法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-11-14
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K7/08 授权公告日:20080813 终止日期:20110904 申请日:20060904
专利权的终止
2008-08-13
授权
授权
2007-04-18
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-02-21
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种多肽及该多肽抗体的制备方法。
背景技术
CYP4A11是细胞色素P450 4A亚型之一,主要分布在肝脏和肾脏,其可以催化多种脂肪酸(月桂酸等)的代谢,调节体内脂类代谢平衡。研究发现,CYP4A11催化内源性花生四烯酸代谢生成20-羟基花生四烯酸(20-HETE),而20-HETE与原发性高血压形成有关。此外,另有研究表明CYP4A11还参与防御紫外线氧化损伤的机制。由于目前使用的基因重组人CYP4A11(#RDI-CYP4A11abr:http://www.researchd.com/cyp450/cyp4alab.htm提供兔抗人CYP4A11抗体,以纯化人肝脏CYP4A11蛋白为抗原,用于免疫印迹试验。)价格昂贵,制备的抗体成本过高,而且安全度低。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前使用的人CYP4A11价格昂贵,制备的抗体成本过高,而且安全度低的问题,而提供的一种CYP4A11多肽及抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法。CYP4A11多肽的氨基酸序列为:ArgLeuArgArgLeuProAsnProCysGluAspLysAspGlnLeu。抗人CYP4A11多肽抗体按以下步骤制备:(一)CYP4A11抗原表位的分析:利用DNAStar软件分析,确定CYP4A11蛋白505~519位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列;(二)CYP4A11多肽的合成:多肽自动合成仪合成,并纯化;(三)CYP4A11多肽与载体蛋白交联:CYP4A11多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法,然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8~12h,交联形成CYP4A11-KLH;(四)制备兔抗CYP4A11多肽抗体:将乳化后的CYP4A11-KLH在兔背部皮下注射,并反复加强免疫,直至抗体效价等于、高于1∶10000;(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清,采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体,即得到抗人CYP4A11多肽抗体。本发明中的CYP4A11多肽具有优异的亲水性结构(hydrophilicity)、柔性区(flexibility)、抗原指数(antigenicity)及表面概率结构(surface probability)。本发明制备的抗人CYP4A11多肽抗体效价高,特异性好,可与天然人CYP4A11分子发生特异结合反应;本发明抗体制备成本低,只有用重组抗原制备抗体成本的十分之一,并且安全可靠性高于重组抗原制备的抗体;而且本发明制备的抗人CYP4A11多肽抗体能够满足免疫组化、免疫印迹和酶联免疫吸附实验的要求,可用于建立体外免疫分析,为兔抗人CYP4A11分子的研究及相关疾病的研究提供一个有力工具,具有重要的理论意义和临床价值。
附图说明
图1是DNAstar软件分析人CYP4A11蛋白序列的数据分析结果图;图2是抗血清相对亲和力常数测定结果图,图中曲线为浓度是10mg/L的CYP4A11-BSA的OD450值,图中曲线为浓度是5mg/L的CYP4A11-BSA的OD450值;图3是抗体Western blot分析凝胶电泳图,图中“M”泳道标样为Marker,图中“1和6”泳道标样为CYP4A11-BSA,图中“2和5”泳道标样为BSA,图中“3和4”泳道标样为人肝脏微粒体蛋白,“1、2和3”泳道蛋白经电泳、转膜后加纯化后的抗CYP4A11抗体,“4、5和6”泳道蛋白经电泳、转膜后加纯化后的抗CYP4A11抗体和CYP4A11多肽;图4是正常人肝脏组织HE染色图(×400);图5是抗人CYP4All多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP4A11结合图(×100);图6抗人CYP4A11多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP4A11结合图(×400)。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式CYP4A11多肽的氨基酸序列为:
ArgLeuArgArgLeuProAsnProCysGluAspLysAspGlnLeu。
具体实施方式二:本实施方式抗人CYP4A1l多肽抗体按以下步骤制备:
(一)CYP4A11抗原表位的分析:利用DNAStar软件分析,确定CYP4A11蛋白505~519位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列;(二)CYP4A11多肽的合成:多肽自动合成仪合成,并纯化;(三)CYP4A11多肽与载体蛋白交联:CYP4A11多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法,然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8~12h,交联形成CYP4A11-KLH;(四)制备兔抗CYP4A11多肽抗体:将乳化后的CYP4A11-KLH在兔背部皮下注射,并反复加强免疫,直至抗体效价等于、高于1∶10000;(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清,采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体,即得到抗人CYP4A11多肽抗体。
