一种CYP3A4多肽及抗人CYP3A4多肽抗体的制备方法

摘要

一种CYP3A4多肽及抗人CYP3A4多肽抗体的制备方法，它涉及一种多肽及该多肽抗体的制备方法。它解决了目前使用的人CYP3A4价格昂贵，而且抗体不能全部满足用于免疫印迹、免疫组织化学实验和酶联免疫吸附实验的问题。CYP3A4多肽的氨基酸序列为：SQNSKETESHKALSD。抗人CYP3A4多肽抗体按以下步骤制备：(一)CYP3A4抗原表位的分析；(二)CYP3A4多肽的合成；(三)CYP3A4多肽与载体蛋白交联；(四)制备兔抗CYP3A4多肽抗体；(五)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人CYP3A4多肽抗体。本发明制备的抗人CYP3A4多肽抗体为多克隆抗体，效价高，特异性好，可与天然人CYP3A4分子发生特异结合反应；本发明抗体制备成本低，只有用重组抗原制备抗体成本的十分之一，并且安全可靠性高于重组抗原制备的抗体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽及该多肽抗体的制备方法。

背景技术

人CYP3A4(CYP4503A4)是CYP3A亚家族中一成员，主要在肝脏、小肠中表达。CYP3A4是人类药物代谢酶中重要的酶，临床上CYP3A4可完全或部分代谢超过半数的药物。CYP3A4尤其是与外源性致癌物、抗癌药物和内源性类固醇激素、维生素、脂肪酸的代谢转化密切相关。目前使用的人CYP3A4(ab22702：http：//www.abcam.com/提供羊抗兔CYP3A4人工合成肽抗体，用于免疫组化、免疫印迹试验。Ab22704：http：//www.abcam.com/提供兔抗人CYP3A4人工合成肽抗体，用于免疫组化、免疫印迹试验。Ab3572：http：//www.abcam.com/提供兔抗人CYP3A4基因重组表达全部氨基酸抗体，用于免疫印迹试验。CR3340：htto：//www.biomol.com/提供兔抗人CYP3A4多克隆抗体，用于免疫组化、免疫印迹试验。CR3345：http：//www.biomol.com/提供羊抗人CYP3A4多克隆抗体，用于免疫组化、免疫印迹试验。CP0334：http：//ww.biomol.com/提供兔抗人CYP3A4多克隆抗体，其免疫原氨基酸序列498-502位，用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹和免疫组织化学试验。)价格昂贵，制备的抗体成本过高，而且临床使用存在风险。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前使用的人CYP3A4价格昂贵，制备的抗体成本过高，而且安全度低的问题，而提供的一种CYP3A4多肽及抗人CYP3A4多肽抗体的制备方法。CYP3A4多肽的氨基酸序列为：SerGlnAsnSerLysGluThrGluSerHisLysAlaLeuSerAsp。抗人CYP3A4多肽抗体按以下步骤制备：(一)CYP3A4抗原表位的分析：利用DNAStar软件分析，确定CYP3A4蛋白278～292位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP3A4多肽的合成：多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP3A4多肽与载体蛋白交联：CYP3A4多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法，然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8～12h，交联形成CYP3A4-KLH；(四)制备兔抗CYP3A4多肽抗体：将乳化后的CYP3A4-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶10000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP3A4多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP3A4多肽抗体，即得到抗人CYP3A4多肽抗体。本发明中的CYP3A4多肽具有优异的亲水性结构(hydrophilicity)、柔性区(flexibility)、抗原指数(antigenicity)及表面概率结构(surface probability)。本发明制备的抗人CYP3A4多肽抗体为多克隆抗体，效价高，特异性好，可与天然人CYP3A4分子发生特异结合反应；本发明抗体制备成本低，只有用重组抗原制备抗体成本的十分之一，并且安全可靠性高于重组抗原制备的抗体；而且本发明制备的抗人CYP3A4多肽抗体能够满足免疫组化、免疫印迹和酶联免疫吸附实验的要求，可用于建立体外免疫分析，为兔抗人CYP3A4分子的研究及相关疾病的研究提供一个有力工具，具有重要的理论意义和临床价值。

