一种聚乳酸基/纳米羟基磷灰石复合生物材料及其制备方法

摘要

本发明公开一种具有生物活性的聚乳酸基/纳米羟基磷灰石(NHA)复合材料及其改性方法。通过在聚乳酸基/纳米磷灰石复合材料表面进行胺解引入活性反应基团－NH2，然后通过戊二醛固定，最后接枝活性多肽精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(Arg－Gly－Asp)RGD，使其成为一种具有生物特异性的材料，从而构建具有良好细胞和生物相容性的材料表面和界面。

说明书

技术领域

本发明属高分子材料技术领域和生物医学工程技术领域，具体涉及一种具有生物活性的聚乳酸基/纳米羟基磷灰石复合材料及其制备方法。

背景技术

聚乳酸材料的突出优点是具有良好的生物相容性、可降解性和比较适中的机械性能，在修复医学及药学领域也受到关注。但是由于聚乳酸材料本身的化学结构简单，表面的疏水性强，与细胞亲和力差，所含的化学活性基团少，更不具有组织工程研究中所需的对细胞黏附、生长起调节作用的细胞信号，因而它仅仅只能作为一种普适性的惰性材料在各个领域中应用。而在许多组织工程领域，希望支架材料能够识别不同的细胞，有选择性地吸附某些种子细胞并能促进这些细胞的生长、增殖和向希望的方向分化。为克服聚乳酸的上述缺点，各种方法被用于对聚乳酸改性。

通过选择含有功能基团的环状单体与丙交酯(LA)或乙交酯/丙交酯(LA/GA)开环共聚可得到这类新型材料，其中聚乳酸/氨基酸共聚物是其中典型的代表。Langer^[1]及其同事在这方面已作了大量的工作，他们合成了不同氨基酸(天冬氨酸、赖氨酸、半肽氨酸)的聚乳酸共聚物，并证实通过共聚物的侧功能基团接枝活性多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)(RGD)，可以促进细胞的粘附和不同细胞的识别。这类将具有细胞识别信号的生物活性肽链引入高分子聚合物，尤其是将肽链引入到聚(α-羟基酸/α-氨基酸)类材料将是用于人体组织工程极具发展前景的方向之一，但是这类生物活性材料的缺点是合成路线比较复杂，成本较高。

另外一种方法就是在聚合物表面固定生物活性物质。部分生物活性物质为蛋白质类或多肽类，因此生物活性物质的固定主要是蛋白质的固定问题。在惰性的聚合物表面化学固定蛋白质通常分三步，第一步为聚合物表面反应性基团如-OH、-COOH、-NH₂等的引入，第二步为反应性基团的活化，第三步为活化后的反应性基团和蛋白质的反应。

RGD肽是由精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)3个氨基酸组成的短肽。分子式为：

RGD肽在肿瘤治疗中的应用非常广泛，具有直接杀伤肿瘤细胞和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，而且是许多细胞外基质蛋白(如胶原等)的最小识别短肽序列，也是粘附蛋白与细胞表面特意受体蛋白相互作用的识别位点。这一短短的三肽作为一种重要的细胞识别位点与信号启动分子，在许多生命活动中发挥着重要的调节功能，因此将RGD接枝到聚乳酸材料表面是一种比较简单的改善聚乳酸表面生物活性的方法。

羟基磷灰石(HA)是自然骨的结晶部分，它无毒、无致畸和致癌等副作用，具有良好的生物相容性和骨传导性，能够与骨直接形成键性结合，诱导细胞生长和分裂，产生骨基质胶原，形成骨组织。但是HA的质地太脆，制成的材料容易碎裂，机械性能不佳，没有足够的强度和疲劳承受力；将聚乳酸与HA复合，采用合适的方法制备得到骨组织工程支架材料，聚乳酸基/HA复合支架材料既能够提高聚乳酸的力学性能和引导成骨特性，又能对HA的生物降解具有控制作用，保证骨组织恢复速度与材料降解速度一致。

本发明拟通过对聚乳酸基/纳米羟基碳灰石复合材料的表面进行改性，在其表面引入-NH₂等活性基团，然后通过在聚乳酸基/纳米羟基碳灰石复合材料表面接枝RGD，使复合材料具有细胞识别功能。

