川草二号老芒麦转抗虫基因技术

摘要

本发明提供了一种川草二号老芒麦转抗虫基因的技术，按照本技术，以川草二号老芒麦成熟胚为外植体，进行了愈伤组织再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性研究，建立了高效的愈伤组织再生体系；进行了遗传转化条件的研究，获得的抗性愈伤组织以体细胞胚发生途径形成再生植株，经过分子鉴定和抗虫性实验，获得了抗虫转基因川草二号老芒麦植株。抗虫转基因川草二号老芒麦具有抗蝗虫特性，在我国草原畜牧业发展、防止草地沙化等方面有广阔的市场前景。

说明书

                                 技术领域

本发明专利涉及一种川草二号老芒麦(Elymus sibiricus L.‘chuancao No.2’)抗虫转基因技术，属于农业生物技术领域或植物基因工程技术领域。

                                 背景技术

牧草是草食动物的主要饲料来源，也是发展畜牧业的前提。但近年来，由于草地退化和荒漠化，再加上蝗灾的危害，致使川西北草地的生态环境更为恶化，严重的影响了我国西部地区畜牧业的发展。草原的过度开发利用和蝗灾，是草原生态系统恶化的主要因素。造成蝗虫危害的主要原因有以下几个方面：1)环境因素：干旱有利蝗虫的发生，荒漠化增加了蝗虫产卵繁殖场所；2)天敌减少：化学防治大量杀伤了蝗虫天敌；3)生态破坏：过渡放牧，草原严重退化、沙化，导致生物多样性减低，蝗虫天敌种类、数量剧减；4)技术局限：灭菌技术手段单一，抗虫品种缺乏。这些因素增加了对蝗虫危害控制的难度，而现在普遍采用的化学防治方法，只能治标不能治本，还会带来环境污染等诸多社会公害，因此寻求生物防治和培育抗虫植物就显得十分重要。目前，在抗虫基因工程中使用的抗虫基因有三大类：一是从微生物苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis.B.T)分离出的杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystalProtein，ICP)基因，简称Bt基因；二是从植物中分离出的蛋白酶抑制剂基因；三是植物外源凝集素基因(Lectin gene)。其中，杀虫结晶蛋白基因和蛋白酶抑制剂基因应用的较为普遍。1985年，Vasil在国际草原学大会上第一次提出利用遗传转化技术将其它来源的特定基因导入牧草的可行性，为基因工程技术改良牧草，包括改善牧草营养品质，提高产量和利用率，增加牧草对逆境的适应能力，增强对各种虫害、病害的抗性等奠定了理论基础。

自1983年世界上第一例转基因烟草(Zambrysh，1983)诞生以来，植物转基因研究和应用发展迅速。到1997年为止，全世界转基因植物涉及到至少35科的200多个种，涵盖了绝大多数主要经济作物、观赏植物、药用植物、蔬菜、果树、树木和牧草(Birch，1997).截止1999年，至少30个国家进行了总计三万次以上的转基因作物的田间试验，改良的经济性状有十多个：已有大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、马铃薯、烟草、西葫芦和蕃木瓜等九种作物的转基因品种投入了商业化生产。1999年，全球转基因作物的商业化种植面积达到3990万公顷，创造商业收入21-23亿美元，比1998年分别增加1210万公顷和5-7亿美元(James，1999)。2000年全球转基因作物品种商业化种植面积为4420万公顷，预计市场销售收入将达到30亿美元(James，2000)。

目前，植物转基因已成为植物分子生物学研究的强有力的实验手段；更是基因克隆、功能基因组研究必不可少的实验工具。一大批外源目的基因得到分离和克隆，并被应用于转基因植物研究。以基因枪和农杆菌为主导的转化体系日臻完善。到2000年底为止，已有50多个种的植物得到转化并获得再生植株。

20世纪80年代以来，我国的植物基因工程研究也发展很快，尤其是农业生物基因工程技术发展迅速。目前报道的转基因牧草主要有苜蓿、多年生黑麦草(Lolium perenne L.)、中华结缕草(Zoysia sinica Steud.)及草地早熟禾(Poa pratensis L.)等少数品种，而且研究主要集中在提高其抗逆性和品质的改良上，而利用转基因技术培育抗虫牧草品种，国内外的研究都比较少。

