一种人外泌汗腺上皮细胞培养方法

摘要

一种人外泌汗腺上皮细胞的培养方法，由人外泌汗腺挑取、酶消化、离心纯化、培养基配制、二维培养、传代培养和三维构建汗腺样管状结构培养七步过程组成。本发明方法与现有技术相比具有以下优点：一是制备方法简便，技术稳定，重复性好；二是采用胶原酶消化法获得了单个的细胞，避免了既往的组织块法获得细胞量少，细胞不纯的缺点；三是采用无血清培养基，避免了血清对细胞生长的抑制作用；四是在Matrigel中进行三维培养使细胞生长好，增殖更快，更重要的是经切片染色后发现有汗腺样管状结构形成，有利于体外实验和研究，为体外重建汗腺奠定基础。

说明书

一、技术领域

本发明属于人类细胞的培养，具体涉及一种外泌汗腺上皮细胞的体外培养方法。

二、背景技术

外泌汗腺是皮肤重要的附属器之一，有分泌、排泄和调节体温的作用。体外分离和培养外泌汗腺细胞的意义在于：它能提供跨上皮转运机制研究和外泌汗腺相关疾病研究的模型；其次，皮肤组织工程发展至今，已基本解决了创面覆盖的问题，但未达到真正的组织结构和功能的完全重建，在目前所有的组织工程皮肤产品中，都无皮肤附件，分离和培养外泌汗腺各种细胞能为汗腺的三维重建和研究带附件的组织工程皮肤奠定基础。

上世纪90年代始，国外有研究者进行了人外泌汗腺细胞培养和药理学特性方面的研究，既往的研究均采用组织块培养法培养。其缺点在于组织块培养方法的原代细胞培养时间长，且并非每一块都有细胞萌出，故细胞传代次数和最终获取的细胞数较少，细胞种类不纯，使进一步持续深入研究受到限制。目前，尚未见有关于人外泌汗腺上皮细胞培养方法的专利文献公开；有一件公开号为CN1082109A的中国发明专利申请于1994年2月16日公开，它是“一种肝细胞体外培养方法”，包括取肝、分离、清洗、沉淀、消化、培养、接种等步骤，采用边条参液合成培养基进行体外培养，方法简便，培养的肝细胞活性良好，生物学特征正常，但不适合于人外泌汗腺上皮细胞培养。

三、发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种区别于组织块培养法的人外泌汗腺上皮细胞培养方法，使之简单易行，培养获得的人外泌汗腺上皮细胞较纯，生长良好，细胞增殖快，可多次传代，还可诱导汗腺样管状结构形成。

采取以下技术方案来实现本发明的目的。

一种人外泌汗腺上皮细胞的培养方法，由人外泌汗腺挑取、酶消化、离心纯化、培养基配制、二维培养、传代培养和三维构建汗腺样管状结构培养七步过程组成。

一)人外泌汗腺挑取

首先获取健康人的皮肤切除术后皮条，并立即置于D-Hank’s液中反复冲洗3-5次，再用眼科剪剪碎后置于磷酸盐缓冲液中重悬，然后将组织悬液置于至少20倍解剖显微镜下观察，用眼科镊直接挑取人外泌汗腺。

二)酶消化

将挑取的人外泌汗腺置入体积分数为0.4％的IV型胶原酶中，在37℃消化10-14小时，并不时摇动，使组织消化均匀、完全。

三)离心纯化

将D-Hank’s液40-50ml加入到酶消化好的人外泌汗腺组织中，反复离心3-5次，每次2000-3000rpm×5min，获得纯化的人外泌汗腺上皮细胞，然后用0.2％台盼兰计数活细胞数。

四)培养基配制

在无血清表皮细胞培养基中加入5ug/L的表皮生长因子(EGF)和50mg/L的牛垂体提取物，获得汗腺上皮细胞的培养基，保存备用。

五)二维培养

将纯化的人外泌汗腺上皮细胞用汗腺上皮细胞的培养基重悬，制得人外泌汗腺上皮细胞重悬液，再加入到涂有胶原的培养瓶中接种，接种密度为1-100×10³个细胞/cm²，盖紧胶塞，置于37℃，5％CO₂的孵箱培养，每3天更换汗腺上皮细胞的培养基一次，每天取样置于显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合度达70％～80％。

六)传代培养

将融合度达70％～80％的细胞每瓶加胰酶0.5ml，在37℃孵箱中消化5～10min，当细胞变圆、细胞间隙增大时，用胰酶抑制剂终止消化，加入D-Hank’s液10ml，离心2000-3000rpm×5min，获得的细胞再加入汗腺上皮细胞的培养基重悬，接种于瓶底涂有胶原的培养瓶中，接种密度为1-20×10⁴个/cm²，置于37℃，5％CO₂孵箱中继续扩增培养；每3天更换汗腺上皮细胞的培养基一次，每天取样置于显微镜下观察细胞生长情况。

