一种端粒酶活性定量检测方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种端粒酶活性定量检测方法，通过将端粒酶反应产物特异性的分子信标探针引入到端粒酶活性的PCR检测当中，极大地提高了端粒酶活性检测的特异性，为其在临床上的应用推广提供了条件。为了保证分子信标探针的顺利引入，本发明采取了一种特殊的PCR扩增策略，即在对得到的端粒酶反应产物进行PCR扩增时，使用了一个PCR正向引物和的逆向引物1和2。本发明还提供了包含所述分子信标探针和逆向引物1和2的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种端粒酶活性的定量检测技术及应用该技术进行端粒酶活性检测的试剂盒。属于体外生物医学诊断技术领域。

背景技术

目前，癌症已经成为了人类健康的第一杀手，采用基因学方法对癌症进行早期诊断并对肿瘤的恶性程度及早地做出准确的判断，无论是对癌症的预防还是治疗都具有十分重要的意义。

端粒酶是存在于肿瘤细胞中的一种专一性逆转录酶，它能以自身的RNA亚单位为模板，在蛋白亚单位逆转录酶的推动下把端粒重复序列(5′-(GGTTAG)_n-3′)加入到线性染色体的末端，维持端粒长度和稳定性，使细胞得以永生。愈来愈多的研究表明，端粒酶的活性分析可用于癌症的早期诊断及恶性程度判断。

目前，端粒酶活性的检测研究已成为国际上的研究热点，并已有多种方法见诸报道。在这些方法中，以Kim等人于1994年建立了的端粒重复扩增法(Telomeric repeat amplificationprotocol，TRAP)最为引人注目，该法巧妙地将PCR技术应用于的端粒酶活性检测，极大地提高了检测的灵敏度。在此基础上，人们不断进行改良，提出了一系列端粒酶活性检测的新方法。这些检测方法包括：TRAP引物改良法、亲合闪烁分析-TRAP法、TRAP-酶联免疫吸附分析法、杂交保护分析-TRAP法、比色杂交分析-TRAP法等。但就这些方法而言，都存在着一定的缺陷与不足，这就为它们在临床上的应用推广设置了一定的障碍。这些缺陷主要集中表现在以下两个方面：(1)PCR扩增完成以后，需要繁琐的扩增产物检测步骤。这些检测方法不仅操作繁琐、耗时长，不适用于样品的大批量检测研究，而且容易造成产物的交叉污染，导致假阳性结果的产生。(2)需要放射性同位素标记。若操作不当，不仅会对实验人员造成伤害，且容易污染环境。同时，只能进行定性及半定量分析，无法达到定量检测的需求。实时定量TRAP法的出现有效地克服了上述缺陷，但就目前用于端粒酶检测的两种实时定量方法(SYBRGreen法及Amplifluor法)而言，它们所存在的一个共同缺陷就是检测特异性较差，PCR引物二倍体及其它非特异性扩增产物的生成都会造成背景荧光信号的产生而导致检测灵敏度不高。这就在一定程度上限制了这两种实时定量检测方法在临床诊断上的应用。因此，开发高度特异性诊断技术，进行端粒酶活性的快速、有效和高度自动化的定量检测势在必行。

发明内容

本发明将端粒酶反应产物特异性的分子信标探针引入到了端粒酶的PCR检测体系当中，利用分子信标探针对端粒重复序列的专一性识别作用，来提高检测的特异性，有效地解决了上述问题。且为实现分子信标探针的顺利引入采用了一种独特的PCR扩增策略，即在传统的PCR扩增技术的基础上，同时使用了两种逆向引物1和2，且对逆向引物1的3′-端进行修饰，使其丧失在PCR扩增反应中的延伸能力，避免了该逆向引物在PCR扩增中参与引物二倍体及其他非特异性扩增产物的形成。

本发明的目的是提供一种新的端粒酶活性定量检测技术，它改善了端粒酶活性PCR检测的灵敏度和特异性，可进行大批量样品的同时检测。

本发明端粒酶活性定量检测方法，包括：

(1)从待测样品中提取活性端粒酶。

(2)在PCR体系中，将提取的端粒酶作用于特定的底物，得到携带有端粒重复序列的端粒酶反应产物。

(3)使用一个PCR正向引物和逆向引物1和2，对得到的端粒酶反应产物进行PCR扩增，将分子信标探针引入到端粒酶的PCR检测体系中。

(4)在PCR扩增的同时，通过监测引入的分子信标探针所产生的荧光信号用以对扩增产物进行检测。

所述分子信标探针是以端粒重复序列或其互补序列为作用靶点，其序列的总长度最好为15至50个核苷酸。

所述逆向引物1的3′-端或靠近3′-端的位置包含有与端粒重复序列互补的核苷酸序列；5′-端或靠近5′-端的位置包含有与逆向引物2或逆向引物2的3′-端相同或相似的核苷酸序列；且逆向引物1的3′-端经过修饰，丧失了在PCR扩增反应中的延伸能力；所述逆向引物2的全部核苷酸序列或3′-端的一段核苷酸序列与逆向引物1上的某段序列相同或相近。

