一种检测克伦特罗酶联免疫试剂盒及其检测方法与检测前动物组织的制样方法

摘要

本发明涉及酶联免疫检测领域，公开了一种检测克伦特罗酶联免疫试剂盒及其检测方法与检测前动物组织的制样方法。本发明的检测克伦特罗的酶联免疫试剂盒，包括盒体、96/40孔酶标板，辣根过氧化物酶标记抗体、克伦特罗标准溶液、底物液、底物缓冲液和反应终止液；所述96/40孔酶标板孔内包被有能与抗克伦特罗抗体特异结合的包被抗原。本试剂盒采用直接竞争酶联免疫吸附分析技术，大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，具有重要的现实意义。本发明的检测前动物组织制样方法，操作简便，损失小，时间短，成本极低，其提取样品可直接用于酶联免疫方法、金标免疫层析等免疫方法的测定，也可作为仪器分析前期处理的样品。

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测领域，具体的说，涉及一种检测克伦特罗酶联免疫试剂盒及其检测方法与检测前动物组织的制样方法。

背景技术

克伦特罗(clenbuterol)，俗称瘦肉精，属于β兴奋剂，化学名为2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐，药品名为“克喘素”，近年来被非法添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长，因其添加剂量是治疗剂量的5～10倍，在动物体内高残留而给消费者带来危害。1997年以来，我国农业部等相关部门多次发文，将克伦特罗列为严重危害人民身体健康的违禁药品，禁止生产和使用，但是非法使用现象仍较严重，因食用含有克伦特罗的肉类、动物内脏而引发中毒的事件时有发生。

通常，检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱法(GC-MS)，毛细管区带电泳法(CE)和免疫分析技术(IA)等等。HPLC法与GC-MS法是克伦特罗残留检测的确证方法，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用，而酶联免疫分析(ELISA)快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法。

目前国内外已有商品化的克伦特罗ELISA检测试剂盒(德国Rbiopharm，英国Randox Laboratories Ltd，北京望尔公司试剂盒等)，但是由于设计原理的问题国内外现有产品普遍存在稳定性差、检测步骤复杂等缺点。例如德国Rbiopharm与英国Randox Laboratories Ltd产品的设计原理为在微孔条上包被有针对克伦特罗抗体的羊抗体，克伦特罗抗体被加入，经过孵育及洗涤步骤后，再加入克伦特罗酶标记物，标准或样品溶液，克伦特罗与克伦特罗酶标记物竞争克伦特罗抗体，没有连接的克伦特罗酶标记物在洗涤步骤中被除去，然后显色定量。操作步骤至少需要7步。国内望尔公司产品采用间接竞争ELISA法，在微孔条上预包被上偶联抗原，加入样本与克伦特罗抗体，样本中的克仑特罗将和微孔条上预包被偶联抗原竞争克仑特罗抗体，经过孵育及洗涤步骤，然后加入酶标记物，再经过孵育及洗涤步骤后显色定量，操作步骤至少为8步，另外还需专门配制洗涤液，而且反应必须在37℃环境中进行。

ELISA试剂盒检测的对象一般为动物的尿液或组织，对于尿液处理较简单，或者无需处理，但对于动物组织样品，目前商品化试剂盒均需要采取复杂的提取分离步骤，先酸化再碱化然后离心提取，有些还需要过C18柱进行纯化，少则十多步，多则几十步，十分费时，且需要价格较贵的分离柱，一个样品前处理就需几十元的材料和试剂费。另外，检索相关专利发现，中国专利《一种克伦特罗酶免疫检测试剂盒及其检测方法》(申请号02137941.6)中提到一种克伦特罗提取方法，该方法首先将动物组织样品酸化然后冻融两次，离心吸取上清，再用碱调为碱性，然后用异丁醇提取，该法处理步骤也较多，而且需要冻融更不利于检测人员实际检测应用。

所以目前国内外现有产品由于普遍存在稳定性差、组织样品前处理及检测步骤复杂、设备条件要求较高、价格昂贵等不足，严重影响了克伦特罗残留检测与监控，因此研制稳定性高、操作简单、设备要求低、廉价的克伦特罗ELISA试剂盒及简便、快速组织样品前处理方法具有非常重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有克伦特罗检测方法中存在的不足，提供一种高特异性、高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量快速检测克伦特罗的酶联免疫检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供利用上述酶联免疫试剂盒检测克伦特罗的方法。

