一种用于防治牛子宫内膜炎的溶葡萄球菌酶冻干粉剂

摘要

本发明公开了一种溶葡萄球菌酶冻干粉剂的配方和组成，该冻干粉剂由溶葡萄球菌酶、牛血清白蛋白、甘氨酸、甘露醇、磷酸盐所组成。本发明还公开了这种溶葡萄球菌酶冻干粉的制备方法。本发明公开的溶葡萄球菌酶冻干粉剂可用于治疗奶牛急，慢性子宫内膜炎；奶牛产后净化子宫，防止或减少炎症的发生，能促进子宫黏膜修复，加强子宫收缩，消除炎症，增强自净能力，改善子宫内环境，加速产后子宫的修复，有利于内分泌的协调，提高受胎率。本发明公开的溶葡萄球菌酶冻干粉剂还可以用于其他动物如宠物的皮肤粘膜感染的防治。

说明书

技术领域

本发明涉及冻干生物制剂，具体涉及溶葡萄球菌酶冻干粉剂

背景技术

子宫内膜炎是奶牛的常见病之一，奶牛产后发生子宫内膜炎可造成子宫复旧时间延长，使发情周期紊乱。炎性渗出物可改变子宫内环境的酸碱度，不利于精子和卵子的生存，使受胎率下降，导致不孕，同时还可长期刺激子宫内壁感受器，通过反射，使激素调节失调，引起卵巢疾病。另外还可继发乳房炎，蹄叶炎等。

奶牛子宫内膜炎的发病率在15-20％之间，其中多数发生于产后。在英国，奶牛不孕症有95％是由子宫内膜炎引起的，而美国因不孕症带来的损失也高达2.5亿美元。引起子宫内膜炎的病原菌较多，主要有葡萄球菌，链球菌和大肠杆菌等。目前世界上治疗子宫内膜炎均使用抗生素，但是抗生素治疗存在许多不利因素。如(1)容易使细菌产生耐药性；(2)单一药物抗菌谱不广；(3)容易造成抗生素残留；(4)其它副作用。近年来由于抗生素的大量使用，耐药菌株不断出现，尤其是金黄色葡萄球菌对多种抗生素产生耐药性，且耐药性呈明显上升趋势，难于治疗。欧美国家早在40多年前就投入大量人力、物力研究替代抗生素的药物但至今尚无明确结果。

中医、中兽医学应用天然药物(中草药)来治疗人类和动物的疾病，现被誉为天然医学。如CN1302634A(治疗子宫炎症的药)，但是由于中药的药效作用慢，以致病情迁延不愈，或反复发作，因而临床使用效果并不好。

US 4692452(Method for treatment of endometritis in mammalian females)，报道了用化学制剂治疗动物(尤其是奶牛)的子宫内膜炎，但是化学制剂往往对子宫内膜具有刺激性，会造成子宫内膜纤维化，以致于形成疤痕，不利于奶牛进一步的配种受孕。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种预防和治疗牛子宫内膜炎的溶葡萄球菌酶冻干粉剂，以克服现有技术的不足。

本发明需要解决的技术问题之二是提供该种溶葡萄球菌酶冻干粉剂的制备方法。

本发明的发明构思是这样的：

溶葡萄球菌酶是一种革兰氏阳性菌的溶菌素。组成该类革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)细胞壁肽聚糖的四肽侧链的氨基酸，依次为L-丙氨酸，D-谷氨酸，L-赖氨酸，D-丙氨酸：而首位的L-丙氨酸通过一个酰胺键与胞壁酸相连，该聚糖链四肽侧链第3位的L-赖氨酸，通过五肽(五个甘氨酸)交联桥联结到相邻聚糖链四肽侧链D-丙氨酸羧基上。由此纵横交叉，左右联结构成十分坚韧的三维立体多孔结构，并聚合成较厚的肽聚糖层。

溶葡萄球菌酶可切断肽聚糖中的GIy-GIy键，由于溶葡萄球菌酶独特的杀菌机理，使其不同于一般的抗生素。抗生素的作用一般是抑制细菌生长，促使细菌产生新的耐药质粒或新酶来阻止抗菌素的作用。而该酶则是迅速裂解细菌杀死细菌，作用时间短，细菌不容易产生耐药性，同时杀菌效果好，对耐甲氧苯青霉素(MRSA)的金黄色葡萄球菌同样有较强的杀菌能力。

