来自甘薯的蔗糖诱导型启动子

摘要

本发明公开一种新的源自甘薯ADP－葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖诱导型启动子序列和5’非翻译区(SEQ ID NO：1)。本发明还公开一种使用所述序列的表达载体以及使用所述载体的转基因植物。根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中，尤其是在含有相对较大量的蔗糖从而能在植物中积累大量淀粉的植物贮藏根中进行高水平的蔗糖诱导型表达。因此，本发明可用于产生转基因植物，以在植物贮藏根中大量生产有用的蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物蔗糖诱导型启动子序列。更具体地说，本发明涉及一种源于甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)并且能够在植物中赋予高水平的蔗糖诱导型表达的植物蔗糖诱导型启动子序列。此外，本发明还涉及含有该启动子序列的植物蔗糖诱导型表达载体，以及涉及应用该启动子序列生产转基因植物。

背景技术

农作物分子育种技术使得采用所有物种的基因作为育种材料成为可能，也使得以基因水平替代原先的染色体组水平来精细地调节育种的作用成为可能。因此，它是引起下一代农业的核心技术之一。

为了最大限度发挥所述农作物分子育种技术的作用，必要的先决条件如下：

1)积累代表各种植物的基因的数据库；

2)建立用于各种农作物的转化体系；和

3)发展调节插入到植物中的外源基因的表达的启动子。

从20世纪80年代早期起，外国就已经开始研究调节植物基因表达的启动子。据认为，花椰菜花叶病毒的启动子能够在各种植物组织中诱导高水平的基因表达(Hohn等，1982，Curr.Topics Microbiol.Immunol.96：193-236)。

随后，鉴定出了该启动子的序列(Odell等，1985，Nature 313：810-812)。经证明，该启动子能够在植物中诱导高水平的基因表达(Sanders等，1987，Nucleic Acids Res.15：1543-1558)。其后，CaMV 35S启动子(专利号：JP1993192172-A1)成为植物中使用最为普遍的启动子。

自CaMV 35S获得鉴定以来，其活性在生物或非生物条件下提高的其它诱导型启动子得到了积极的研究。

尤其是，经蔗糖处理后活性提高的蔗糖诱导型启动子得到了积极的研究。当用于在植物贮藏器官组织(如含有由相对较大量的蔗糖合成的淀粉的贮藏根)中大量生产有用的医药和工业蛋白时，所述蔗糖诱导型启动子具有优势。所述有用的蛋白包括非常有价值并且昂贵的医药或工业蛋白，例如干扰素、生长激素、乳铁蛋白和植酸酶。

有关蔗糖诱导型启动子的研究集中于编码积累在贮藏器官组织中的贮藏蛋白的基因或者与淀粉合成有关的基因。

例如，patatin是马铃薯中的贮藏蛋白。据鉴定，蔗糖可以增强patatin基因启动子的活性(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J8，23-31；Wenzler等，1989a，Plant Mol.Biol.12，41-50；Wenzler等，1989b，Plant Mol.Biol.13，347-354)。也有报道该启动子的-344区的特异核苷酸序列(B序列)在蔗糖诱导中起到必不可少的作用(Grierson等，1994，Plant J，5，815-826)。

同时，在马铃薯中有两个蔗糖合成酶基因，即，Sus3和Sus4。据鉴定，在这两个基因中，Sus4通过蔗糖来表达(Salanoubat和Belliard，1989，GENE 84，181-185)。此外，据报道，Sus4基因启动子的-1500～-267区、3’非翻译区以及1612bp前导内含子对于蔗糖诱导是必不可少的(Fu等，1995，Plant Cell 7，1387-1394)。

再者，据鉴定，蔗糖可以增强玉米中的淀粉分支酶I(SBE1)基因启动子的活性，并且在相对于该基因的转录起始位点的-314和-145之间的序列对于蔗糖诱导是必要的(Kim和Guiltinan，1999，Plant Physiology 121，225-236)。

此外，据报道，蔗糖可以诱导甘薯中β-淀粉酶基因启动子的活性，并且相对于该基因的转录起始位点的-901和-820之间的序列对于蔗糖诱导是必要的。而且，其中的TGGACGG序列作为调节子起着重要的作用(Maeo等，2001，Plant Mol.Biol.46，627-637)。

同时，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶被认为是控制植物中的淀粉量的关键性调节酶。据报道，番茄和拟南芥(Arabidopsis)中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的启动子为蔗糖诱导型启动子(Siedlecka等，2003，Planta 217，184-192；Li等，2002，Plant Science 162，239-244)。此外，据报道，冈田酸(okadaic acid)可以降低拟南芥中的该启动子的活性，所述冈田酸是蛋白磷酸酶I和2A的抑制剂。

