络石藤总木脂素提取物,提取方法及该提取物和其中有效成分的医药用途

摘要

本发明涉及从络石藤中提取得到的总木脂素及其提取方法，所述总木脂素提取物含有30－90重量％的木脂素类成分。以及所述提取物和其中有效木脂素类成分在制备用于治疗炎症和/或疼痛(如风湿性关节炎、关节痛等)的药物中的用途和作为环氧化酶抑制剂在制备用于治疗其它疾病如肿瘤、血栓等的药物中的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及从络石藤中提取得到的总木脂素及其提取方法，所述总木脂素提取物含有30-90重量％的木脂素类成分。本发明还涉及所述提取物和其中有效木脂素类成分在制备用于治疗炎症和/或疼痛的药物中的用途和作为环氧化酶(COX)抑制剂在制备用于治疗其它疾病如肿瘤、血栓等的药物中的用途。

背景技术

络石藤为夹竹桃科植物络石(Trachelospermum jasminoides(Lindl.))的茎和叶，为中国药典收载的常用中药，具有祛风、通络、止血、消瘀的功效，临床上主要用于治疗风湿性关节炎、关节痛、肌肉疼痛、腰膝酸痛、咽喉肿痛、吐血、外伤出血等。但对其中的抗炎镇痛有效成分一直不清楚，到目前未见关于络石藤总木脂素提取物和提取方法及该提取物和其中有效成分的抗炎镇痛活性的报告。

发明内容

本发明人现已发现络石藤的抗炎镇痛有效成分为木脂素类成分，并且应用适合的提取方法可从络石藤中提取得到木脂素类成分含量在30-90重量％之间的总木脂素提取物。总木脂素提取物和其中的主要木脂素类成分具有显著的抗炎镇痛活性，可用于治疗各种炎症(如风湿性关节炎等)和疼痛(如关节痛等)。而且，本发明人研究发现总木脂素中主要木脂素类成分与诱导型环氧化酶(COX-2)由明显的结合活性。因而，总木脂素和其中木脂素类成分可作为环氧化酶抑制剂用于治疗其它疾病如肿瘤、血栓等。本发明基于上述发现现已完成。

因此，本发明的第一个方面涉及一种提取物，其是从络石藤中提取得到的总木脂素提取物，特征在于含有30-90重量％的木脂素类成分并且至少含有以下式1-6所示的六种化合物的一种：

表1  本发明涉及的活性单体化合物的基本特征

  代号  中文名(英文名)  物理性状  分子式  分子量  溶解性  123456  去甲络石苷(nortracheloside)络石苷(tracheloside)去甲络石苷元(nortrachelogenin)穗罗汉松树脂酚(mataeresinol)络石苷元(trachelogenin)牛蒡苷元(arctigenin)  白色无定形粉末白色无定形粉末白色无定形粉末白色无定形粉末白色无定形粉末白色无定形粉末  C₂₆H₃₂O₁₂C₂₇H₃₄O₁₂C₂₀H₂₂O₇C₂₀H₂₂O₆C₂₁H₂₄O₇C₂₁H₂₄O₆  536550374358388372  易溶于甲醇、乙醇、DMSO；溶于水、丙酮易溶于甲醇、乙醇、DMSO；溶于水、丙酮易溶于甲醇、乙醇、DMSO、丙酮、氯仿；难溶于水易溶于甲醇、乙醇、DMSO、丙酮、氯仿；难溶于水易溶于甲醇、乙醇、DMSO、丙酮、氯仿；难溶于水易溶于甲醇、乙醇、DMSO、丙酮、氯仿；难溶于水

本发明的第二个方面涉及所述提取物的提取方法，所述方法包括用水、丙酮、C_1-4烷基醇或它们的混合物提取络石藤或与大孔树脂、液滴逆流等柱层析法、液液、固液萃取法、CO₂超临界萃取法等技术进行任意组合提取络石藤。以上所述提取物是从络石藤中提取得到的总木脂素提取物，含有30-90重量％的木脂素类成分并且至少含有如式1-6所示的六种化合物的一种。

本发明的第三个方面涉及用于抗炎和/或镇痛的产品或药物组合物，其含络石藤的总木脂素提取物或其中单体成分的组合物以及它们的一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。其中所述提取物含有30-90重量％的木脂素类成分并且至少含有如式1-6所示的六种化合物的一种。所述单体成分的特征为式1-6结构和表1中所示。

本发明的第四个方面涉及络石藤的总木脂素提取物或式1-6单体成分或式1-6单体成分间的任意组合在制备用于治疗炎症和/或疼痛的产品或药物中的用途。其中所述提取物含有30-90重量％的木脂素类成分并且至少含有如式1-6所示的六种化合物的一种。所述单体成分的特征为式1-6结构和表1中所示。