[1]Elisseeff J，Anseth K，Langer R，et al.Synthesis and characterization ofphoto-cross-linked polymers based on poly(L-lactic acid-co-L-aspartic acid)[J].Macromolecules，1997，(30)：2182~2184

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有生物活性的聚乳酸基/纳米羟基磷灰石复合材料及其制备方法。

本发明提出的具有生物活性的聚乳酸基/纳米羟基碳灰石复合材料，是通过在复合材料表面进行胺解引入活性反应基团-NH₂，然后通过戊二醛溶液固定，最后接枝活性多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)RGD，而得到的具有生物特异性的材料，它具有良好细胞和生物相容性的材料表面和界面。

本发明中聚乳酸基/纳米羟基磷灰石复合生物材料，是由聚乳酸类聚合物(如聚L-乳酸(PLLA)，聚D，L-乳酸(PDLLA)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)之一种)同一种改性的纳米羟基磷灰石按照100∶1～100∶30(羟基磷灰石为也可以小于1，直至为0，为0时，为纯的聚乳酸类聚合物)的重量比例组成，聚乳酸类聚合物与改性纳米磷灰石较优的重量配比为100∶5-100∶25。该复合材料包括复合膜材料和复合支架材料。复合膜材料是通过溶剂浇铸-溶剂挥发法制备获得，而复合支架材料包含用粒子析出法、热致相分离法、气体发泡法、超临界CO₂法等制备获得。

本发明中涉及的聚乳酸类聚合物其重均分子量为50,000～200,000。

本发明中改性的纳米羟基磷灰石，在室温下由化学共沉淀法制备获得，透射电子显微镜(TEM)结果显示其为半径为30～50nm的球形，然后使用L-丙交酯或者L-丙交酯和乙交酯按照摩尔比75∶15～95∶5的混合物在二甲苯溶液中接枝聚乳酸类聚合物，聚合温度为100～130℃，回流冷凝、氮气保护下进行8～24h，得到改性纳米羟基碳灰石。改性的纳米羟基磷灰石因其表面接枝了聚乳酸类聚合物，提高了羟基纳米羟基磷灰石同聚乳酸类聚合物的相容性，促使其与聚乳酸的界面相容性好，使羟基碳灰石和聚乳酸类聚合物之间产生较强的界面粘结力，有利于羟基磷灰石在聚乳酸类聚合物中分散。

本发明提出的聚乳酸基/纳米羟基磷灰石复合生物材料的制备方法，具体步骤如下：

(1)配制聚乙烯亚胺(PEI)、乙二胺或己二胺的水溶液，浓度为0.1mg/ml～2mg/ml；配制RGD的水溶液，浓度为0.1mg/ml～2mg/ml，调解RGD溶液pH值到4.5~4.7；

(2)复合材料聚乳酸基/纳米羟基磷灰石的预处理。复合材料首先用50％～75％的乙醇水溶液浸润1～20min，然后用去离子水清洗5～10min，干燥备用；

(3)将复合材料室温浸泡于浓度为0.1mg/ml～2mg/ml的PEI、乙二胺或己二胺水溶液中，活化1～10h，蒸馏水清洗数遍，干燥备用；

(4)用25％的戊二醛溶液固定已经胺解的复合材料1～10h，蒸馏水清洗数遍，干燥备用；

(5)将已经用戊二醛固定的干燥的复合材料放入10～50ml的上述RGD的水溶液中接枝反应1～48h；

(6)将反应后接枝RGD的复合材料取出，依次用水洗，无水乙醇洗，真空室温烘干，得到接枝RGB的聚合物基/纳米羟基磷灰石复合膜材料。

上述方法中，PEI的重均分子量为400-25000。

以上提及的复合材料通过胺解引入活性反应基团-NH₂，然后通过戊二醛溶液固定，最后接枝活性多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)(RGD)。复合材料为复合多孔支架时，步骤(2)-(6)在真空中进行并通入氮气。具体可在乙醇溶液、多胺溶液、戊二醛溶液、RGD溶液、水中处理时，都需要用带针头的橡皮塞把试管封住，抽真空，至10mPa以下，然后通氮气10～20min，反复几次，目的是使这些溶液能够进入复合多孔支架材料内部，从而使材料孔内的界面也能够被充分反应，提高材料表面接枝RGD的量。