同时，在甘薯中有两个ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，即，ibAGP1和ibAGP2。据报道，蔗糖可以增强ibAGP1基因(以前该基因被称作ibAGP-sTL1)的表达(Bae和Liu，1997，Molecular Genetics and Genomics154，179-185)。已经分析和比较了上述两个基因的完整核苷酸序列，并鉴定了每一个基因的转录起始位点(Noh等，印刷中，GENE)。

但是，高效的蔗糖诱导型启动子的核苷酸序列还没有被报道过。因此，对于能够在植物中廉价、有效而大量地生产有用的外源蛋白方面起重要作用的蔗糖诱导型启动子的需求日益增加。

发明内容

(技术问题)

为解决上述问题以及满足上述需要，本发明的一个目的是提供一种蔗糖诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子源自甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)。

本发明的另一个目的是提供一种用于植物转化的蔗糖诱导型载体，该载体包含ibAGP1基因的指导高水平表达目标基因的蔗糖诱导型启动子序列和5’非翻译区。

本发明的又一个目的是提供一种经所述载体转化的转基因植物，该转基因植物能够在植物贮藏器官组织(如在贮藏根中)大量产生有用物质。

(技术方案)

为实现上述目的，本发明人克隆了甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体和瞬时表达载体，所述载体包含带有所述基因的5’非翻译区的上述启动子。发明人随后利用所述载体在贮藏根中诱导表达，并观察到该启动子与蔗糖诱导性相关的高水平活性，从而实现本发明。

因此，本发明提供包含SEQ ID NO：1序列的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖诱导型启动子区和5’非翻译区的分离的DNA序列。

上述启动子的DNA序列源自相对于SEQ ID NO：1中甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的转录起始位点的-1bp至-1908bp区(参见图1)。蔗糖可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。

上述非翻译区包含相对于SEQ ID NO：1中甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)转录起始位点的+1bp至+68bp的非翻译区(参见图1)。与其它报道的植物的5’非翻译区一样，本发明所述的非翻译区能够通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力而诱导目标基因的高水平表达。

为实现另一个目的，本发明提供一种用于植物转化的蔗糖诱导型载体(pSPagp1-101)和瞬时表达载体(pSPagp1-221)，所述载体包含甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的指导在植物中进行高水平表达的植物蔗糖诱导型启动子和5’非翻译区。

上述用于植物转化的蔗糖诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。上述瞬时表达载体是指能够在植物中瞬时表达外源基因的载体。

所述二元载体可以是任何包含T-DNA(转移DNA)的RB(右边界序列)和LB(左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)Ti质粒存在下转化植物的二元载体。优选地，该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如pBI101(编号：6018-1，Clonetech，美国)、pBIN(基因库(Genbank)登录号：U09365)、pBI121、pBIN20或BIBAC载体。

关于本发明所述的用于植物的蔗糖诱导型载体(pSPagp1-101，pSPagp1-221)，本发明所述的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的启动子和5’非翻译区在pBI101和pBI221中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体(pBI101和pBI221)中而制得的pSPagp1-101和pSPagp1-221(参见图2和图3)。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来替代。

本发明提供一种应用本发明所述的蔗糖诱导型二元载体的转基因植物。此外，本发明还提供一种应用本发明所述的瞬时表达载体进行瞬时转化的贮藏根。

植物能够通过使用例如根癌农杆菌(An，G.1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物蔗糖诱导型二元载体进行转化。在本发明中，例如拟南芥可以通过花浸法(floraldip method)(Clough和Bent，1998，Plant J.)进行转化。根据本发明，植物贮藏根能够通过瞬时表达载体和粒子轰击法进行瞬时转化。不管农作物的类型如何，本发明的瞬时表达载体都能够对其贮藏根进行转化。农作物的例子包括胡萝卜等。

上述外源基因可以是打算在植物贮藏器官组织中大量表达的任意基因，所述贮藏器官组织含有相对较大量的蔗糖以在植物中积累大量的淀粉。而且，在本发明所述的植物蔗糖诱导型载体中，外源基因的位置在紧接于甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的启动子和5’非翻译区之后，并且如果需要，该外源基因可以以与报告基因融合的形式表达。

本发明提供适用于扩增本发明所述的植物蔗糖诱导型启动子的DNA片段的SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：5的PCR引物。

(有益效果)

本发明提供来自甘薯(Iomoea batatas)的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖诱导型启动子和5’非翻译区。根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物进行蔗糖诱导型表达，尤其是使得能够在含有相对较大量的蔗糖以在植物中积累大量淀粉的植物贮藏根中进行高水平表达。