川草二号老芒麦(Elymus sibiricus L.‘chuancao No.2’)是我国优良的多年生栽培牧草，对川西北高原寒温草甸环境有极强的适应性，并能在低热量条件下正常开花结实，是川西北牧区建设高产优质打贮草基地的主要栽培草种。但在推广过程中发现该优良牧草是蝗虫主要取食牧草。一般年份，因蝗虫危害减少10-20％。若遇蝗虫爆发，基本无收。故蝗虫危害严重，是推广应用后保持草场稳产高产的一大障碍，也是急待解决的技术难题。

本实验室克隆到一种类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)杀虫蛋白基因，命名为ppIP，该基因在大肠杆菌中能够表达有活力的蛋白质，对蝗虫有很好的杀灭效果(杨志荣，朱文，葛绍荣等，类产碱假单胞菌防治草地蝗虫的研究[J]。中国生物防治，1996，12(2)：55-57；刘世贵，朱文，杨志荣等，一株蝗虫病原菌的分离与鉴定[J]。微生物学报，1994，35：86-90)。该杀虫蛋白与苏云金杆菌伴孢晶体相比较，存在着显著的差异性，且不易被蝗虫体内蛋白酶降解，因此，类产碱假单胞菌杀虫蛋白是一种新的更为安全的细菌杀虫蛋白(张文，杨志荣，朱文等。类产碱假单胞菌杀虫物质的分离纯化和鉴定[J]。微生物学报，1998，38：57-62；杨志荣，朱文，葛绍荣等。中国生物防治[J]，1996，12(3)：114-116)。而有关类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因克隆及转基因植物的研究，国内外均未见报道。

利用基因工程培育和改良禾本科牧草品种是一种便捷和实用的途径，而且农杆菌转化技术已趋成熟，该方法具有操作简便、转化效率高、较少的插入拷贝数以及整合机制相对简单等优点，被植物转基因工作者广泛推崇。但由于禾本科植物自身的特点，许多牧草植物组织培养和再生体系的建立和完善较为困难，而禾本科草的转基因操作和应用研究难度更大。针对于此，本研究对禾本科牧草的组织培养和植株再生进行了探索性研究，在此基础上，建立了老芒麦的农杆菌介导的遗传转化体系，以期为其转基因操作奠定良好的基础；同时，将类菌杀虫蛋白基因导入川草二号老芒麦，以提高其在病害环境中的生存能力，为畜牧业的发展提供保障。

                              发明内容

本发明涉及川草二号老芒麦转抗虫基因技术，抗虫转基因川草二号老芒麦(Elymussibiricus L.‘chuancao No.2’)新材料的创建。该杀虫蛋白基因来自类产碱假单孢菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，该基因转入川草二号老芒麦基因组后，能够编码杀虫蛋白质，对直翅目蝗虫有致死作用。

蝗虫属直翅目(Orthoptera)蝗科(Locustidae)，是一种世界性的有害昆虫。在我国是全国性分布和危害。尤其以北方最为严重，在北方草原，以其“种类多、数量大、分布广、危害重”等特点成为草地第一害虫，仅北方草原和青藏高原草地，每年发生并危害的面积近1000万公顷，严重危害牧草生长，使草地产草量下降30-70％(李克夫、马耀，杜文亮，中国草地[J]，1992，(1)：50-52。)，造成巨大经济损失。蝗虫的危害还是导致草地退化、沙化、自然生态环境条件恶化等的重要因素之一。

1991年在重庆市歌乐山林场发现了许多黄脊竹蝗(Ceracris kiangsu)的自然病死虫，从虫尸内分离到一种病原菌，经回复感染原宿主，能引起原宿主致病并死亡，从虫尸体中分离到同样的病原菌，证明该病原菌为蝗虫自身的致病菌。经感染主要草地害虫的初步试验结果表明，该病原菌对多种草地蝗虫具有较高的感染力，5天的致死率高达90％以上，对草地的草原毛虫(Gynephorap runergensis)、粘虫(Leucania separata)也有一定的感染力。并对多种草地蝗虫有较强的感染力该菌株经鉴定为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(刘世贵，朱文，杨志荣，等。微生物学报[J]，1995，35(2)：86-89)。