附表1-4为本发明的复合材料(膜材料和支架材料)氨解和接枝RGD前后的性能对比。由表可见，经氨解和接枝RGD后的复合材料性能有很大提高。

具体实施方式

实施例1、配制PEI(25000)的水溶液，浓度为1mg/ml；溶剂浇铸法制备PLGA/HA膜，待溶剂挥发后，真空干燥24h以完全除去溶剂。将PLGA/HA膜剪成2×2cm²的片状，并用游标卡尺量其厚度，记录，备用；用75％的乙醇水溶液，超声清洗PLGA/uHA平面膜20min，然后用去离子水冲洗10min，氮气吹干备用；PLGA/HA膜表面接枝-NH₂：将平面膜室温浸泡于1mg/ml的PEI(25000)水溶液中活化10h，蒸馏水清洗数遍，氮气吹干备用；用25％的戊二醛溶液固定已经胺解的PLGA/HA复合膜材料4h；配制RGD的水溶液浓度为0.1mg/ml，用HCl稀溶液调解RGD溶液PH值到约4.5~4.7；将已经用戊二醛固定的干燥的PLGA/HA膜放入盛有一定量RGD溶液的烧杯中，置于四联磁力搅拌器中不断振荡，反应48h；从烧杯中取出膜片，依次用水洗1h，无水乙醇洗1h，再水洗1h，反复3-4次，然后取出膜片，置于表面皿中，真空常温烘干得到接枝RGD的PLGA/HA复合膜材料。

实施例2、配制PEI(25000)的水溶液，浓度为1mg/ml；溶剂浇铸法制备PLLA/HA膜，待溶剂挥发后，真空干燥20h以完全除去溶剂。将PLLA/HA膜剪成2×2cm²的片状，并用游标卡尺量其厚度，记录，备用；用75％的乙醇水溶液，超声清洗PLLA/HA平面膜25min，然后用去离子水冲洗10min，氮气吹干备用；PLLA/HA膜表面接枝-NH₂：将平面膜室温浸泡于1mg/ml的PEI25000水溶液中活化5h，蒸馏水清洗数遍，氮气吹干备用；用25％的戊二醛溶液固定已经胺解的PLLA/HA复合膜材料2h；配制RGD的水溶液0.5mg/ml，用盐酸稀溶液调解RGD溶液PH值到约4.5~4.7；将已经用戊二醛固定的干燥的PLGA/HA膜放入盛有一定量RGD溶液的烧杯中，置于四联磁力搅拌器中不断振荡，反应30h；从烧杯中取出膜片，依次用水洗50分钟，无水乙醇洗50分钟，再水洗50分钟，反复3-4次，然后取出膜片，置于表面皿中，真空常温烘干得到接枝RGD的PLLA/HA复合膜材料。

实施例3、配制PEI(423)的水溶液，浓度为2mg/ml；溶剂浇铸法制备PLGA/HA膜，待溶剂挥发后，真空干燥28h以完全除去溶剂。将PLGA/HA膜剪成2×2cm²的片状，并用游标卡尺量其厚度，记录，备用；用75％的乙醇水溶液，超声清洗PLGA/HA平面膜20min，然后用去离子水冲洗10min，氮气吹干备用；PLGA/HA膜表面接枝-NH₂：将平面膜室温浸泡于1mg/ml的PEI(423)水溶液中活化8h，蒸馏水清洗数遍，氮气吹干备用；用25％的戊二醛溶液固定已经胺解的PLGA/HA复合膜材料4h；配制RGD的水溶液，浓度为1mg/ml，用HCl稀溶液调解RGD溶液PH值到约4.5~4.7；将已经用戊二醛固定的干燥的PLGA/HA膜放入盛有一定量RGD溶液的烧杯中，置于四联磁力搅拌器中不断振荡，反应40h；从烧杯中取出膜片，依次用水洗70分钟，无水乙醇洗60分钟，再水洗50分钟，反复3-4次，然后取出膜片，置于表面皿中，真空常温烘干得到接枝RGD的PLGA/HA复合膜材料。