因此，本发明可用于产生转基因植物以在植物贮藏根中大量生产有用蛋白。所述有用蛋白包括非常有价值并且昂贵的医药或工业蛋白，例如干扰素、生长激素、乳铁蛋白和植酸酶。

附图说明

本发明的上述及其它目的、特征和其它优点将会从下面结合有附图的详细描述中更清楚地得到理解，其中：

图1显示本发明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的植物蔗糖诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列；

图2显示用于植物转化的二元载体(下文中称作‘pSPagp1-101’)的图示，该二元载体包含本发明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的植物蔗糖诱导型启动子和5’非翻译区的序列；

图3显示瞬时表达载体(下文称作‘pSPagp1-221’)的图示，该载体包含本发明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的植物蔗糖诱导型启动子和5’非翻译区的序列；

图4显示由pSPagp1-101转化的拟南芥经组织化学染色后观察到的各组织的GUS表达模式；

图5显示由pSPagp1-101转化的拟南芥经蔗糖处理后的GUS定量分析结果；和

图6显示使用本发明所述的pSPagp1-221对胡萝卜主根进行瞬时分析的结果。

具体实施方式

下面的实施例将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。应该理解，尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。本发明的其它方面对于与本发明有关领域的技术人员来说是显而易见的。

实施例1：甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖诱导型启动子的克隆

甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的启动子在甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1，Noh等，GENE，2004，339，173-180)的5’区序列中得到鉴定。

所克隆的1908bp序列的启动子登录在NCBI GenBank(登录号：AY694185，图1)中。图1显示本发明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的植物蔗糖诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在图1中，蛋白合成的起始密码子‘ATG’带有下划线，并以黑体显示，而且翻译起始位点的碱基‘A’用‘+1’示出。

实施例2：植物蔗糖诱导型载体和瞬时表达载体的构建

将在实施例1中所克隆的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的启动子和68bp的5’非翻译区(SEQ ID NO：1，图1)插入到pBI101或pBI221(Clonetech)中，从而分别构建植物蔗糖诱导型载体或瞬时表达载体。

更具体地说，在构建植物蔗糖诱导型载体的情况中，通过PCR扩增在实施例1中所克隆的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的启动子和68bp的5’非翻译区(SEQ ID NO：1，图1)，并用SalI和BamHI消化。然后将它们插入pBI101的SalI和BamHI位点。该载体被称作pSPagp1-101(参见图2)。上述PCR所用的引物详细显示在表1中。

对于PCR扩增，在94℃孵育4min(分钟)之后，使用以下的循环参数：30个循环[94℃，1min；55℃，1min；和72℃，1.5min]。然后将该反应在72℃孵育10min。

表1

 5’引物  5’-CGAGTCGACACTGATACTTTGGTGACT-3’  SEQ ID NO：2 3’引物  5’-TGCGGATCCTTTTAAGCCGCGCTACCA-3’  SEQ ID NO：3

在图2中，GUS是编码β-葡糖醛酸酶的报告基因，选择标记为卡那霉素。此外，Nos-pro代表NPTII的启动子，而Nos-ter代表它的终止子。该GUS报告基因通过植物中插入的Nos(胭脂碱合成酶)的启动子和终止子(Nos-ter)而表达。

在构建植物蔗糖诱导型瞬时表达载体的情况中，通过PCR扩增在实施例1所克隆的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的启动子和68bp的5’非翻译区(SEQ ID NO：1，图1)，并用SphI和BamHI消化。然后将它们插入pBI221的SphI和BamHI位点。该载体被称作pSPagp1-221(参见图3)。上述PCR所用的引物详细显示在表2中。

对于PCR扩增，在94℃孵育5min之后，使用以下的循环参数：30个循环[94℃，1min；58℃，1min；和72℃，1.5min]。然后将该反应在72℃孵育5min。

表2

 5’引物  5’-CGCGCATGCACTGATACTTTGGTGACT-3’  SEQ ID NO：4 3’引物  5’-TGCGGATCCTTTTAAGCCGCGCTACCA-3’  SEQ ID NO：5

实施例3：使用在实施例2中所构建的pSPagp1-101载体转化拟南芥

通过冻融法(An，G.1987，Methods in Enzymology)，将在实施例2中构建的pSPagp1-101载体转移到根癌农杆菌C58C1中。

在28℃将经转化的农杆菌在振荡培养箱中培养2天，然后使用花浸法(Clough和bent，1998，The Plant Journal)接种到刚到开花期之前的拟南芥哥伦比亚栽培变种(cv.Columbia)的雌蕊上以产生转化的拟南芥植物。