近年来对其杀虫致死机理、杀虫蛋白(张文，杨志荣。微生物学报[J]，1998，38(1)：57-62)、安全性(杨志荣，朱文，葛绍荣等。中国生物防治[J]，1996，12(3)：114-116)等方面进行了深入研究，证明该菌对蝗虫致病，是由于其代谢产生的一种杀虫蛋白所致。该蛋白分子量为25100Da，在国内外属首次报道。经研究表明该菌无芽孢，本身具有较强毒蛋白，故具有构建成为遗传工程菌广泛用于生物防治的潜力。

老芒麦(Elymus sibiricus L.)是我国优良的多年生栽培牧草，以刈割与放牧为主，也用于天然草原的补播改良。根据多年对不同地域老芒麦的系统观察，发现本地原产类型对川西北高原寒温草甸环境有极强的适应性，并能在低热量条件下正常开花结实。但也发现在本地域作为人工栽培的本地老芒麦存在的问题，如播种当年生长缓慢，盛产年产量低，(一般利用3-4年)等等。针对这些存在问题，选育的优质品种川草二号老芒麦(Elymus sibiricus L.‘chuancao No.2’)系四川省草原研究所以阿坝本地老芒麦为原始材料，采用系统选择方法和规范的育种程序，经过10年的努力，选育成功的多年生禾草新品种，分别于1990、1991年经农业部全国牧草品种审定委员会评审通过，获《中国牧草品种合格证书》。川草二号老芒麦是适合川西北牧区建设高产优质打贮草基地的主要栽培草种。但该牧草蝗虫危害严重，是推广应用后保持草场稳产高产的一大障碍，也是急待解决的技术难题。

本发明的一个目的就是建立川草二号老芒麦转抗虫基因技术体系。

具体地，就是建立川草二号老芒麦愈伤组织再生系统，利用具有自主知识产权的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因，构建转化川草二号老芒麦愈伤组织的表达载体，然后对转化后愈伤组织进行抗性筛选和分化，再生出植株，从而创建抗蝗虫转基因川草二号老芒麦。

本发明所需的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因的克隆和类产碱假单胞菌杀虫蛋白的分离纯化及方法详见本实验室的另一专利-类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(公开号：CN 1616486A)。该杀虫蛋白基因能够在大肠杆菌中进行表达，其表达产物对直翅目昆虫有毒杀作用。该杀虫蛋白基因可以不经改造，利用全长的野生型基因或只用其5’端314-1078核苷酸共765bp的毒性区序列，均可直接用于植物细胞核转化。同时对基因序列进行人工改造，并选择适宜的表达载体，可显著提高其表达量或杀虫效果。

本发明所需的表达载体是已知的，为一种双元载体pCAMBIA1304。在进行植物转化时，可将该基因插入到单子叶植物通用的质粒pCAMBIA1304上，并在植物基因启动子的驱动下，其T-DNA可定点插入植物基因组中。

本发明的另一个目的是提供一种生产抗虫的转基因单子叶植株的方法，包括川草二号老芒麦愈伤组织再生系统的建立方法和杀虫蛋白基因转化单子叶植物的程序。

将外源基因导入植物的方法是已知的，可使用该方法将类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因构建体插入植物宿主细胞，所述方法包括生物和物理植物转化法，例见Niki等，1993，“将外源DNA导入植物的方法”，植物分子生物学和生物技术方法，Glick和Thompson编，CRC出版公司，Boca Raton，p67-88。选定的方法随宿主植物的不同而不同，包括化学转染法如磷酸钙，微生物指导的基因转移如农杆菌(Horsch等，科学，227：1229-31，1985)，电穿孔，显微注射，基因枪和biolistic轰击。但通过农杆菌介导，把杀虫蛋白基因转入单子叶植物，创建抗虫转基因川草二号老芒麦，这在国内外尚属首次。

单子叶植物遗传转化是否成功的关键之一就是建立其高效而稳定的愈伤组织再生系统。本发明通过选择适宜的外植体材料，优化影响川草二号老芒麦出愈和分化的各种参数，首次建立了高效而稳定的川草二号老芒麦愈伤组织再生系统，为其遗传转化提供了保障。

                            附图说明

图1是pCAMBIA1304-ppIP转化载体构建

图2是pCAMBIA1304-ppIp转化载体的验证：M1和M2为DNA marker，1是pUC18-ppIP质粒的PCR片段，2是pCAMBIA1304质粒PCR，3～6是pCAMBIA1304-ppJP质粒的PCR片段，7是pCAMBIA1304-ppIP质粒NcoI和Bst EII双酶切片段，8是pCAMBIA1304-PPIP质粒。