附图说明

图1是DNAstar软件分析人CYP3A4蛋白序列的数据分析结果图；图2是抗血清相对亲和力常数测定结果图，图中“■”曲线为浓度是10mg/L的CYP3A4-BSA的OD₄₅₀值，图中“▲”曲线为浓度是5mg/L的CYP3A4-BSA的OD₄₅₀值；图3是抗体Western blot析凝胶电泳图，图中“M”泳道标样为Marker，图中“1”泳道标样为CYP3A4-BSA，图中“2”泳道标样为BSA，图中“3”泳道标样为人肝脏微粒体蛋白；图4是正常人肝脏组织HE染色图(×400)；图5是抗人CYP3A4多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP3A4结合图(×200)；图6抗人CYP3A4多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP3A4结合图(×400)。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式CYP3A4多肽的氨基酸序列为：SerGlnAsnSerLysGluThrGluSerHisLysAlaLeuSerAsp。

具体实施方式二：本实施方式抗人CYP3A4多肽抗体按以下步骤制备：(一)CYP3A4抗原表位的分析：利用DNAStar软件分析，确定CYP3A4蛋白278～292位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP3A4多肽的合成：多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP3A4多肽与载体蛋白交联：CYP3A4多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法，然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8～12h，交联形成CYP3A4-KLH；(四)制备兔抗CYP3A4多肽抗体：将乳化后的CYP3A4-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶10000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP3A4多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP3A4多肽抗体，即得到抗人CYP3A4多肽抗体。

本实施方式利用DNAStar软件分析CYP3A4蛋白序列，蛋白序列分析结果如图1所示，CYP3A4蛋白278～292位氨基酸(多肽)具有优异的亲水性结构(hydrophilicity)、柔性区(flexibility)、抗原指数(antigenicity)及表面概率结构(surface probability)。本实施方式抗体经过纯化后纯度为96.9％，可作为抗原免疫动物，安全可靠性高。本实施方式中所使用的兔子为健康日本大耳白兔。本实施方式于耳中央动脉采血测定抗体的效价。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤(二)中采用常规C18的RP-HPLC柱进行纯化。其它步骤与实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤(三)中CYP3A4多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法：按重量份数比将4～6份经过纯化的CYP3A4多肽加入到6～8份载体蛋白KLH中，然后均匀、缓慢地加入0.5～1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液，室温环境下作用2±0.5h。其它步骤与实施方式二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四的不同点是：步骤(三)中的戊二醛溶液配制后3h内使用。其它步骤与实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤(四)中取CYP3A4-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，每点注射100μg，首次免疫注射后第2周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同；加强免疫注射CYP3A4-KLH用不完全福氏佐剂乳化；每次加强免疫注射7天后测定抗体效价。其它步骤与实施方式二相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤(四)中反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶16000。其它步骤与实施方式二相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤(五)中采用颈动脉取血收集含有兔抗人CYP3A4多肽抗体的兔血。其它步骤与实施方式二相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤(五)中采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP3A4多肽抗体：(1)将含有兔抗人CYP3A4多肽抗体的血清用浓度为60mmol/L、pH值为4.0的醋酸钠缓冲液稀释3～4倍，再用浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH值至4.5；(2)向步骤(1)的混合液中缓慢加入含量为98.5％的辛酸至混合液中辛酸浓度为25mL/L；(3)室温条件下搅拌混合液30min，在4℃、10000g的条件下离心30min，再用滤孔直径为0.22μm的滤膜过滤上清液；(4)向滤液中加入滤液1/10体积的10×PBS，并用浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH值至7.4，然后缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为45％；(5)加入硫酸铵的滤液在4℃环境下静置8～12h，然后在4℃、3000g的条件下离心30min，弃去上清夜，沉淀用浓度0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液重悬，透析8～12h。其它步骤与实施方式二相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九的不同点是：步骤(五)(2)中辛酸为正辛酸。其它步骤与实施方式九相同。

具体实施方式十一：本实施方式抗人CYP3A4多肽抗体按以下步骤制备：(一)CYP3A4抗原表位的分析：利用DNAStar软件分析，确定CYP3A4蛋白278～292位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP3A4多肽的合成：多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP3A4多肽与载体蛋白交联：CYP3A4多肽与载体蛋白KLH和载体蛋白BSA采用戊二醛连接法，将5mg经过纯化的CYP3A4多肽分别加入到7mg KLH和BSA中，然后均匀、缓慢地加入1mg浓度为3g/L的戊二醛溶液(配制后1h内使用)，在室温环境下作用2h，之后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析9～11h，交联形成CYP3A4-KLH和CYP3A4-BSA，无菌分装保存于-80℃的环境中；(四)制备兔抗CYP3A4多肽抗体：将乳化后的CYP3A4-KLH在日本大耳白兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶16000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP3A4多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP3A4多肽抗体，即得到抗人CYP3A4多肽抗体；(六)人肝脏微粒体蛋白制备：(1)取10g人正常肝脏(人正常肝脏来自于死亡时间未到24h的意外死亡者或肝脏未发生病变的死亡者)剪碎，用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后加入100～150mL磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆，(2)将肝匀浆在4℃、10000g的条件下离心30min，之后取上清液在30000g的条件下离心60min，再在100000g的条件下离心60min，然后取粉红色沉淀悬浮于磷酸钾盐缓冲液(含有200mL/L甘油，5g/L胆酸钠，2mg/L抑肽酶，2mg/L亮肽素，1mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟)中，(3)用Bradford法进行蛋白定量、分装后置于-80℃环境中保存。

