一种基因重组蜘蛛丝蛋白管状支架的制备方法

摘要

本发明涉及组织工程领域。采用的技术方案是：以基因重组蜘蛛丝蛋白为纺丝原料，将基因重组蜘蛛丝蛋白溶于甲酸中，配制成静电纺丝液。通过带旋转圆管状收集器的静电纺丝设备，在高压静电作用下，制备出管壁由纳米级纤维构成的管状物。旋转圆柱型收集器的直径为4～10mm，旋转速度为1000～1500r/min，收集距离为10～30cm、电压为100～200kV、供料速度为60μl/min。将管状物浸泡在变性剂中变性10～15小时后取出，置于蒸馏水中浸泡8～12小时，再于－70℃冷冻干燥1－5小时即可得到蜘蛛丝蛋白管状支架材料。利用本方法制备的基因重组蜘蛛丝蛋白纤维属于纳米级，管状物的管壁厚、构成管壁的纤维分布均匀、内径可通过更换收集器规格实现有效控制。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程领域，具体说涉及生物医学材料及组织工程材料中基因重组蜘蛛丝蛋白管状支架的制备方法。

背景技术

组织工程学是利用工程学和生命科学的原理和方法研究生物有机体的组织器官或其功能替代物的新兴交叉学科，集生物工程、生命科学、材料科学与工程及临床医学于一体，目的是修复和再生受损组织或器官，帮助病人恢复受损组织的功能，提高生活质量。1987年，美国自然科学基金工程理事会在研讨生物工程前景时提出了组织工程学的定义，即“应用工程学和生命学的原理和方法来了解正常的和病理的哺乳类动物的组织结构-功能的关系，并研制生物组织代用品，用于修复、维持和改善人体组织的功能”。组织工程的基本原理和方法是，将体外培养的高浓度组织细胞扩增后吸附于一种生物相容性良好，并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质(ECM)材料上，形成细胞-生物材料复合物。该材料可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行新陈代谢，使细胞按预制形态的三维支架生长；然后将这种复合体植入机体所需部位。种植的细胞在生物支架降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成了新的具有原来特殊功能和形态的相应组织和器官，从而可达到修复组织外形和功能重建的目的。

材料科学的发展是组织工程的基础和前提，因此成为组织工程学研究的一个重点内容。组织工程载体--生物可降解高分子材料作为组织工程的平台或三维支架，不仅提供细胞生长的框架，使之形成特定的组织或器官形状，而且生物可降解高分子材料还作为细胞外基质成份之一，起着细胞间信号传导和相互作用的媒介功能，是组织细胞生长所必需的生物活性剂。理想的组织工程三维立体支架材料必须具有以下条件：(1)具有良好的生物相容性，在体外或植入体内时，无论其本身或其降解产物都应对机体无毒性，都不会导致机体炎症反应和引起宿主的移植排斥反应；(2)具有三维连通、微孔结构，孔隙率达90％以上，以便为细胞和组织的生长提供足够的空间和营养代谢环境；(3)具有良好的生物降解性能，材料支架的降解速率必须与植入的细胞组织形成的速率相匹配，当材料支架完成为组织再生提供模板的功能后，可完全被降解吸收；(4)具有良好的材料-细胞界面，以利于细胞黏附、生长和繁殖；(5)具有良好的可塑性和适宜的力学性能，支架材料应易于加工成形和承受一定的压力，并在一定的时间内保持其外形和结构的完整性。

蜘蛛丝是一种特殊的蛋白质纤维，是天然的高分子纤维和生物材料，它具有很高的强度、弹性、柔韧性、伸长度和抗断裂性能以及比重小、较耐紫外线、生物可降解性等优点；蜘蛛丝膜具有很好的透明性、生物可降解性和水-空气界面的通透性。与胶原蛋白和弹性蛋白相似，蜘蛛丝蛋白具自装配性质，通过二级结构调节以提供机械支撑；与聚酯比较，丝的柔韧性和弹性使其经得起重压和疲劳。丝蛋白生物相容性好，与胶原起同样的细胞粘附、扩展、分化和生长的作用。丝基质还有机械诱导作用，通过调整丝基质的硬度，提供控制基质的最终机械特性来模仿天然机体组织的机械特性和支持宿主组织内生长。因此它在医学应用、外科缝合线、生物材料衬膜和支架、细胞生长支撑支架和控制释放基质上表现出极大的应用潜力(Winkler S，Kaplan DL.Molecular biology ofspider silk.Reviews in Molecular Biotechnology，2000，74：85)，是理想的兼有可降解和生物活性的第三代组织工程生物材料。