图3是转化植株的PCR验证：1和15：Marker；2-9是转化植株植株(引物为SCF和SCR)；10是非转化植株(引物为SCF和SCR)；11和13是转化植株(引物为hptII F和hptII R)；12和14是非转化植株(引物为hptII F和hptII R)。

图4是转化植株的Southern杂交鉴定：1-6是转化植株，其中3号插入了3个拷贝，4号植株呈阴性，7是非转化植株

图5是转化植株的Northern杂交鉴定：1-6为转化阳性植株，其中4号植株Northern杂交为阴性，7是非转化植株

图6是川草二号老芒麦抗性愈伤组织的再生过程：A成熟胚诱导的愈伤组织；B潮霉素筛选后的抗性愈伤组织；C和D抗性愈伤组织的分化和再生

                              具体实施方式

下文将通过实施例对本发明做进一步说明，但实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1

川草二号老芒麦愈伤组织再生系统的建立

1.1外植体准备

将成熟种子经过两次温水浸泡和阴干后，剥去外颍壳后，用70％乙醇浸泡90s，再转入0.1％升汞浸泡15min，中间摇动2-3次，用无菌水冲洗3-4次，接种在诱导培养基上。在培养基上生长5d后，取下胚轴(3-5mm)于诱导培养基上进行愈伤组织诱导。在培养基上生长10d后，取其幼叶(3-5mm)于诱导培养基上进行愈伤组织诱导。待长出愈伤组织后，接到继代培养基上培养。每2周继代一次。当愈伤组织形成大量结构致密、颗粒状、黄白色的胚性愈伤组织后，可将胚性愈伤组织转至分化培养基上。经过6-8周培养后，长出1-2cm的幼苗，再将其转移到生根培养基。待苗长大并长出根后经2-3天的温室炼苗后移植到土中。

愈伤组织的诱导和继代培养在黑暗中进行，愈伤组织的分化和幼苗生根培养的培养条件为25-26℃，每日光照12h，光强20001x。愈伤组织诱导和分化频率的计算为：

1.2愈伤组织诱导培养基的筛选

选用单子叶植物愈伤诱导常用的MS，MSN6，N6和NB四种基本培养基，在其愈伤组织诱导培养基上，分别接种120粒成熟的牧草种子，并设置三个重复，30天后计数每种培养基的出愈数，计算其出愈率。

1.32，4-D浓度和不同外植体的选择

设置2mg/L、5mg/L、8mg/L¹和10mg/L四个不同的2，4-D浓度，在MS诱导培养基上，分别对牧草品种的成熟胚、幼叶和下胚轴进行愈伤组织诱导，以期对不同材料的愈伤诱导寻求一个较为适宜的激素浓度。

1.4添加植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响

分别在MS诱导培养基上添加NAA、6-BA、KT和ABA四种植物激素和CH有机物，设置三个重复，每个接种120粒外植体，培养20天后观察出愈情况，并计算出愈率，筛选适宜老芒麦和披碱草出愈的激素种类和有机物。实验结果表明，2，4-D和KT是川草二号老芒麦愈伤组织再生的必须生长调节剂。单独使用2，4-D或其它的植物生长调节剂，川草二号老芒麦的出愈率极低或不出愈，并且难以分化。愈伤组织诱导的最佳的激素组合为5.0mg/L2，4-D和0.05mg/LKT；而愈伤组织分化的最佳激素组合为1.Smg/L2，4-D和0.1mg/LKT。所以愈伤组织诱导的最适培养基为MS基本培养基并添加5.0mg/L2，4-D和0.05mg/L，出愈率可达到85.6％，而最适的分化培养基为1/2MS盐添加1.5mg/L2，4-D和o.1mg/LKT，约有54.3％的愈伤组织能分化出芽并生根。

1.5光照对种子出愈率的影响

在MS诱导培养基上分别接种120枚牧草的成熟胚、幼叶和下胚轴，设置三个重复，分别在光下和黑暗两种条件下培养30天，观察外植体的出愈情况，根据出愈率确定外植体出愈的光照条件。