本实施方式利用DNAStar软件分析CYP4A11蛋白序列,蛋白序列分析结果如图1所示,CYP4A11蛋白505~519位氨基酸(多肽)具有优异的亲水性结构(hydrophilicity)、柔性区(flexibility)、抗原指数(antigenicity)及表面概率结构(surface probability)。本实施方式抗体经过纯化后纯度为96.9%,可作为抗原免疫动物,安全可靠性高。本实施方式中所使用的兔子为健康日本大耳白兔。本实施方式于耳中央动脉采血测定抗体的效价。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式二的不同点是:步骤(二)中采用常规C18的RP-HPLC柱进行纯化。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式二的不同点是:步骤(三)中CYP4A11多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法:按重量份数比将4~6份经过纯化的CYP4A11多肽加入到6~8份载体蛋白KLH中,然后均匀、缓慢地加入0.5~1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液,室温环境下作用2±0.5h。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式四的不同点是:步骤(三)中的戊二醛溶液配制后3h内使用。其它步骤与实施方式四相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式二的不同点是:步骤(四)中取CYP4A11-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射,注射点为4点,每点注射100μg,首次免疫注射后第2周进行第一次加强免疫注射,以后每隔两周加强免疫注射一次,每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同;加强免疫注射CYP4A11-KLH用不完全福氏佐剂乳化;每次加强免疫注射7天后测定抗体效价。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式二的不同点是:步骤(四)中反复加强免疫,直至抗体效价等于、高于1∶32000。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式二的不同点是:步骤(五)中采用颈动脉取血收集含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的兔血。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式二的不同点是:步骤(五)中采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体:(1)将含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清用浓度为60mmol/L、pH值为4.0的醋酸钠缓冲液稀释3~4倍,再用浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH值至4.5;(2)向步骤(1)的混合液中缓慢加入含量为98.5%的辛酸至混合液中辛酸浓度为25mL/L;(3)室温条件下搅拌混合液30min,在4℃、10000g的条件下离心30min,再用滤孔直径为0.22μm的滤膜过滤上清液;(4)向滤液中加入滤液1/10体积的10×PBS,并用浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH值至7.4,然后缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为45%;(5)加入硫酸铵的滤液在4℃环境下静置8~12h,然后在4℃、3000g的条件下离心30min,弃去上清夜,沉淀用浓度0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液重悬,透析8~12h。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式九的不同点是:步骤(五)(2)中辛酸为正辛酸。其它步骤与实施方式九相同。
具体实施方式十一:本实施方式抗人CYP4A11多肽抗体按以下步骤制备:(一)CYP4A11抗原表位的分析:利用DNAStar软件分析,确定CYP4A11蛋白505~519位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列;(二)CYP4A11多肽的合成:多肽自动合成仪合成,并纯化;(三)CYP4A11多肽与载体蛋白交联:CYP4A11多肽与载体蛋白KLH和载体蛋白BSA采用戊二醛连接法,将5mg经过纯化的CYP4A11多肽分别加入到7mg KLH和BSA中,然后均匀、缓慢地加入1mg浓度为3g/L的戊二醛溶液(配制后1h内使用),在室温环境下作用2h,之后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析9~11h,交联形成CYP4A11-KLH和CYP4A11-BSA,无菌分装保存于-80℃的环境中;(四)制备兔抗CYP4A11多肽抗体:将乳化后的CYP4A11-KLH在日本大耳白兔背部皮下注射,并反复加强免疫,直至抗体效价等于、高于1∶32000;(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP4A11多肽抗体的血清,采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP4A11多肽抗体,即得到抗人CYP4A11多肽抗体;(六)人肝脏微粒体蛋白制备:(1)取10g人正常肝脏(人正常肝脏来自于死亡时间未到24h的意外死亡者或肝脏未发生病变的死亡者)剪碎,用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后加入100~150mL磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆,(2)将肝匀浆在4℃、10000g的条件下离心30min,之后取上清液在30000g的条件下离心60min,再在100000g的条件下离心60min,然后取粉红色沉淀悬浮于磷酸钾盐缓冲液(含有200mL/L甘油,5g/L胆酸钠,2mg/L抑肽酶,2mg/L亮肽素,1mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟)中,(3)用Bradford法进行蛋白定量、分装后置于-80℃环境中保存。