1991年，美国普林斯顿Cyanamid公司农业研究所的Oldham ER等用溶葡萄球菌酶治疗耐药性金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎，证明了溶葡萄球菌酶对于治疗此病的有效性。次年他们又研究了局部使用重组溶葡萄球菌酶治疗奶牛乳腺炎时引起体内的免疫反应，认为重组溶葡萄球菌酶作为体内注射剂是有效和安全的，并提出溶葡萄球菌酶可以替代传统的抗生素。

因此，本公司在多年研究溶葡萄球菌酶的基础上，根据牛子宫内膜炎的特点，开发出了用于预防和治疗子宫内膜炎的重组溶葡萄球菌酶冻干粉制剂，可以克服现有技术存在的杀菌效果不理想，特别是对耐药性金黄色葡萄球菌杀菌效果不理想的缺陷，同时，也可以克服细菌易产生耐药性，易产生药物蓄积和残留，病情易反复发作并影响后续的受孕配种的问题。

同时，我们发现溶葡萄球菌酶在溶液状态时或者在有大量游离水存在下，该酶稳定性较差，难以长期稳定保存。相反，如果将该酶冷冻干燥后密封低温可以长期保存而不损失生物活性，因此，我们选择该酶为冻干剂型，这也是生物技术产品常用的剂型。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种种溶葡萄球菌酶冻干粉剂，组成及重量百分含量为：溶葡萄球菌酶0.1％～10％；牛血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸盐1％～50％。

其中所述及的磷酸盐为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钠。

一种溶葡萄球菌酶冻干粉剂，其组成及重量百分含量为：溶葡萄球菌酶0.1％～10％；牛血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸二氢钾1％～30％；磷酸氢二钠1％～50％。

本发明还提供溶葡萄球菌酶冻干粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)称取固体磷酸盐，配制磷酸盐缓冲液A；

(2)称取甘氨酸、甘露醇，量取牛血清白蛋白，加入部分的溶液A中，溶解，得到溶液B；

(3)量取溶葡萄球菌酶原液，加到溶液B中，补加溶液A至终体积，得到溶葡萄球菌酶的半成品溶液；

(4)无菌操作，用微孔滤膜正压过滤已经配制好的溶葡萄球菌酶半成品溶液，贮存于2～8℃；

(5)将微滤完的溶液分装到容器中，同时加半塞，冻干。

本发明公开的溶葡萄球菌酶冻干粉剂具有如下特点：

1、杀菌效果强。该制剂对革兰氏阳性菌尤其是金黄色葡萄球菌，具有很强的杀菌作用。体外实验作用5分钟即可达到99.9％的杀菌率，如果作用10分钟甚至20分钟，可使杀菌率达到100％，见表1。

2、稳定性强。本品在冻干状态下4～8℃低温保存6个月，25℃常温保存6个月，生物活性基本没有改变。本品在4～8℃可以保存2年。本品加入溶媒溶解后，可以存放1月而生物活性不下降。

3、本发明为纯生物制剂，克服了传统化学类制剂对子宫粘膜具有刺激性，细菌容易产生耐药性的缺点。易被机体所接受，且没有任何毒副作用。

4、本制剂采用局部用药的方式，较常用的全身性治疗具有治疗作用快，毒副作用小的特点，且使用方便，易于被兽医和奶牛所接受。

5、本发明的制剂不仅可用于预防和治疗奶牛的子宫内膜炎，还可以用于预防和治疗奶牛或其他动物的阴道炎、口蹄疫、口腔炎、皮肤溃疡、皮肤外伤、全身性感染、外耳道炎症等细菌感染性疾病。

                 表1对金黄色葡萄球菌的杀灭效果

  稀释浓度  (％)  作用不同时间(min)的平均杀灭率及范围  2  5  10  20  原液   50   25   99.83  (99.82-99.84)  99.25  (99.19-99.31)  98.05  (97.80-98.30)  99.97  (99.96-99.98)  99.83  (99.82-99.84)  99.34  (99.31-99.38)  100   99.92  (99.90-99.94)  99.70  (99.68-99.71)  100   99.99  (99.99-100)  99.96  (99.95-99.98)