本实施方式采用ELISA检测抗血清效价：ELISA检测板用浓度为1mg/L的CYP3A4-BSA包被，每孔包被物100μL，在4℃条件下孵育8～12h，然后每孔加入200μL浓度为100mL/L的牛血清，在37℃的条件下封闭2h后洗涤，加入倍比稀释2倍的含有兔抗人CYP3A4多肽抗体血清(对照组加入正常兔血清)，37℃条件下孵育30min，经过3次洗涤后每孔加入5000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG100μL，再在37℃条件下孵育15min，洗涤3次后进行TMB显色，37℃条件下孵育15min后用酶标仪测定样品在A₄₅₀的吸光值，再用Multiskan Transmit软件分析可得出抗体效价，本实施方式抗体效价为1∶16000。

本实施方式采用间接ELISA检测抗血清相对亲和常数：ELISA检测板分别用浓度为5mg/L和10mg/L的CYP3A4-BSA包被，并用浓度为100mL/L的牛血清封闭，然后加入已知蛋白浓度的纯化多抗，再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗后OPD显色测定OD₄₅₀值，显色测定的OD₄₅₀值如图2所示，通过公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-2[Ab]t)(其中[Ab’]t、[Ab]t指的是分别包被5mg/L和10mg/L时抗体半饱和[OD₅₀]时抗体的摩尔浓度，[Ag]t，[Ag’]t指的是包被的抗原浓度，n＝[Ag]t/Ag’]t，本实施方式中n＝2)计算，结果表明相对亲和力常数在10⁵～10⁶M^-1。

本实施方式进行抗体的Western blot分析，用2×SDS上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、CYP3A4-BSA及BSA，先95℃加热5min，置于冰上冷却10min，再上样，上样量分别为70μg、15μg、15μg，经SDS-PAGE分离后，以湿转法电转至硝酸纤维素膜上；经脱脂奶粉封闭(室温1h)后依次加入1∶1000稀释抗血清(4℃过夜，以1mL/L Tween-20TBS洗膜3次)和1∶10000 HRP-山羊抗兔IgG(室温孵育1h，以1mL/L Tween-20TBS洗膜3次)；之后用用化学发光剂试剂盒(ECL Plus)处理5min后，于暗室曝光到X光胶片上，显影、定影。本实施方式抗体Western blot分析凝胶电泳结果如图3所示，抗血清与人肝脏微粒体蛋白在Mr大约为46000处出现1条清晰的带，与CYP3A4的分子量相符；与CYP3A4-BSA在Mr大约为69000处出现1条清晰的带，与BSA分子量相符；而与BSA则无条带出现。说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP3A4蛋白结合。

本实施方式进行抗体的免疫组化染色，取出用丙酮固定的冰冻人肝脏切片，滴加5％BSA，室温下5％BSA封闭20min，加入1∶1000稀释兔抗人CYP3A4多肽抗体，4℃孵育过夜，再用PBS洗片后加入羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育20min，PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后，脱水、透明、封片，镜检，放大200倍和400倍拍照记录结果。免疫组化染色实验图片如图4～6所示，图4为正常人肝脏组织HE染色图(×400)；图5为抗人CYP3A4多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP3A4结合图(×200)，；图6为抗人CYP3A4多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP3A4结合图(×400)；图4～6中箭头所指为细胞胞浆中被染色的质粒。由此证明，抗人CYP3A4的抗体可以与正常肝脏组织中的CYP3A4蛋白结合。

                              序列表

<110>哈尔滨医科大学

<120>一种CYP3A4多肽及抗人CYP3A4多肽抗体的制备方法

<160>1

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>CYP3A4多肽，用于制备抗人CYP3A4多肽抗体。

<400>1

Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Glu Ser His Lys Ala Leu Ser Asp

1               5                   10                  15