本发明的另一目的是提供与试剂盒配套使用而且简便的动物组织中克伦特罗的制样方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下测定原理：首先将包被抗原包被于固相载体(酶标板)上，然后加入标样或待测样品，再加入酶标记抗体，包被抗原与待测样品中的克伦特罗竞争酶标抗体，待测样品克伦特罗含量高时，则与固相抗原结合的酶标抗体就少，反之结合在固相抗原上的酶标抗体就多，反应后加入底物进行显色加以测定，当酶标抗体量一定时，加入的待测样品含克伦特罗越多，与固相抗原结合酶标抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高，反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而根据抑制率与克伦特罗浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，再根据克伦特罗的标准曲线和待检样品的抑制率，即可推算出待测样品中克伦特罗的浓度。

本发明的检测克伦特罗的酶联免疫试剂盒，包括盒体、酶标板，辣根过氧化物酶标记抗体、克伦特罗标准溶液、底物液、底物缓冲液和反应终止液；所述酶标板孔内包被有能与抗克伦特罗抗体特异结合的包被抗原。

上述酶标板是96/40孔酶标板，是聚苯乙烯微孔板，其采用能与抗克伦特罗抗体特异结合的包被抗原包被，并封闭微孔表面未吸附位点。

上述底物液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；底物缓冲液为含有3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；终止液为1mol/L硫酸溶液。

合成克伦特罗半抗原，并与载体蛋白(牛血清蛋白与卵清蛋白)共价偶联合成免疫抗原与包被抗原，以免疫抗原免疫兔子或小鼠，制备克伦特罗多克隆抗体、利用杂交瘤技术制备克伦特罗单克隆抗体或利用基因工程方法制备基因工程抗体。收集抗血清、腹水、发酵液等，辛酸硫酸铵沉淀纯化或过蛋白G亲和层析柱纯化；采用过碘酸盐氧化法将辣根过氧化物酶(HRP)标记在纯化好的抗体上；包被抗原预包被聚苯乙烯微孔板，1.0～5.0％脱脂奶粉进行封闭。

利用酶联免疫试剂盒进行检测的方法为：

(1)做标准和样品两个平行检测，在标准品孔加入标准品，样品孔加入待测样品，然后每孔加入酶标记物，轻拍混匀，室温孵育；

(2)倒出酶标板孔内中的液体，并清洗干净；

(3)每孔加入显色液(即为底物缓冲液与底物液的等体积混合液)，轻拍混匀，暗处室温孵育；

(4)加入反应终止液到孔中，混合均匀，在波长450或492nm下，以空气为空白，测定各孔吸光值，在加入终止液后60min内读取吸光值；

(5)以所获样品吸光值的平均值计算抑制率，以抑制率为纵坐标，克伦特罗浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程，根据方程式求出对应样品的克伦特罗浓度；所述抑制率的计算式为：

其中，Amax为不加克伦特罗时的吸光值，Ax为克伦特罗浓度为x时的吸光值，Amin为空白对照孔的吸光值。

本试剂盒对克伦特罗线性检测范围为0.1～8.1ng/mL，检测限为0.1ng/mL。参照说明书一般人员就可使用该试剂盒用于克伦特罗残留的检测。

检测样品一般采用尿液或组织，对于尿样一般不用处理，取清亮尿样直接测定即可。如果尿样浑浊需过滤或离心直至得到清亮尿样。

对于组织，检测前本发明采用如下制样方法：将动物组织捣碎，加0～10倍的水，调pH为5～7，在50～105℃下热浴0.1～15min，然后离心或过滤后提取上清液。

在上述动物组织制样方法中，所述组织包括动物肝脏、瘦肉、心肺等低脂组织。所述捣碎方法包括采用刀切碎，或研钵磨碎，或组织捣碎器匀浆等方法。加水量及时间的掌握，如果组织含水量高，在热浴离心后，有明显的液层(不少于100μL)，可供检测用，则可不加水。否则，加适量的水，一般加与组织样品等量的水(加入多倍的水，会对样品产生稀释作用)。加水可在捣制样品时加入，也可之后加入。如果样品为碱性时，可用一定浓度的盐酸、硫酸等酸液调至近中性，约pH5～7。所述的热浴可采用水浴、油浴、蒸汽等方式；热浴温度在60℃以上；热浴时间至少使组织样品变色，如猪肝样品由“红”变“白”。样品提取液可采用普通常温低速离心或中速滤纸过滤。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的试剂盒采用高特异性、高亲合力的抗体，提高了检测的灵敏度、准确度、精密度与稳定性，反应对孵育温度要求不高(可选择37℃或室温)，洗涤过程可用蒸馏水直接洗涤无需专门配制洗涤液；另外本试剂盒采用辣根过氧化物酶标记抗体技术，节约了抗体的用量，而且大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，基于以上优点本试剂盒非常适用于克伦特罗残留的痕量分析与批量检测，具有重要的现实意义。