本发明还涉及络石藤的总木脂素提取物或式1-6单体成分或式1-6单体成分间的任意组合物作为环氧化酶(COX-2和/或COX-1抑制剂)在制备用于治疗除炎症和疼痛以外各种疾病如肿瘤、血栓等的药物中的用途。其中所述提取物含有30-90重量％的木脂素类成分并且至少含有如式1-6所示的六种化合物的一种。所述单体成分的特征为式1-6结构和表1中所示。

根据本发明，术语C_1-4烷基醇举例讲可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇或叔丁醇。

根据本发明，本发明药物组合物中载体为制药领域常用的药用赋形剂或药用辅料，如药用添加剂、稀释剂或崩解剂。

根据本发明，本发明中所述产品是指不作为药物的产品，如功能性食品或保健食品。

根据本发明，本发明络石藤木脂素总提取物中总木脂素可通过下面定性并定量测定：

(一)定性

薄层检测法：取少量提取物用甲醇配成0.1mg/ml的溶液，该溶液取少量点样于硅胶薄层板上，取络石苷元和去甲络石苷元的标准溶液作对照，平行点样于同一硅薄层板上，用氯仿∶甲醇(15∶1)展开，用碘或5％硫酸乙醇溶液显色，样品溶液应具有与标准品R_f值相同的斑点。

(二)定量

高效液相色谱法：

1.标准品溶液的配置：准确称取干燥恒重的标准品去甲络石苷(1)、络石苷(2)、去甲络石苷元(3)、络石苷元(5)和牛蒡苷元(6)各10mg，分别用色谱甲醇溶解并定容至10ml，得到浓度为1mg/ml的标准品溶液。

2.色谱条件：NUCLEODUR C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)；流动相CH₃CN-H₂O(20∶80-60∶40)(0-30min)梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：280nm。

3.工作曲线的测定：分别移取上述标准品溶液11.5ml、23.0ml、31.2ml、51.8ml和62.5ml，混合，得到标准品的混合溶液。各标准品的浓度分别为10.15mg/ml、20.3mg/ml、30.12mg/ml、50.18mg/ml和60.25mg/ml。进样16μl与1中各标准品溶液对照分析确定各标准品色谱峰的保留时间。标准品混合溶液各移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，分别用甲醇定容至2ml，得到不同浓度梯度的标准品混合溶液，各溶液分别进样16μl进行分析。以紫外吸收值(A)为纵坐标，标准品浓度(mg/ml)为横坐标，计算出各标准品的工作曲线和回归方程。

4.总木脂素含量测定：准确称取干燥恒重的总木脂素提取物10mg，用甲醇溶解并定容至10ml，浓度为1mg/ml。用0.45μm微孔滤膜过滤后进样16μl进行分析。以工作曲线所得标准方程计算出1、2、3、5和6五个化合物的含量和总含量。

根据本发明，本发明的药物组合物或提取物可通过口服或非肠道途径给药。适合口服给药的剂型举例讲有：片剂、胶囊、溶液、悬浮液、颗粒剂或丸剂等。适合非肠道途径如静脉，皮下或肌肉给药的剂型及外用剂型，举例讲有注射液、搽剂、软膏或栓剂等。

根据本发明，本发明提取物及其有效成分的用量取决于使用对象的年龄、体重和疾病的类型及严重程度等因素。

附图说明

图1为塞来昔布与COX-2结合能力的筛选结果

图2为落石藤95％乙醇提取物中成分与COX-2结合能力的筛选结果

1塞来昔布  2络石苷  3去甲络石苷元  4穗罗汉松树脂酚5络石苷元  6牛蒡苷元

具体实施方式

下面的实施例用来进一步说明本发明，但其不意味着对本发明的任何限制。

实施例1

络石藤总木脂素提取物制备

制备方法

络石藤(1kg)95％乙醇回流提取3次(V∶W＝6∶1)，纱布过滤，减压浓缩得提取物187.5g。95％乙醇溶解，加282g硅藻土(粗膏∶硅藻土＝1∶1.5)，拌匀，挥干，粉碎，加536ml石油醚常温提取三次，过滤，滤液浓缩为石油醚溶解部分9.177g。滤渣加95％乙醇回流提取两次。趁热抽滤，滤液浓缩得浸膏173.1g。用2L 10％乙醇溶解，离心(3000转/分，10min)，取上清夜上AB-8大孔树脂柱(柱床体积2L，用10％乙醇预平衡)。先用4L 10％乙醇洗脱，洗脱液回收溶剂后弃去。再用4L 95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥后得总木脂素提取物44.6g，收率为4.46％。用上面所述总木脂素测定方法和/或高效液相色谱法测得实施例1所制备提取物中各木脂素成分的含量分别为去甲络石苷(1)12.64重量％、络石苷(2)24.70重量％、去甲络石苷元(3)1.77重量％、络石苷元(5)3.34重量％和牛蒡苷元(6)10.54重量％，总木脂素含量为52.98重量％。