注：原液酶浓度为400u/ml；

阳性对照组平均菌数及范围为7.25×105cfu/片(7.15-7.35×105cfu/片)；

阴性对照组：中和剂、PBS、培养基无细菌生长。

本发明公开的溶葡萄球菌酶可用于治疗奶牛急，慢性子宫内膜炎；奶牛产后净化子宫，防止或减少炎症的发生，能促进子宫黏膜修复，加强子宫收缩，消除炎症，增强自净能力，改善子宫内环境，加速产后子宫的修复，有利于内分泌的协调，提高受胎率。

临床使用时，将每瓶药物溶解于250ml无菌蒸馏水或无菌纯净水中，视病情轻重，每次子宫灌注100-250ml，每隔3天灌注1次。

具体实施方式

                实施例1溶葡萄球菌酶冻干粉的制备

1、组成和配比

溶葡萄球菌酶0.4％；牛血清白蛋白10％；甘氨酸30％；甘露醇10％；磷酸二氢钾15％；磷酸氢二钠30％。

2、配制半成品

称取固体KH₂PO₄和Na₂HPO₄.12H₂O，配制0.2mol/L磷酸盐缓冲液A(pH值6.5磷酸盐缓冲液，浓度为0.2M)。按照制剂处方，称取所需的甘氨酸、甘露醇，量取所需体积的牛血清白蛋白，加入到部分A溶液中，搅拌并使溶解，得到溶液B。量取重组溶葡萄球菌酶原液，加到溶液B中，使最终溶液中重组溶葡萄球菌酶生物活性为400U/ml，补加A溶液至终体积，此时得到的是重组溶葡萄球菌酶的半成品溶液。

3、微滤除菌

无菌操作，用孔径为0.22um的微孔滤膜(PALL公司)正压过滤已经配制好的重组溶葡萄球菌酶半成品溶液，贮存于2～8℃。

4、分装

用液体灌装机将微滤完的半成品溶液分装到容量为15ml的管制西林瓶中，每瓶分装溶液1.0±0.1ml，同时加半塞。

5、冻干

分装完毕后，将西林瓶送入冷冻干燥机进行冻干。冻干过程分为预冻阶段、主干燥阶段、最后干燥阶段。

        实施例2兔皮下注射外用重组溶葡萄球菌酶重复给药毒性试验

1、实验目的

本实验目的是通过兔皮下注射外用重组溶葡萄球菌酶，观察兔出现毒性反应性质、程度、发展和恢复情况，为临床安全用药的剂量设计和临床毒副反应监测提供参考资料。

2、实验方法

新西兰白兔24只，体重2.5～3.0kg。外用重组溶葡萄球菌酶设3个剂量组，给药剂量分别为100、20及4mg.kg^-1(相当于241936、48387和9677U·m^-2)，溶剂对照组(0.9％氯化钠注射液)，皮下注射量为1mg.kg^-1。每周连续给药7天，共给药4周。

3、实验结果

给药后各组动物的一般行为活动和食量正常。体重、心电图及食物消耗量与溶剂对照组比较无显著差别。给药第14天100mg.kg-1组血清中抗体与溶剂对照组相比有明显增高(p＜0.01)。第28天时各剂量组与溶剂对照组相比较，血清中抗体含量均显著增高(P＜0.01、P＜0.05)。与溶剂对照组相比较有非常显著性差异(p＜0.01)。恢复期结束时，各剂量组家兔血清中抗体水平有下降趋势。13项血液学指标、4项凝血指标、18项血液生化指标、10项尿液指标中的个别项目与溶剂对照组相比较有统计学差异，但无特殊的毒理学意义。组织病理学检查未见与给药有关的毒性病理改变。

4、实验结论

综上所述，在本次试验条件下，外用重组溶葡萄球菌酶给药剂量为241936、48387和9677U·m-2剂量组时，对新西兰兔无给药有关的毒性表现。在相当于人拟用剂量4～100倍时对新西兰兔无毒性作用。安全剂量大于241936U·m^-2。外用重组溶葡萄球菌酶未经消毒滤菌等措施直接皮下注射会引起局部炎症反应。