2、本发明的检测前动物组织制样方法，①操作简便，条件要求低。组织样品只需捣碎、热提、离心或过滤3步，全过程不需复杂设备及特殊的装置，热提后，渣成团，液体澄清，易分离。②时间短。由于操作步骤少，且组织样品在热作用下极易变性，全过程在几分钟可以完成，而其他方法需要至少半小时以上。③提取率高，损失小。由于组织样品约呈酸性，有利于克伦特罗成盐，容易溶解，加上高温的作用，更容易溶出(与饮用含有瘦肉精肉类煮出的汤而引起中毒事件的原理相同)，加之操作步骤少，减少了过程损失。经测定，提取率达90％以上。④成本低。由于不需用其他试剂(至多用一点盐酸)和分离柱，提取成本极低。同其他方法相比，每个样品可节省制样成本30元以上。

附图说明

图1为试剂盒的直观示意图；

图2为标准曲线。

其中，图1中，1：包被好包被抗原的微孔板，2：酶标记抗体溶液，3：底物液，4：底物缓冲液，5：终止液，6：克伦特罗标准溶液，7：使用说明书。

具体实施方式

实施例1  酶联免疫试剂盒样品的配制

(1)缓冲液的配制：缓冲液(pH7.4PBST)KH₂PO₄ 0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O5.8g，NaCl 16g，KCl 0.4g，Tween-20 0.05％1mL，加蒸馏水至2000mL。

(2)封闭液的配制：脱脂奶粉1.0～5.0g溶于100mL蒸馏水。

(3)底物液的配制：30％过氧化氢30μL溶于19mL的显色液(pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液0.2M Na₂HPO₄25.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，加蒸馏水50mL)中，4℃保存。

(4)底物缓冲液的配制：邻苯二胺OPD80mg溶于10mL底物液中，4℃保存。

(5)酶标板微孔板的包被：包被抗原用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.1～5ug/mL，在酶标板的每孔加100uL，4℃下包被过夜或37℃包被2h，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入200uL1.0～5.0％脱脂奶粉，放入37℃温箱中1h后用PBST洗涤3次，拍干后干燥4℃保存。

(6)克伦特罗标准溶液的配制：准确称取克伦特罗标样8.1mg，溶于0.1L缓冲液中，然后用缓冲液稀释分别配制8.1ng/mL、2.7ng/mL、0.9ng/mL、0.3ng/mL、0.1ng/mL克伦特罗溶液，另外缓冲液配制0ng/mL对照样，4℃保存。

(7)酶标抗体的制备：

辣根过氧化物酶HRP标记抗体的制备采用过碘酸盐氧化法，具体方法为：

①溶解5mg HRP于1mL超纯水中，加入新配置的0.1mol/L过碘酸钠75μL，置室温或4℃冰箱反应20min或30min。

②反应完后装入透析袋，0.001mol/L pH4.0醋酸缓冲溶液4℃透析过夜，期间需更换透析液几次。

③将抗体用0.1mol/L碳酸缓冲液稀释至10mg/mL，另外用0.1mol/L碳酸缓冲液将活化好的HRP的溶液pH调至9.5。将0.5mL抗体加入HRP溶液中，置室温或4℃冰箱反应2h。

④加入100μL 4mg/mL硼氢化钠，4℃冰箱反应2h。

⑤对0.01mol/L PBS透析过夜，加入保存液-20℃保藏备用。

(8)试剂分装：各种试剂按要求配制，测定合格后无菌分装。酶标记抗体7mL/瓶，克伦特罗标准样品1mL/瓶，底物液7mL/瓶，底物缓冲液7mL/瓶，终止液7mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。

(9)试剂盒的组装：分别将可拆卸包被好包被抗原的微孔板1块，酶标记抗体溶液、底物液、底物缓冲液、终止液各1瓶，克伦特罗标准溶液6瓶，使用说明书1份置试剂盒内指定位置，见图1。试剂盒检验合格后封装，4℃保存。

实施例2  试剂盒的检测方法

(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温(20～24℃)平衡30min以上，将足够标准和样品所用数量的条板固定于支架，标准和样品做两个平行实验，按顺序编号。

(2)在标准品孔加入50μL标准品，样品孔加入50μL待测样品。然后每孔加入50μL酶标记物，轻拍混匀。在室温孵育60min。

(3)倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每轮洗板拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。用250μL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作3遍。