实施例2

实施例1提取物和其中主要有效成分的抗炎作用评价

实验材料

实验动物：雄性昆明系小鼠，体重18-22g；雄性Sprague-Dawley大鼠，体重140-180g；均购自和饲养于本院实验动物中心。

受试样品：实施例1提取物；去甲络石苷(1)、络石苷(2)、去甲络石苷元(3)、穗罗汉松树脂酚(4)、络石苷元(5)和牛蒡苷元(6)(均由发明人分离自络石藤提取物中，经液相归一化法测定纯度均在98％以上)，塞来昔布(辉瑞公司(Pfizer)生产)。

实验仪器：打孔器，自制测量大鼠足体积的设备等。

实验用试剂：巴豆油和角叉菜胶购买自sigma公司，其它均为国产分析纯。

实验方法及结果：

巴豆油引起小鼠耳肿胀试验

1.雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，各受试样品直接溶于刺激剂中，刺激剂由巴豆油∶乙醇∶水∶乙醚＝2∶20∶5∶73(V/V)组成，于小鼠右耳两面各涂以溶有受试样品的刺激剂10μl，空白对照组单涂刺激剂，左耳不做处理。4h后处死动物。剪下两耳，敲下直径为7.5mm的耳廓。立即称重，计算左右耳重量差，并确定炎症水肿程度。比较组间差异显著性。结果见表2。

2.雄性小鼠80只，随机分为8组，每组10只，各受试样品溶于丙酮中，于小鼠右耳两面各涂以刺激剂(组成同1中所示)10μl，左耳不做处理。15min后于小鼠右耳两面各涂以受试样品10μl，空白对照组涂以相同体积的丙酮，左耳涂以相同体积的丙酮。4h后处死动物。剪下两耳，敲下直径为7.5mm的耳廓。立即称重，计算左右耳重量差，并确定炎症水肿程度。比较组间差异显著性。结果见表3。

角叉菜胶引起足跖肿胀试验

雄性大鼠36只，随机分为6组，每组6只，受试样品混悬于生理盐水中，腹腔注射(ip)给药0.1ml，空白对照给予同体积的生理盐水。给药后半小时，于大鼠右后足底皮下注射1％角叉菜胶的生理盐水溶液0.1ml(无菌操作)。按微量吸管测量法测定致炎前和致炎后1-3小时(每小时测定一次)大鼠右后足容积。以其致炎前后的足容积差值为肿胀程度。比较组间差异显著性。结果见表4

数据处理：所有数据以x±SD表示，组间差异用t检验。

表2  络石藤木脂素类成分(溶于刺激剂)对小鼠耳肿胀的抑制作用

  组别  剂量(mg/kg)  动物数(只)  肿胀度(mg)  抑制率(％)  空白组塞来昔布络石苷元(5)∶穗罗汉松树脂酚(4)(4∶1)去甲络石苷元(3)84.5113101.5  10101010  12.9±2.74.0±3.2***7.7±2.7*6.0±2.1**69.940.253.9

注：与空白组比较，*P＜0.001  **P＜0.0001  ***P＜0.00001

总木脂素提取物、去甲络石苷(1)、络石苷(2)不溶于刺激剂

表3  络石藤总木脂素提取物和其中主要木脂素类成分(溶于丙酮)对小鼠耳肿胀的抑制作用

  组别  剂量(mg/kg)  动物数(只)  肿胀度(mg)  抑制率(％)  空白组塞来昔布络石苷元(5)∶穗罗汉松树脂酚(4)(4∶1)去甲络石苷元(3)去甲络石苷(1)络石苷(2)牛蒡苷元(6)总木脂素提取物68.574.568.0138.022.572.081.0  1010101010101010  12.7±2.77.0±1.5***11.8±3.58.8±1.8**10.5±4.411.3±1.89.4±2.2**9.5±2.5*44.66.930.410.510.625.624.8

注：与空白组比较，*P＜0.05  **P＜0.01  ***P＜0.0001

表4  络石藤总木脂素提取物和其中主要木脂素类成分对大鼠足肿胀的抑制作用

组别  剂量(mg/kg)  动物数(只)                                肿胀度(ml)1h2h3h4h 空白组塞来昔布去甲络石苷元(3)去甲络石苷(1)络石苷(2)总木脂素提取物2020202020  666666  0.16±0.080.11±0.120.06±0.06^*0.13±0.090.07±0.070.04±0.08^*  0.18±0.110.11±0.120.14±0.070.18±0.070.15±0.060.11±0.12  0.21±0.100.13±0.070.12±0.100.20±0.150.19±0.040.13±0.07  0.22±0.100.17±0.060.15±0.120.24±0.140.16±0.040.13±0.12

