  5.11  102.2  120％  1  3.60  6  6.08  101.33  2  3.60  6  6.01  100.17  3  3.60  6  6.08  101.33  DHAM  80％  1  6.72  4  4.01  100.25  101.62  0.99  2  6.72  4  4  100  3  6.72  4  4.05  101.25  100％  1  6.33  5  5.11  102.2  2  6.33  5  5.14  102.8  3  6.33  5  5.12  102.4  120％  1  6.45  6  6.15  102.5  2  6.45  6  6.12  102  3  6.45  6  6.07  101.17  DPAM  80％  1  2.26  4  4.09  102.25  101.63  0.97  2  2.26  4  4.08  102  3  2.26  4  4.05  101.25  100％  1  2.11  5  5.08  101.6  2  2.11  5  4.98  99.6  3  2.11  5  5.04  100.8  120％  1  2.13  6  6.17  102.83  2  2.13  6  6.16  102.67  3  2.13  6  6.1  101.67

结果，海狗油加样回收率良好。

10.耐用性

10.1样品溶液稳定性

取重复性项下溶液，于室温条件下放置，分别于0、2、6、12、24小时取20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积计算，结果见表7。

          表7  EPAM、DHAM、DPAM溶液稳定性测定结果

                  峰面积  EPAM  DHAM  DPAM  0  3438.484  6061.625  2166.812  2  3431.067  6104.390  2161.703  4  3431.639  6110.353  2165.082  6  3440.853  6126.739  2180.721  12  3462.047  6109.155  2177.198  24  3486.845  6140.522  2157.009  RSD％  0.64  0.44  0.42

结果表明：海狗油溶液稳定性良好。

10.2条件改变对分离度的影响

将色谱柱ODSC₁₈(5um，150×4.6mm)改为ODSC₁₈(5um，250×4.6mm)，柱子型号由ODSC₁₈改为PHENEGON。

结果采用ODSC₁₈(5um，250×4.6mm)柱子，流动相乙腈-甲醇-水(6∶2∶2)，1.5ml/min，210nm波长处进行含量测定，分离度及柱效均符合要求。见图20。

根据本发明，标准对照的指纹图谱见图2l～26。

该图谱中除10.2分钟以前溶剂峰外，有3个吸收峰，其单峰面积均超过总峰面积的25％的吸收峰有3个，分别为：

1号峰，平均保留时间R_t为25.009min，RSD为0.06％，平均峰面积为4215.84，RSD为0.36％；

2号峰，平均保留时间R_t为32.506min，RSD为0.07％，平均峰面积为5568.583，RSD为0.23％；

3号峰，平均保留时间R_t为42.790min，RSD为0.07％，平均峰面积为4428.999，RSD为0.55％；

本发明通过对照指纹图谱来测定海狗油中OMEGA3不饱和脂肪酸的含量，以控制含海狗油产品的质量。

本发明的优点如下：

1.与对照溶液所获得的指纹图谱相比，可确认海狗油供试品中OMEGA3不饱和脂肪酸含量的多少，便于确定产品的质量。

2.本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。

本发明提供了一种测定海狗油中OMEGA3不饱和脂肪酸的方法，本发明是通过大量实验所得到的切实可行的方法，具有重复性。在本发明中通过高效液相、在相同测试条件下所获取的海狗油中OMEGA3不饱和脂肪酸组分高效液相指纹图谱的重复性好，因此可通过将上述测定方法中建立的测定海狗油中OMEGA3不饱和脂肪酸的指纹图谱作为标准指纹图谱，作为测定含有OMEGA3不饱和脂肪酸产品的标准指纹图谱，以鉴别其OMEGA3不饱和脂肪酸的含量。

对于本领域技术人员而言，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案，本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种改变和改进。例如，使用不同的检测仪器所获得的测定结果可能有所不同，但只要使用本发明所述的质量控制方法，均在本发明保护范围之内。