本发明中引入的分子信标是一类茎-环结构的单链寡核苷酸探针，其英文名称为molecular beacon。它的环部由-段与靶基因互补的探针序列构成，探针序列的两端是两段相互互补的茎序列，它们之间退火形成发夹结构。荧光基团和猝灭基团分别连接在两条臂的末端。发夹型的茎使荧光基团和猝灭基团相互接近，致使荧光基团的荧光通过能量转移而被猝灭。当有与之完全匹配的靶基因存在时，分子信标的探针序列与靶基因特异性结合，形成探针-靶杂交体，迫使荧光基团和猝灭基团相互远离，体系荧光复原。由于未杂交的分子信标仍保持原来的发夹结构，不发射荧光，所以在检测探针的杂交作用时无需将探针-靶杂交体与过剩的分子信标分离。

在本发明中，特异性分子信标探针的引入可极大地提高检测的特异性，减弱非特异性PCR扩增产物所造成的不利影响。只要生成的非特异性PCR扩增产物中不包含有分子信标探针的靶序列，它就不会与分子信标探针发生相互作用，也就不会导致非特异性荧光信号的生成。

对于传统的TRAP方法而言，直接用分子信标探针进行其扩增产物的实时监测是无法实现的，其主要原因在于端粒酶反应产物序列的特殊性(为5′-(GGTTAG)_n-3′的端粒重复序列)导致PCR逆向引物与分子信标的探针序列之间必然存在极大的相关性，由该逆向引物参与形成的引物二倍体及其他非特异性扩增产物都将会导致分子信标发夹结构的打开，产生非特异性荧光信号。而本发明采用了一种独特的PCR扩增策略，即在对得到的端粒酶反应产物进行PCR扩增时，使用了一个PCR正向引物和本发明所述的逆向引物1和2，有效地解决了这个问题。

由于逆向引物1的3′-端或靠近3′-端的位置包含有与端粒重复序列互补的核苷酸序列，一旦该引物参与到引物二倍体或其它非特异性PCR扩增产物的生成，也将会导致非特异性荧光信号的产生，对检测造成极为不利的影响。因此本发明对该逆向引物的3′-端进行了修饰，使其丧失在PCR扩增中的延伸能力，较好地解决了这一问题，使其在所进行的PCR循环范围内(大约40个循环)不会对检测过程造成任何影响。

本发明技术可检测的样品包括组织细胞、血液、人体分泌物、排泄物、细胞针吸出物、擦拭物及其他各种临床样本。

本发明的另一个目的是提供用于上述检测目的的试剂盒，它包含本发明所述的分子信标探针、逆向引物1和2及除扩增模板外的PCR扩增所必需的其他成分。

下面结合附图进一步说明本发明工作原理。

参见图1.(a)在起始的保温步骤中，端粒酶底物在活性端粒酶的作用下延伸出5′-(GGTTAG)_n-3′的端粒重复序列。(b)在PCR扩增的退火阶段，生成的端粒酶反应产物与逆向引物1的3′-端结合。(c)在随后的引物延伸阶段，结合在逆向引物1上的端粒酶反应产物在Taq酶的作用下沿逆向引物1延伸，生成的产物上包含有逆向引物2的结合位点，可在随后的PCR扩增中作为模板进行指数扩增。(d)在随后循环的高温变性阶段，PCR模板在高温下变性形成单链。(e)当温度降低至退火温度时，分子信标探针与模板上相应的靶基因位点结合，发夹结构打开，产生荧光信号，而未结合的分子信标探针则保持原来的发夹结构，对体系荧光信号不产生影响。同时，端粒酶底物及下游引物2作为随后的PCR引物对结合在模板上的相应位点。(f)端粒酶底物及下游引物2在Taq酶的作用下延伸生成双链PCR产物。(g)进入下一轮循环。

附图说明

图1显示本发明的检测技术的工作原理。

图2.本发明的技术用于人工合成的端粒酶产物-MTSR6的测定研究。

(A)实时PCR扩增中荧光信号强度随PCR循环数的变化情况。

(B)根据A中给出的C_t值对反应液中所含MTSR6量的对数值作图得到的工作曲线。8个反应体系中所含的MTSR6的量分别为：(1)10⁴amol；(2)10³amol；(3)10²amol；(4)10amol；(5)1amol；(6)10^-1amol；(7)10^-2amol；(8)0amol。

图3.本发明的技术用于HL-60细胞中端粒酶活性的检测研究。

(A)实时PCR扩增中荧光信号强度随PCR循环数的变化情况。

(B)根据A中给出的C_t值对反应液中所含的细胞数目的对数值作图得到的工作曲线。6个反应体系中所含的HL-60细胞数目分别为：(1)10⁴；(2)10³；(3)10²；(4)10；(5)5；(6)10⁴(经过热处理使端粒酶失活)。