注：与空白组比较，*P＜0.05

结论

研究表明，实施例1的总木脂素提取物和其中的主要木脂素类成分可以显著抑制小鼠耳肿胀，对大鼠足肿胀的抑制作用试验中组间差异虽不十分显著，但显示出了明显的趋势。以上结果显示总木脂素提取物和其中的主要木脂素类成分具有抗炎作用。

实施例3

实施例1提取物的镇痛作用评价

实验材料

实验动物：昆明系小鼠，雌雄各半，体重18-22g，购自和饲养于本院实验动物中心。

受试样品：实施例1提取物，吲哚美辛(购自Cayman公司)。

实验仪器：2L烧杯，摄像机等。

实验用试剂：均为国产分析纯。

实验方法及结果：

小鼠40只，随机分为5组，每组8只，灌胃给药(ig)(给药前禁食16h)或腹腔注射(ip)给药0.1ml，空白对照组给予同体积的水或生理盐水。半小时后，腹腔注射(ip)0.6％醋酸溶液0.2ml，放置5min后，记录15min内每鼠扭体次数(腹部和后肢伸长一次为一次扭体反应)。实验结果用扭体抑制率来表示：

结果见表5和表6

数据处理：所有数据以x±SD表示，组间差异用t检验。

表5  络石藤总木脂素提取物对小鼠醋酸扭体反应的抑制作用

  给药途径  组别  剂量(mg/kg)  动物数(只)  扭体次数  抑制率(％)灌胃(ig)  空白组吲哚美辛总木脂素提取物100100200400  88888  10.5±7.10.9±1.7**1.5±2.8**0.6±0.7**1.4±1.8**91.785.794.086.3腹腔注射(ip)  空白组吲哚美辛总木脂素提取物102060200  88888  3.3±2.01.8±2.12.2±3.51.7±2.30.7±0.8*45.135.050.080.0

注：与空白组比较，*P＜0.05  **P＜0.01

结论

研究表明实施例1的总木脂素提取物在灌胃(ig)和腹腔注射(ip)两种给药途径上都可以显著抑制小鼠的醋酸扭体反应，显示总木脂素提取物具有镇痛作用。

实施例4

实施例1提取物中主要木脂素类成分与环氧化酶(COX)的结合活性

实验材料

受试样品：络石藤95％乙醇提取物，塞来昔布(辉瑞公司(Pfizer)生产)。

实验仪器：Agilent 1100高效液相色谱系统，配有四元梯度泵，DAD紫外检测器；高速冷冻离心机；超滤器(截流分子量为30,000)。

实验用试剂：COX-2(ovine)购买自美国Cayman化学试剂公司，其它均为国产分析纯。

实验方法及结果：

移取COX-2(ovine)20μl(3.5μg/μl)，加入被筛选的样品溶液250μl(塞来昔布7.3μg/ml，络石藤95％乙醇提取物0.17mg/ml)，总体积不足270μl的用PBS缓冲液(50mM，pH 7.4)补足。37℃暗处孕育1h后转移到超滤器中，离心(8500rpm，25℃)12min。加400μl PBS缓冲液分两次洗涤，离心除去未与酶产生特异性结合的物质，再加400μl蒸馏水分两次洗涤，离心除去盐类成分。最后加400μl含1％三氟乙酸的20％乙腈水溶液分两次洗涤，离心超滤收集滤液，冷冻干燥后用30μl甲醇溶解，取20μl用于HPLC-DAD分析。另设不加酶的对照组，其它操作同上。

色谱条件：色谱柱：NUCLEODUR C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水((60∶40)(0min)→(85∶15)(15min))梯度洗脱(塞来昔布)或甲醇-水((2∶98)(0min)→(95∶5)(30min))梯度洗脱(络石藤95％乙醇提取物)；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测波长：251nm(塞来昔布)或230nm(络石藤95％乙醇提取物)。

结果见图1和图2。

结论

研究表明实施例1的总木脂素提取物中主要的木脂素类成分与COX-2均存在一定的结合活性，提示总木脂素提取物和其中木脂素类成分可能为COX抑制剂，其抗炎镇痛作用机制可能与抑制COX酶催化花生四烯酸生成前列腺素的活性有关。而且，国外大量研究表明COX-2抑制剂具有抑制肿瘤生长和转移的活性，而小剂量COX-1抑制剂可以有抗血栓的活性(如阿司匹林)。因而落石藤总木脂素提取物和其中木脂素类成分很可能具有抗肿瘤或抗血栓的作用。