实施例4：转化拟南芥的组织化学法染色和酶学分析

收获实施例3中拟南芥转化体的种子并置于含有30mg/L卡那霉素的MS生长培养基上以筛选抗性转基因植物。

用组织化学染色方法和酶学方法定量检测经筛选的拟南芥转化体的所有组织的GUS活性。为了对转化植物的所有组织进行染色，将各组织浸在含有1mM G-glu(5-溴-4-氯-3-吲哚-β葡糖苷酸)、100mM磷酸钠(pH7.0)、10mM EDTA、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾和0.1％TritonX-100的溶液中，并在37℃反应12小时。除去溶液后，用一系列的乙醇(70％～100％)清洗以去除组织中含有的叶绿素。

如图4所示，在用pSPagp1-101转化的拟南芥的叶子、韧皮部、花柄、以及根部顶端分生组织中鉴定到高水平的GUS活性，在花粉中鉴定到低水平的GUS活性。

实施例5：鉴定本发明所述的蔗糖诱导型启动子(ibAGP1启动子)的活性

为鉴定ibAGP1启动子的蔗糖诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J.6：3901-3907，1987)的方法对蔗糖处理过的转化拟南芥的GUS活性进行定量测定。

更具体地说，将拟南芥转化体的种子播种在含有0.5％、3％和6％蔗糖的MS生长培养基上并培养14天。

然后收获所培养的幼苗，用含有50mM磷酸钠(pH7.0)、10mMEDTA、0.1％Triton X-100、0.1％月桂酰肌氨酸钠和10mM β-巯基乙醇的溶液进行研磨，并以12,000×g离心，以获得上清液。

将所得的上清液在37℃与1mM MUG(4-甲基伞形基葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl glucuronide))进行反应。通过加入0.2M Na₂CO₃来终止反应。用荧光计在365nm和455nm处检测所得反应溶液的荧光。通过将反应溶液的荧光与MUG标准溶液的正态曲线进行比较来分析拟南芥转化体的GUS活性并显示在图5中。

通过分析12棵经各蔗糖浓度处理的转化体(T2系植物)而获得了如图5所示的GUS活性。为了比较，一起检测了没有启动子的pB101载体和带有CaMV35S启动子的pB121(Clonethch，美国)。结果表明，ibAGP1基因启动子的GUS活性在用3％蔗糖处理后提高了8倍，在用6％蔗糖处理后提高了11倍。此外，ibAGP1基因启动子的GUS活性相对于通用启动子CaMV35S，其活性增加了12～15倍。

实施例6：鉴定胡萝卜主根中蔗糖诱导型启动子(ibAGP1启动子)的活性

为鉴定植物贮藏根中的蔗糖诱导型启动子(ibAGP1启动子)的活性，用实施例2中构建的pSPagp1-221进行瞬时分析法。

更具体地说，取生长和增大阶段的胡萝卜主根并清洗。然后将主根横切成5mm厚，并在4℃将其置于培养皿中充分润湿的3MM纸上4小时～5小时。

根据Sanford等(1993，Meth Enzymol 217：485-509)的方法，混合DNA并将其包被在直径为1.0的金粉粒子上。在这种情况中，使用以下的轰击条件：[1.0DNA/轰击，1,350PSi(磅/平方英寸)的氦气压力和与胡萝卜的距离为6cm]。

轰击之后，将它们在25℃置于黑暗中24小时，并进行组织化学染色以鉴定GUS活性。为了对切下的胡萝卜主根进行染色，将它们浸泡在含有1mM溶于DMSO(二甲亚砜)的X-glu(5-溴-4-氯-3-吲哚-β葡糖苷酸)、100mM磷酸钠(pH7.0)、10mM EDTA、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾和0.1％Triton X-100的溶液中，并在37℃反应24小时。

除去溶液后，用70％乙醇冲洗切下的主根24小时，然后置于定期更换的100％乙醇中数天以除去组织中含有的花青苷色素。

如图6所示，经鉴定，pSPagp1-221在所有胡萝卜主根组织中显示高水平活性，尤其是该活性与主根直径成比例地提高(随蔗糖含量成比例地提高)。

如果综合考虑上述结果，可以说本发明所述的启动子在具有高蔗糖含量的植物贮藏器官组织中显示出高水平的活性。

工业实用性

如上所述，本发明提供甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖诱导型启动子和5’非翻译区。

本发明提供通过分别将启动子和5’非翻译区插入至pBI101或pBI221中而制备的植物二元载体和瞬时表达载体。

经使用所述的二元载体和瞬时表达载体进行鉴定，本发明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的启动子和5’非翻译区使得能够进行蔗糖诱导型表达，尤其是使得能够在含有相对较大量的蔗糖从而在植物中积累大量淀粉的植物贮藏根中进行高水平表达。因此，本发明可用于产生转基因植物以在植物贮藏根中大量生产有用的蛋白。本发明还可用于诸如使用转化体的贮藏根代谢工程领域或功能性物质生产领域等的研究。