(4)每孔加入100μL显色液(将底物缓冲液与底物液等体积混合)，轻拍混匀，暗处室温孵育15min。

(5)加入50μL反应终止液到微孔中。混合好在波长450/492nm(以空气为空白)测定各孔吸光值，必须在加入终止液后60min内读取吸光值。

以所获样品吸光值的平均值计算抑制率，抑制率的计算公式为：

其中，Amax为不加克伦特罗时的吸光值，Ax为克伦特罗浓度为x时的吸光值，Amin为空白对照孔的吸光值。

以抑制率为纵坐标，克伦特罗浓度(ng/mL)的半对数为横坐标绘制标准曲线，校正曲线在0.1～8.1ng/mL范围内为线性，求出直线方程，对应样品的浓度可以根据方程求出。

实施例3  肝脏的检测

将阴性与阳性猪肝样品(经过GC-MS确认浓度)剁碎，称取5g放入25mL烧杯中，加入5mL蒸馏水，放入95℃水浴中，5min后，倒入5mL离心管，于4000r/min转速下离心约5min，上清液即为样品提取液，然后利用本发明ELISA试剂盒进行检测。实验结果如表1。

    表1  肝脏样品处理检测结果

  编号  样品实际浓  度(ng/mL) ELISA测定结果 (ng/mL)  回收率  检样1  检样2  检样3  1.15  6  0 1.06 6.17 0.07  92.2％  102.8％  -

实施例4  猪肉的检测

将阴性与阳性猪肉样品(经过GC-MS确认浓度)用研钵磨成浆状，称取5g样品，无损地转入25mL烧杯中，加入5mL蒸馏水或未加蒸馏水，放入100℃水浴中，2min后取出，用中速新华滤纸过滤，滤液即为样品提取液，然后利用本发明ELISA试剂盒进行检测。实验结果如表2。

          表2  肉样处理检测结果

  编号  样品实际浓度  (ng/mL) ELISA测定结果 (ng/mL)  回收率  检样1  检样2  检样3  检样4  0  2.1(未加蒸馏水)  2.1  7 0.06 2.23 1.91 7.28  -  106％  91％  104％

实施例5  保存期试验

将试剂盒放置于4℃，分别取0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒，对克伦特罗标准样品(0.1ng/mL)进行检测，测定结果如表3。

                        表3  试剂盒保存期试验结果

  时间(月)  0  2  4  6  8  9  10  11  12  吸光度值  (OD_490nm)  1.345  1.334  1.325  1.332  1.321  1.308  1.285  1.258  1.223

从结果可看出，试剂盒在4℃下至少可保存12个月以上。

实施例6  试剂盒灵敏度测定

利用克伦特罗标准溶液进行反应，根据实验结果绘制标准曲线(图2)，由图可得：直线方程为y＝-19.025x+106.14，抑制率(B/B0)与克伦特罗浓度的对数值在浓度0.1～8.1ng/mL范围内呈显著的线性关系，相关系数为R²＝0.9966，且最低检出限为0.1ng/mL。

                                表4

  编号  OD值-1  OD值-2  平均OD  值  浓度  (ng/mL)  浓度对数  (b/b0)*100  标准1  标准2  标准3  标准4  标准5  标准6  1.390  1.290  1.000  0.693  0.415  0.179  1.288  1.087  0.796  0.599  0.338  0.172  1.339  1.189  0.898  0.646  0.377  0.176  0.00  0.10  0.30  0.90  2.70  8.10  #NUM！  -2.0959  -1.0959  -0.0959  0.9041  1.9041  100.0  88.8  67.1  48.2  28.1  13.1

实施例7  准确度试验

取2个浓度(1ng/mL与2ng/mL)的克伦特罗标准样品，添加到阴性样品中，每个浓度设6个重复，进行测定。

试剂盒回收率的结果如下，尿液为90％～105％，组织为85％～110％。

实施例8  精密度实验

取2个浓度(1ng/mL与2ng/mL)的克伦特罗标样，添加到阴性尿样中，每个浓度设6个重复，并分别在同一试剂盒与3个不同试剂盒分别在3天中进行测定。结果如下，批内变异系数为3％，批间变异系数为12.7％。

实施例9  与国内外同类试剂盒对比实验

取20份阳性尿样与20份阴性尿样，利用德国拜发(Rbiopharm)克伦特罗ELISA试剂盒、北京望尔克伦特罗ELISA试剂盒与本试剂盒同时测定，比较检测结果。

三种试剂盒样品检测结果相同，检测条件综合比较如表5。

      表5  与国内外同类试剂盒各项指标比较

  试剂盒来源  检测限  (ng/mL)  试剂盒内  配置药品  (种)  检测  步骤  检测实  际耗时  (min)  孵育温  度  (℃)  洗涤液  本试剂盒  德国拜发试剂盒  北京望尔生物公司  试剂盒   0.1  0.1   0.1   6  7   8   5  8   9   90  110   140   室温  室温   37℃   蒸馏水  蒸馏水  需配制  稀释缓  冲液