                实施例3溶葡萄球菌酶冻干粉稳定性试验

1、试验器材

试验菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC6538)；

中和剂：0.5％硫代硫酸钠、2％吐温-80、0.5％卵磷脂的PBS；

磷酸盐缓冲溶液(PBS0.03mol/l pH7.2)。

2、试验方法

将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液。

取被试样片(2.0cm×3.0cm)和对照样片(与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理)各4片，分成4组置于4个灭菌平皿内。

取上述菌悬液，分别在每个被试样片和对照样片上滴加100μL，均匀涂布，开始计时，作用2、5、10、20min，用无菌镊分别将样片投入含5mL相应中和剂的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2～3个稀释度，分别吸取0.5mL，置于两个平皿，用凉至40～45℃的营养琼脂培养基(细菌)或沙氏琼脂培养基(酵母菌)15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35±2℃培养48h(细菌)或72h(酵母菌)，作活菌菌落计数。

试验重复3次，按式(C1)计算杀菌率

        X₃＝(A-B)/A×100％

式中：X₃——杀菌率，％；

A——照样品平均菌落数；

B——被试样品平均菌落数。

3、试验结果

从表2可以看出溶葡萄球菌酶冻干粉在25℃存放6个月后对金黄色葡萄球菌杀灭活性没有发生变化。

                 表2  25℃存放6个月后对金黄色葡萄球菌杀灭效果

  保存温度  及时间   (℃、月)  对照组平均菌落数  及范围   (cfu/片)  作用不同时间(min)平均杀灭率及范围(％)   2   5   10   20   25 6   5.80×10⁵ (5.70-5.90×10⁵)  99.69 (99.69-99.70)  99.93 (99.93-99.94)  99.98 (99.97-99.99)  100 

注：阴性对照组无细菌生长。

         实施例4溶葡萄球菌酶对奶牛子宫内膜炎的作用效果

1、慢性子宫内膜炎病牛症状

以阴道排出脓性分泌物为主要临床症状，病牛从阴门排有灰白色或黄褐色稀薄脓液，故在尾根、阴门及飞结处粘有阴道排出物或干痂。阴道检查可见阴道黏膜和子宫腹部充血，子宫颈肿胀、松弛张开，宫颈口附有脓性分泌物；直肠检查发现子宫角增大，收缩反应微弱，缺乏弹性，宫壁增厚变硬，子宫蓄积炎性分泌物时，则有轻微波动感。

2、试验药物

溶葡萄球菌酶冻干粉(宫内灌注剂)：400U；土霉素碱；利凡诺。

3、试验方法

在奶牛繁殖年度，选择分娩后20～40天确诊患有慢性子宫内膜炎的奶牛供试验用，根据治疗顺序，将其随机分为“溶菌酶”组和“利土剂”组。

溶葡萄球菌酶组：每瓶药物溶解于250mL无菌纯化水或无菌纯净水中，每次子宫灌注100-250ml，每隔3天灌注1次。

利土剂组：利土剂药液100mL(利凡诺0.5g、土霉素碱2g溶于100mL生理盐水中)直接注入子宫内，隔日1次，连续3～4次为1个疗程。

4、治疗效果判定标准

治愈：阴道排出的黏液透明无异味，其他临床症状消失，恢复正常发情周期，且配种后2～3个月直检确定妊娠。

有效：子宫明显软化，收缩性强，其他症状减轻，但发情配种后未妊娠。

无效：与治疗前比较无明显变化。

5、试验结果

    表3  溶葡萄球菌酶组与利土剂组治疗效果比较

  组别    治疗  例数  治愈  例数  有效  例数  无效  例数  治愈率/％   溶葡萄  球菌酶  利土剂  100   105  94   71  5   26  1   8  94.0   67.6。

从表可以看出，用溶葡萄球菌酶治疗奶牛子宫内膜炎(以慢性脓性和卡他性脓性为主)效果比传统的利土剂治疗法有明显提高，治愈率前者比后者提高26.4个百分点，经卡方检验，差异显著(P＜0.05)。