序列表

<110>高丽大学校产学协力团

<120>来自甘薯的蔗糖诱导型启动子

<130>FCI06KR1525

<150>KR 10-2004-0070820

<151>2004-09-06

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1979

<212>DNA

<213>Ipomoea batatas cv Yumli

<400>1

actgatactt tggtgactgc attgtgtttg ggtcttgcca aatctattga gggaggggaa  60

gaaagtagaa gtgtcaggga ttggtgtgtg gtggggtttc caaagtttcc ctcttttcct  120

ttcttattct tagtttgctc gtcataagtg tcagggattg gtaaccaata gaaatctcat  180

ctttaaccta tatgtatgtt ctagtatcat aattaagctc ttactcaaag gaatgttcca  240

tttaggtcat ttttaatgtc tatcaattga tcatttcaag taaacaaaac tctggctcta  300

atgctgggac tttggtttct ttattatgca gtnttatggg ataaaggttg gttatggtgg  360

catcccgggg ccatcaatcg gaagagatgg agctcctgct ccaggagggg gttgctgcag  420

ctgaaaatgg gacgtaattt cttttgagta aatgcttgtt tcattgtnaa ttcgtgacta  480

attgttcttt gtttttcaat tgttcaaaag cttactatgt atacgtggtg tataatgtaa  540

tacaacagcc agcattagga tgnaatagag gtttcaaatt aaactcaacc agaatcctgc  600

ttatttcgag aattactacc attctcaaaa aataaataaa taaatcatga gatgtgttga  660

tataaataaa taaatcatga gatgtgttga acgctcttca agtttttcac agttgtatga  720

ataatgacga gcacatgata gttagagaac ttaggagcat tgaatctggt gcttgggctg  780

atcgatttat ggcatgatgc agtgcattca ctgtatagcg tgtgattgca ggcattagat  840

cttggtttat ggtctgcatt tcacgtgggg tgaccatttt gtgccgtttc cgtcagccac  900

ttaaatggac caacatcccc tgaggaagac ctgcaaattc agacttagac acactaatta  960

taggggcata tgatattatg attggataat ggctgatgaa attttcagcc gttaattcta  1020

aacaataaac agtatggcgg tctatgaatg ataacgatct ttaagctgaa gatgggcaaa  1080

acaatatgga tcgtctacta gtatttgtct ctttccctat cctgcttgtc tacaccacaa  1140

tactaaagac caaaacttga gtgactgaga gaaatatgca ttcattatcc gagtctgtat  1200

catgtaaatt ttatcttgta attttaacta ataaaaaatc aggagaaaat cagcctaaat  1260

tatttatagc tcataactta ctagttcaga ctaagaagac taataaaaca tccccgttac  1320

aaaattaaca ttttgactaa cttgtaacgt ttgcatggtc agaaacagga tacaccaact  1380

ttggttgtga tgatgatatc atatcataaa caaaccctcc aaaaagtcac ttgcaaggtg  1440

gcactttgcg acagaccacc atgcttaatt gctcataatc agctaaacta ttattattac  1500

tttataaaat attttcgccc catatcatat aatttggcca ataatatatc attttatctg  1560

tcttacttat tatttattaa ttacataaaa tgaaacggaa tgaataacat aaataatata  1620

aagatatact ccgtataagt aacggtgcaa aggagccgat tagatatttt cagtaatcac  1680

aagtcacatg tgatcatatc atgtgtattt ttcatataaa ataaaactag tataccccac  1740

cctgattttt gctctaaact tccaaatata cccttggtca cgcaaatgct agccgctggt  1800

ttggaagggc aaaccgtaaa tgttgacaaa ttctttggca attaggtaat aggtgtcacc  1860

tatttgaaca cttactataa aaggacgcct agtttctgtc caaatttcaa cagaatcact  1920

cgcttccaca cactccaaag tccgcagaga gctcagagtg gtagcgcggc ttaaaaatg   1979

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>2

cgagtcgaca ctgatacttt ggtgact                                      27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

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tgcggatcct tttaagccgc gctacca                                      27

<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>PCR引物

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cgcgcatgca ctgatacttt ggtgact                                      27

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

tgcggatcct tttaagccgc gctacca                                      27