七)三维重建汗腺管状结构培养

在冰浴条件下，将纯化的人外泌汗腺上皮细胞以1-50×10³个/ml的密度，混合于Matrigel凝胶中，以每孔2ml加入到12孔板中，再加入汗腺上皮细胞的培养基2ml/孔进行三维培养，并每3天更换汗腺上皮细胞的培养基一次，每天取样置于显微镜下观察细胞生长情况，培养生长9天后的细胞团取样固定、切片、HE染色观察管状结构形成情况。

在本发明的人外泌汗腺上皮细胞培养方法中，所用原辅材料全层皮肤、磷酸盐缓冲液、IV型胶原酶、无血清表皮细胞培养基、表皮生长因子、牛垂体提取物、胶原和Matrigel凝胶等，均应符合无菌要求。

本发明方法与现有技术相比具有以下优点：一是制备方法简便，技术稳定，重复性好；二是采用胶原酶消化法获得了单个的外泌汗腺上皮细胞，避免了既往的组织块法获得细胞量少，细胞不纯的缺点；三是采用无血清培养基，避免了血清对细胞生长的抑制作用；四是在Matrigel凝胶中进行三维培养使细胞生长好，增殖更快，更重要的是经切片染色后发现有汗腺样管状结构形成，有利于体外实验和研究，为体外重建汗腺奠定基础。

四、具体实施方式

下面是本发明的人外泌汗腺上皮细胞培养方法一个具体的培养实例，但需要说明的是，本发明方法绝不局限于所举的培养实例。

取人体腋部整形术切除的全层皮肤3×3cm大小，立即将皮肤组织置于D-Hank’s液中反复冲洗五次，剪成小皮条后，再用眼科剪剪碎，再置于50ml磷酸盐缓冲液中重悬，获得的组织悬液置于20倍解剖显微镜下观察，用眼科镊直接挑取人外泌汗腺；将挑取的人外泌汗腺置入体积分数为0.1％的IV型胶原酶30ml中，在37℃消化12小时，并不时摇动，使组织消化均匀、完全；在酶消化好的人外泌汗腺组织中加入D-Hank’s液至50ml，反复离心5次，每次2500rpm×5min，获得纯化的人外泌汗腺上皮细胞细胞，然后用0.2％台盼兰计数活细胞数。

将纯化的人外泌汗腺上皮细胞用汗腺上皮细胞的培养基重悬，制得人外泌汗腺上皮细胞重悬液，再将该悬液加入到涂有鼠尾胶原的培养瓶中接种，接种密度为5×10⁴个细胞/cm²，盖紧胶塞，置于37℃，5％CO₂的孵箱培养，每3天换汗腺腺上皮细胞的培养基一次，每天取样置于显微镜下观察，在24小时后可观察到细胞贴壁，3-4天左右观察到细胞呈多个克隆样麦粒样生长，3周左右细胞融合呈铺路石样生长，基本铺满瓶底，融合后的汗腺腺上皮细胞为扁平多角形，中间有圆形核，细胞生长至融合度达70％～80％时可用于实验或传代。

将融合度达70％～80％的细胞每瓶加胰酶0.5ml，在37℃孵箱中消化5～10min，当细胞变圆、细胞间隙增大时，用胰酶抑制剂终止消化，加入D-Hank’s液10ml，离心2500rpm×5min，获得的细胞加入汗腺腺上皮细胞的培养基重悬，接种于瓶底涂有胶原的培养瓶中，接种密度为1×10⁴个/cm²，置于37℃，5％CO₂孵箱中继续扩增培养；每3天更换汗腺上皮细胞的培养基一次，每天取样置于显微镜下观察细胞生长情况，可见传代细胞于24小时内贴壁，第I代细胞形态与原代相似，大部分为扁平多角形，从第II代开始细胞体积变大，形态逐渐变得不规则，有的细胞伸出长的伪足与邻近细胞相接。本方法培养的人外泌汗腺腺上皮细胞能传代3～5次。

三维构建汗腺管状结构培养是在冰浴条件下，将纯化的人外泌汗腺上皮细胞以5×10³个/ml的密度，混合于Matrigel凝胶中，以每孔2ml加入到12孔板中，再加入汗腺上皮细胞的培养基2ml/孔进行三维培养，并每3天更换汗腺上皮细胞的培养基一次；每天取样置于显微镜下观察细胞生长情况，Matrigel凝胶中可见，前9天细胞团直径平均每两天增长约一倍，每两天之间有显著差异，但9天后增殖减慢，第11天和第13天之间无明显差异。取第九天的细胞团HE染色，可见Matrigel中有细胞，细胞呈团块状分布，细胞之间互相排列成管腔样结构，细胞核蓝染，细胞质红染。细胞具有极性，围成管腔样结构，周围为单层排列的外泌汗腺上皮细胞，中央为圆形管腔。