作为组织工程的第三代生物新材料开发，蜘蛛丝蛋白具有得天独厚的条件。虽然目前蜘蛛不能象蚕那样大规模地饲养并有规律地大量吐丝，但生物工程及高分子材料加工技术的发展，使仿蜘蛛丝的生产成为可能。福建师范大学李敏等分别于2002年(李敏，章文贤，黄建坤等。蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达，生物工程学报，2002，18(3)：331)和2004年(李敏，黄建坤，涂桂云等，RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因的构建、表达与纯化，生物医学工程学杂志，2004，21(6)：1006)先后公开了该研究小组根据蜘蛛丝的结构和功能特性，应用基因工程为核心的现代生物技术，利用原核生物表达体系，构建了多种特殊序列的蛛丝蛋白基因，建立了可规模化生产的发酵罐高密度发酵工艺条件等技术，使得公众能以简便易行、低成本和有效的分离纯化方法规模化制备重组蛛丝蛋白，为大量应用蜘蛛丝蛋白作为第三代组织工程生物材料奠定了研究开发基础。

电纺丝是利用聚合物溶液(或熔体)在电场作用下的喷射，来制备纳米级超精细纤维的一种新型纺丝加工方法。电纺丝技术快速、高效，设备简单、易于操作，而且易于控制制品的化学组分和物理性能。电纺丝加工方法制得的无纺布具有纤维纤度细、表面积大、孔隙率高的形态特点，可作为细胞生长的多孔支架，也可作为人工血管、创面覆盖材料及药物载体，广泛用作组织工程及生物医学工程材料，从而赋予了电纺丝加工方法在生物医用领域特别是人体组织工程支架制备方面具有广泛的应用前景。

组织工程支架在体内常为三维空间构型，给细胞的生长提供了适宜的营养条件和空间条件，有利于组织发挥特定的生理功能。因此，植入物的设计应主要考虑载体材料的空间构型，如孔的尺寸、孔之间的连通性、材料内部的表面积等。开孔材料表面可以比普通的材料表面更有利于细胞伪足的攀附，增加细胞层与基底材料之间的物理作用力。基底材料上的开孔有利于水分、无机盐以及其它营养物质和细胞代谢产物的运输和交换，从而更有利于细胞的正常生长和生理代谢。为了进行多层细胞的体外培养，如何制备三维多孔结构的细胞载体材料已成为材料科学研究的热点。

目前，应用在组织工程支架中的主要结构形式有纤维、多孔海绵或泡沫、相连管状结构等三种。其中管状结构支架的制备方法可采用：(1)在商品化管材上打孔后用筛网覆盖这些孔、(2)将无纺纤维网卷成管状再缝合两边、(3)无纺毡片缠绕成圆柱状后喷涂聚集物溶液等，但这些方法工序繁多，后处理麻烦。静电纺丝方法具有工艺简单，制备的支架具有表面积大，空隙率高的形态特点，有望成为管状结构支架的主要制备方法。

发明内容

本发明提供利用一种静电纺丝加工技术制备基因重组蜘蛛丝蛋白管状支架材料的方法。利用本方法制备的基因重组蜘蛛丝蛋白纤维属于纳米级，管状物的管壁厚、构成管壁的纤维分布均匀、内径可通过更换收集器规格实现有效控制。

为实现本发明的目的采用的技术方案是：以基因重组蜘蛛丝蛋白为纺丝原料，在高压静电作用下，通过带有旋转机构的圆管型收集器的静电纺丝设备制得管状支架材料。

具体工艺为：

(1)配制静电纺丝液：将基因重组蜘蛛丝蛋白溶于甲酸中，搅拌均匀后配制成浓度为15～40％(w/v)的静电纺丝液。

(2)蜘蛛丝管状物的制备：通过带旋转圆管状收集器的静电纺丝设备，在高压静电作用下，制备出管壁由纳米级纤维构成的管状物。旋转圆柱型收集器的直径为4～10mm，旋转速度为1000～1500r/min，收集距离为10～30cm、电压为100～200kV、供料速度为60μl/min。