本实施方式采用ELISA检测抗血清效价:ELISA检测板用浓度为1mg/L的CYP4A11-BSA包被,每孔包被物100μL,在4℃条件下孵育8~12h,然后每孔加入200μL浓度为100mL/L的牛血清,在37℃的条件下封闭2h后洗涤,加入倍比稀释2倍的含有兔抗人CYP4A11多肽抗体血清(对照组加入正常兔血清),37℃条件下孵育30min,经过3次洗涤后每孔加入5000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG100μL,再在37℃条件下孵育15min,洗涤3次后进行TMB显色,37℃条件下孵育15min后用酶标仪测定样品在A450的吸光值,再用Multiskan Transmit软件分析可得出抗体效价,本实施方式抗体效价为1∶32000。
本实施方式采用间接ELISA检测抗血清相对亲和常数:ELISA检测板分别用浓度为5mg/L和10mg/L的CYP4A11-BSA包被,并用浓度为100mL/L的牛血清封闭,然后加入已知蛋白浓度的纯化多抗,再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗后OPD显色测定OD450值,显色测定的OD450值如图2所示,通过公式Kaff=(n-1)/2(n[Ab’]t-2[Ab]t)(其中[Ab’]t、[Ab]t指的是分别包被5mg/L和10mg/L时抗体半饱和[OD50]时抗体的摩尔浓度,[Ag]t,[Ag’]t指的是包被的抗原浓度,n=[Ag]t/Ag’]t,本实施方式中n=2)计算,结果表明相对亲和力常数在105~106M-1。
本实施方式进行抗体的Western blot分析,采用合成肽竞争法鉴定抗体的特异性,用2×SDS上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、CYP4A11-BSA及BSA,先95℃加热5min,置于冰上冷却10min,再上样,上样量分别为70μg、15μg、15μg,然后以标准蛋白Marker为中心两侧对称同时上样,经SDS-PAGE分离后,以湿转法电转至硝酸纤维素膜上;经脱脂奶粉封闭(室温1h)后将凝胶按泳道切割,取出备用,Marker泳道两边的凝胶上样中分别加入1∶1000稀释纯化后抗体和1∶1000稀释纯化后抗体加等量合成肽(4℃过夜,以0.05%Tween-20TBS洗膜3次),然后加入1∶10000 HRP-山羊抗小鼠IgG(室温孵育1h,以0.05%Tween-20TBS洗膜3次);之后所有凝胶用化学发光剂试剂盒(ECL Plus)处理5min后,于暗室曝光到X光胶片上,显影、定影。本实施方式抗体Western blot分析凝胶电泳结果如图3所示,抗血清与人肝脏微粒体蛋白在Mr大约为53000处出现1条清晰的带,与CYP4A11的分子量相符,由于是多克隆抗体,还出现一条非特异性结合条带;抗血清与CYP4A11-BSA在Mr大约为69000处出现1条清晰的带,与BSA分子量相符;抗血清与BSA则无条带出现;说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP4A11蛋白结合。而在加入CYP4A11多肽的“4、5和6”泳道中相应条带均明显消失或变浅,这也进一步证实制备的抗体即为抗CYP4A11合成肽的抗体。
本实施方式进行抗体的免疫组化染色,取出用丙酮固定的冰冻人肝脏切片,滴加5%BSA,室温下5%BSA封闭20min,加入1∶1000稀释兔抗人CYP4A11多肽抗体,4℃孵育过夜,再用PBS洗片后加入羊抗兔IgG-HRP,37℃孵育20min,PBS洗片后进行DAB显色,苏木素复染,返蓝后,脱水、透明、封片,镜检,放大100倍和400倍拍照记录结果。免疫组化染色实验图片如图4~6所示,图4为正常人肝脏组织HE染色图(×400);图5为抗人CYP4A11多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP4A11结合图(×100),图5中箭头所指为肝脏血管内皮,无着色;图6为抗人CYP4A11多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP4A11结合图(×400),图6中箭头所指为细胞胞浆中棕黄色颗粒。CYP4A11蛋白位于细胞的内质网,免疫组化实验胞浆明显着色,而细胞核和无内质网的血管内皮没有着色,由此证明,抗人CYP4A11的抗体可以与正常肝脏组织中的CYP4A11蛋白结合。
序列表
<110>哈尔滨医科大学
<120>一种CYP4A11多肽及抗人CYP4A11多肽抗体的制备方法
<160>1
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CYP4A11多肽,用于制备抗人CYP4A11多肽抗体。
<400>1
Arg Leu Arg Arg Leu Pro Asn Pro Cys Glu Asp Lys Asp Gln Leu
1 5 10 15
机译: 疫苗诱导的乙型肝炎病毒株,核酸编码的分子编码丙型肝炎病毒的突变株主要表面抗原,用于制备多肽的矢量和矢量系统,一种用于制备多肽(多肽)(多变体)的方法寡核苷酸,一种抗体(变体)的制备方法,抗体(多种),一种测定治疗乙型肝炎病毒感染的化学成分的方法,一种成分,一种制备方法,一种方法乙型肝炎病毒的有机液体筛查,一种抗体使用方法,疫苗接种疫苗
机译: 抗人Sirpa抗体或其抗原结合片段或抗原结合抗体模拟物,药物组合物,联合产品,分离的核酸分子,载体,分离的宿主细胞,多肽,在体外或离体制备抗体的方法确定受试者的sirp阳性,诊断和预测反应细胞,以及至少一种抗人sirpa抗体或抗原结合的体外或离体的抗sirp抗体或其抗原结合片段或抗体结合模拟物的用途其片段或抗原结合抗体模拟物。
机译: 用于在动物(包括人类)中体内对淀粉样蛋白进行负调节的方法,以及用于治疗和/或预防和/或改善阿尔茨海默氏病或其他特征在于淀粉样蛋白沉积物,淀粉样蛋白生成多肽类似物,免疫原性的疾病和病症的方法组成,核酸片段,载体,转化细胞,诱导产生抗淀粉样多肽的抗体的组成,稳定的细胞系,细胞的制备方法,鉴定修饰的淀粉样多肽的方法以及免疫原的制备组合物,淀粉样蛋白生成多肽或其子序列的用途以及淀粉样蛋白生成多肽的类似物的用途