实施例4、配制PEI(25000)的水溶液，浓度为1mg/ml，RGD的水溶液，浓度为0.1mg/ml，用盐酸稀溶液调解RGD溶液PH值到约4.5~4.7；将PLGA/HA复合多孔支架放入试管中，然后放入一定量的乙醇，用带针头的橡皮塞把试管封住，油泵抽真空20min，然后通氮气20min，然后将支架离心分离，以除去支架内部的乙醇；将PLGA/HA复合支架浸入1mg/ml的PEI(25000)的水溶液中活化10h，反复抽真空、通氮气，保证多胺的溶液进入支架内部，将PLGA/HA支架直接取出，干燥；把胺解后的PLGA/HA复合支架浸入浓度为2.5％的戊二醛溶液，反复抽真空、通氮气的方法，反应10h；取出，用去离子水冲洗，冲洗的时候也要抽真空，通氮气，以除去未反应的戊二醛，真空常温干燥；将戊二醛固定的干燥的PLGA/HA支架浸入RGD溶液中浸泡24h，同时抽真空排除支架内可能存在的气体；取出支架，依次用水洗1h，乙醇洗1h，再水洗1h，反复3-4次，真空常温烘干，密封备用，接枝RGD的PLGA/HA复合支架材料。

实施例5、配制PEI(423)的水溶液，浓度为1mg/ml，RGD的水溶液，浓度为0.1mg/ml，用盐酸稀溶液调解RGD溶液PH值到约4.5~4.7；将PLGA/HA复合多孔支架放入试管中，然后放入一定量的乙醇，用带针头的橡皮塞把试管封住，油泵抽真空25min，然后通氮气20min，然后将支架离心分离，以除去支架内部的乙醇；将PLGA/HA复合支架浸入1mg/ml的PEI(423)的水溶液中活化10h，反复抽真空、通氮气，保证多胺的溶液进入支架内部，将PLGA/HA支架直接取出，干燥；把胺解后的PLGA/HA复合支架浸入浓度为2.5％的戊二醛溶液，反复抽真空、通氮气的方法，反应10h；取出，用去离子水冲洗，冲洗的时候也要抽真空，通氮气，以除去未反应的戊二醛，真空常温干燥；将戊二醛固定的干燥的PLGA/HA支架浸入RGD溶液中浸泡48h，同时抽真空排除支架内可能存在的气体；取出支架，依次用水洗1h，乙醇洗1h，再水洗1h，反复3-4次，真空常温烘干，密封备用，接枝RGD的PLGA/HA复合支架材料。

表1氨解前后PLGA及PLGA/HA膜材料的接触角

  材料  接触角  PLGA  PLGA/HA  PLGA/HA/NH₂  79.05±7.62  85.34±6.39  64.33±6.77

    表2接枝RGD后PLGA膜材料的接触角

  材料  氨解条件  接触角  PLGA膜  PLGA膜  PLGA膜  PLGA/HA膜  PLGA/HA膜  PLGA/HA膜  PEI25000，10h  PEI423，10h  乙二胺，3h  PEI25000，10h  PEI423，10h  乙二胺，3h  67.76±3.05  60.07±2.94  57.93±2.40  54.02±2.39  58.60±1.53  53.74±6.89

                表3 PLGA支架的吸水能力

  支架类型  干重/g  吸水后重量/g  吸水率/％  PLGA支架  PLGA/NH₂支架  PLGA/NH₂/RGD支架  0.0170  0.0125  0.0211  0.0695  0.0687  0.1344  308.84  449.60  570.09

                表4 PLGA支架的保水能力

  支架类型  干重/g  吸水后重量/g  保水率/％  PLGA支架  PLGA/NH₂支架  PLGA/NH₂/RGD支架  0.0288  0.0227  0.0419  0.2360  0.1952  0.3750  719.44  759.92  794.99

1)吸水能力

以下公式用来计算支架的吸水能力：

        N_吸水率＝(W_{吸水后重量}-W_干重)/W_干重×100％。

2)保水能力：

以下公式用来计算支架的保水能力：

        N_保水率＝(W_{吸水后重量}-W_干重)/W_干重×100％。