本文所用下列词语/术语具有如下含义，另有说明除外。

C_t值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

MTSR6：在端粒酶底物的3′-端延伸出6个5′-GGTTAG-3′的端粒重复序列。

具体实施方式

为了能更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明作进一步的描述，但并不限制本发明。

实施例1对人工合成的端粒酶产物-MTSR6的测定。

分子信标探针为：FAM-5′-CCGTGCTAACCCTAACCCTAACCCACGG-3′-DABCYL

划线部分为发夹的茎部，未划线部分为与靶序列特异性互补的探针序列。

逆向引物1为：5′-TAGAGCACAGCCTGTCCGTGACGATACCGTG(CTAACC)₃-3′，3′-端磷酸化。

逆向引物2为：5′-TAGAGCACAGCCTGTCCGTG-3′

端粒酶底物为：5′-GACAATCCGTCGAACAGAGTT-3′

MTSR6：5′-GACAATCCGTCGAACAGAGTTAG(GGTTAG)₆-3′

以此人工合成的DNA序列模拟端粒酶反应产物，验证本发明技术的可行性。

步骤：

平行配制8管PCR反应液，除所含的MTSR6的量不同外，其它成分完全相同。PCR反应液的成分如下：1×PCR反应缓冲液，5mM MgCl₂，各0.2mM的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.4μM端粒酶底物，8nM逆向引物1，0.4μM逆向引物2，80nM分子信标探针，2U BlendTaq酶及不同量的MTSR6。

用上述引物和分子信标探针在Rotor-Gene 3000荧光PCR仪上，对上述8管反应液进行PCR扩增：

在第二组循环(40次循环)的每个55℃下测定分子信标的荧光信号。

结果如图2所示。从结果可以看出，本发明方法可用于人工合成的端粒酶产物的测定，线性范围可达10⁷个数量级，线性相关系数始终保持在0.99以上。对于未加MTSR6的阴性对照反应，在所进行的PCR循环范围内体系荧光强度几乎没有发生变化，显示本发明的技术具有良好的检测特异性。

实施例2对白血病细胞HL-60中端粒酶活性的检测。

本实施例中使用的分子信标探针、逆向引物及端粒酶底物的序列与实施例1相同。

检测步骤：

(1)细胞中端粒酶的提取

收集培养的白血病细胞HL-60，3000rpm离心3min分离沉淀细胞，弃上清。沉淀用预冷的PBS缓冲液悬浮，3000rpm离心3min，弃上清。将细胞重悬于预冷的冲洗缓冲液(Hepes-KOH10mmol/L，pH 7.5，MgCl₂ 1.5mmol/L，KCl 10mmol/L，DTT 1mmol/L)中。4℃下，10000rpm离心1min收集沉淀。将沉淀置于1.5mL离心管中，加入200μL裂解液(Tris-HCl 10mmol/L，pH 7.5，EGTA 1mmol/L，MgCl₂ 1mmol/L，β-巯基乙醇5mmol/L，甘油10％，CHAPS 0.5％，PMSF0.1mmol/L)，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸3次，以保证充分裂解。然后，于4℃，14000rpm离心30min，吸取上清液，依次10倍稀释。稀释液用液氮快速冷冻，置-70℃保存备用。

阴性对照样品的制备：取5μL细胞提取液，95℃下热处理30min使端粒酶失活。

(2)实时PCR检测

PCR反应液的成分如下：1×PCR反应缓冲液，5mM MgCl₂，各0.2mM的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.4μM端粒酶底物，8nM逆向引物1，0.4μM逆向引物2，80nM分子信标探针，2UBlend Taq酶及1μL细胞提取液.

实时PCR检测在Rotor-Gene 3000荧光PCR仪上进行，具体扩增条件如下：

在第二组循环(40次循环)的每一55℃下测定分子信标的荧光信号。结果如图3所示。从结果可以看出，本发明方法可用于细胞中端粒酶活性的测定。在所研究的细胞数目范围内(10⁴～5个细胞)，C_t值与细胞数目的对数值之间都显示了良好的线性关系，线性相关系数始终保持在0.99以上。当使用热处理的细胞提取液作阴性对照时，发现其荧光信号的增长要明显落后于阳性反应体系，显示本发明的技术具有良好的检测特异性。使用本发明的技术，也可以检测出1个细胞中的端粒酶活性，但结果的重现性较差，所以在进行端粒酶活性检测时，使用的细胞样品数目不宜过少。

                                序列列表

<110>南开大学

<120>一种端粒酶活性定量检测方法及试剂盒

<130>20060609

<160>2

<210>1

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)…(49)

<223>最末端(3′-端)的碱基用磷酸化修饰

<400>1

tagagcacagcctgtccgtgacgataccgtgctaaccctaaccctaacc

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)…(20)

<223>

<400>2

tagagcacagcctgtccgtg