(3)变性：将管状物浸泡在变性剂中变性10～15小时后取出，置于蒸馏水中浸泡8～12小时。

(4)冷冻干燥：变性后的管状物于-70℃冷冻干燥1-5小时即可得到蜘蛛丝蛋白管状支架材料。

本发明所选用的静电纺丝液是指以浓度为70～98％的甲酸为溶剂的基因重组蜘蛛丝蛋白溶液。基因重组蜘蛛丝蛋是通过由福建师范大学李敏等建立的可规模化生产的发酵罐高密度发酵工艺条件等技术而获得，公众也能根据其公开的技术以简便易行、低成本和有效的分离纯化方法规模化制备重组蛛丝蛋白。

本发明所选用的变性剂是指浓度为70％以上的甲醇或乙醇。

本发明所选用的静电纺丝专用设备----静电纺丝仪，由福建师范大学研制定型的产品。该仪器具有：电源电压可调范围为0～300kV，可更换的旋转圆形收集器的直径为4～10mm，旋转速度可调范围为1000～4500r/min，收集距离可调范围为10～30cm、供料速度可调范围为40～100μl/min。

本发明制备的蜘蛛丝蛋白管状支架的优点是：

1、本发明采用静电纺丝加工技术，工艺简单可行，一次成型，适合于大量制备。

2、本发明制备得到的管状支架材料，由于它的本质是蛋白质分子，使它具有很好的生物相容性和可降解性。

3、制备的管状支架具有表面积大、孔隙率高的特点，适用作组织修复材料和组织工程的支架材料。

具体实施方式。

下面根据实例对本发明进一步说明：

实施例1

1、配制静电纺丝液：称取2.25g基因重组蜘蛛丝蛋白溶解于7.5ml 98％甲酸，得30％(w/v)静电纺丝液液。

2、蜘蛛丝管状物的制备：采用直径为4mm旋转圆管状收集器，以1000r/min的速度旋转，在收集距离为20cm、电压为150kV、供料速度为60μl/min的条件下，制得内径为4mm的蜘蛛丝蛋白管状物。

3变性：将管状物浸泡在变性剂乙醇溶液中变性10小时后取出，置于蒸馏水中浸泡10小时。

4冷冻干燥：变性后的管状物于-70℃冷冻干燥3小时，即可得到蜘蛛丝蛋白管状支架材料。

实施例2

1、配制静电纺丝液：称取1.2g蜘蛛丝基因重组蛋白溶解于7.5ml 88％甲酸，得16％(w/v)静电纺丝液液。

2、蜘蛛丝管状物的制备：通过直径为10mm的旋转圆管形收集器，以2500r/min的速度旋转在收集距离为10cm、电压为100kV、供料速度为80μl/min的条件下，制得内径为10mm的蜘蛛丝蛋白管状物材料。

3、变性：将管状物浸泡在变性剂溶液甲醇中变性13小时后取出，置于蒸馏水中浸泡12小时。

4、冷冻干燥：变性后的管状物于-70℃冷冻干燥5小时，得蜘蛛丝蛋白管状支架。

实施例3

1、配制静电纺丝液：称取3.0g基因重组蜘蛛丝蛋白溶解于7.5ml 70％甲酸，得40％(w/v)静电纺丝液。

2、蜘蛛丝管状物的制备：通过直径为20mm的旋转圆形收集器，以1500r/min的速度旋转在收集距离为30cm、电压为200kV、供料速度为35μl/min的条件下，制得内径为20mm的蜘蛛丝蛋白管状物。

3、变性：将管状物浸泡在变性剂乙醇溶液中变性15小时后取出，置于蒸馏水中浸泡8小时。

4、冷冻干燥：变性后的管状物在冷冻干燥机中于-70℃冷冻干燥1.5小时，得蜘蛛丝蛋白管状支架。