附图说明

下面给出海狗油检测相关的HPLC图谱，旨在进一步说明本发明，但对本发明并不构成限制。

图1  海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸含量对照HPLC图谱1

图2  海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸含量对照HPLC图谱2

图3  041002批海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸含量HPLC图谱1-1

图4  041002批海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸含量HPLC图谱1-2

图5  041006批海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸含量HPLC图谱1-1

图6  041006批海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸含量HPLC图谱1-2

图7  041010批海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸含量HPLC图谱1-1

图8  041010批海狗油ω-3多不饱和脂肪酸胶丸含量HPLC图谱1-2

图9A  测定波长的选择

图9B  流动相摸索(乙腈-甲醇-水＝7∶1∶2)HPLC图谱

图10  流动相摸索(乙腈-甲醇-水＝6∶2∶2)HPLC图谱

图11  溶剂空白HPLC图谱

图12  专属性试验(0天)HPLC图谱

图13  专属性试验(高温60℃、24h)HPLC图谱

图14  专属性试验(高湿RH92.5％、24h)HPLC图谱

图15  专属性试验(光照4500Lx±500Lx、24h)HPLC图谱

图16  专属性试验(氧化试验、24h)HPLC图谱

图17  EPAM定量限HPLC图谱

图18  DHAM定量限HPLC图谱

图19  DPAM定量限HPLC图谱

图20  柱效、分离度HPLC图谱

图21  海狗油标准对照指纹图谱1

图22  海狗油标准对照指纹图谱2

图23  海狗油标准对照指纹图谱3

图24  海狗油标准对照指纹图谱4

图25  海狗油标准对照指纹图谱5

图26  海狗油标准对照指纹图谱6

图27  海狗油原油HPLC图谱

图28  海狗油原油的图谱与标准对照指纹图谱的比较

图29  海狗油胶丸的图谱与标准对照指纹图谱的比较

具体实施方式

实施例1

制定标准对照指纹图谱；

精密量取对照液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。

                    标准对照指纹图谱结果

标准对照指纹图谱见附图21～26。

实施例2

测定海狗油原油样品的指纹图谱；

取海狗油样品备用；取海狗油原油约100mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加0.5mol/L的甲醇钠4ml，不断振摇，至小油滴完全消失，加0.2ml冰乙酸，用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，续滤液作为供试溶液。精密量取供试溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。

  海狗油原油含量测定结果

  名称  含量(％)  EPA  9.13  DHA  11.58  DPA  5.89  含量(％)  26.60

海狗油原油HPLC图谱见附图27。

结果表明：海狗油原油可以用此方法进行含量测定。

实施例3

含有海狗油的胶丸的指纹图谱测定

取含有海狗油的胶丸的内容物约100mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加0.5mol/L的甲醇钠4ml，不断振摇，至小油滴完全消失，加0.2ml冰乙酸，用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，续滤液作为供试溶液。精密量取供试溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。

                     海狗油胶丸含量测定结果

  041002(％)  041006(％)  041010(％)  EPA  8.51  8.51  8.46  DHA  11.30  11.29  11.24  DPA  5.43  5.43  5.40  含量(％)  25.24  25.23  25.1

海狗油胶丸的HPLC图谱见附图3～8。

实施例4

实施例1的图谱和实施例2的图谱比较方法(见附图28)

在海狗油原油的图谱中，与标准对照指纹图谱相对应的位置上有主成分峰出现，以外标峰面积法计算供试品原油中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)与二十二碳五烯酸(DPA)总百份含量。

实施例5

实施例1的图谱和实施例3的图谱比较方法(见附图29)

在海狗油胶丸的图谱中，与标准对照指纹图谱相对应的位置上有主成分峰出现，以外标峰面积法计算供试品胶丸中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)与二十二碳五烯酸(DPA)总百份含量。

实施例6

测算海狗油中不饱和脂肪酸的量；

不饱和脂肪酸的量(％)＝A₁+A₂+A₃

其中(A₁、A₂、A₃分别为EPA、DPA、DHA在海狗油胶丸中所占的比例)

f：为系数，其中f_EPA＝0.9557，f_DPA＝0.9593，f_DHA＝0.9590

A_样：供试品中被测成分的峰面积

A_对：对照品中被测成分的峰面积

C_对：对照品中被测成分的浓度

W_样：供试样品的称样量

D：供试样品的稀释倍数

以上均以外标峰面积法计算。

实施例7

测算海狗油胶丸中不饱和脂肪酸的量；

不饱和脂肪酸的量(％)＝A₁+A₂+A₃(A₁、A₂、A₃分别为EPA、DPA、DHA在海狗油胶丸中所占的比例)

其中

f：为系数，其中f_EPA＝0.9557，f_DPA＝0.9593，f_DHA＝0.9590

A_样：供试品中被测成分的峰面积

A_对：对照品中被测成分的峰面积

C_对：对照品中被测成分的浓度

W_样：供试样品的称样量

D：供试样品的稀释倍数

W_平均：胶丸平均装样量

W_标：胶丸标示量

以上均以外标峰面积法计算。