1.6愈伤组织分化培养基的筛选

在MS，N6，MSN6和NB四种不同的基本培养基上，分别接种50粒质地基本一致的胚性愈伤组织，设置三个重复，在25-26℃，光强20001x条件下，每日光照12h，培养30天，观察愈伤组织的分化情况，选择适宜愈伤组织分化的培养基。

1.7愈伤组织继代培养时间对其分化能力的影响

在愈伤组织易分化的培养基MS和MSN6培养基上，分别接种50粒质地基本一致的胚性愈伤组织，观察继代培养20天、40天、60天、80天和100天后，愈伤组织的分化情况，根据分化率来确定愈伤组织的继代时间。

1.8植物生长调节剂对愈伤组织分化能力的影响

在MS分化培养基里分别添加不同浓度的NAA、KT和NAA与KT组合，观察每种组合愈伤组织的分化率，以确定添加物的种类和浓度。同时，研究减少蔗糖和MS浓度对老芒麦愈伤组织分化率的影响。

实验结果表明，光线和继代时间对愈伤组织的诱导和分化产生影响。暗培养有利于愈伤组织的诱导，光线则利于愈伤组织的分化。刚诱导出的愈伤组织分化能力很弱，继代一定时间后，愈伤组织分化为不同类型的愈伤组织，其中质地紧密，颗粒状，黄色愈伤组织分化能力最强，而其他类型分化能力很弱甚至不分化。同时实验表明，在愈伤组织诱导和分化时，添加一定浓度的酪蛋白，可以有效的改善愈伤组织的质量；在愈伤组织分化时，降低培养基中无机盐特别是钙离子的浓度，可以促进愈伤组织的分化。

1.9川草二号老芒麦组培体系的建立

经过筛选和优化，建立了川草二号老芒麦组培体系的最佳方案：

愈伤组织诱导的培养基配方：(暗培养40d)

MS+2，4-D5.0mg/L+CH600mg/L+KT0.05mg/L+3％Sucrose+1.0％琼脂，pH5.8

愈伤组织继代培养的培养基配方：(暗培养，每4周继代一次，共2次)

MS+2，4-D5.0mg/L+CH600mg/L+KT0.05mg/L+3％Sucrose+1.0％琼脂，pH5.8

愈伤组织预分化的培养基配方(暗培养1周)：

MS+KT0.1mg/L+2，4-D1.5mg/L+2％Sucrose+1％琼脂，pH5.8

愈伤组织分化的培养基配方(26℃，2000Lux，光照培养4周)

1/2MS+KT0.1mg/L+2，4-D1.5mg/L+IBA0.5mg/L+2％Sucrose+1％琼脂，pH5.8

生根培养基的配方：(26℃，2000Lux，光照培养)

1/2MS+NAA2.0mg/L+2％Sucrose+1％琼脂，pH5.8

在此组培体系下，老芒麦成熟胚的出愈率可达到85％以上，分化率在50％以上，移栽成活率达到45％以上(再生过程见附图3)。

实施例2

川草二号老芒麦程序化转基因体系的建立。

2.1川草二号老芒麦转化载体pCAMBIA1304-ppIP的构建。

使用primer premier 5.0分别设计含有NcoI和Bst EII的正向和反向引物，以含有杀虫蛋白基因的pUC18质粒为模板，probest^TM DNA聚合酶，通过PCR高保真克隆出包含杀虫蛋白基因信号肽序列和UTR序列的目的片断。用核酸内切酶NcoI和Bst EH对pCAMBIA1304质粒载体和从PUC18-scp质粒上高保真扩增出的ppIP片段进行双酶切，电泳回收pCAMBIA1304质粒载体约10kb片段和ppIP双酶切后的约900bp的片段。加T4连接酶，以约2∶1的比例加入双酶切后得到的ppIP片段和pCAMBIA1304质粒载体，使连接体系内DNA量达到约10ng/ul，20℃连接4h以上，然后转化大肠杆菌，筛选有KM抗性的菌落，然后挑选抗KM的单菌落，提取质粒，通过双酶切和PCR来验证PPIP片段是否连接到pCAMBIA1304质粒上(具体的构建方法和验证见附图1)。

2.2农杆菌转化

2.2.1大肠杆菌CaCl₂法感受态细胞的制备及转化

大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α感受态细胞的制备。LB平板上挑取DH5α单菌落，在2ml LB培养基中37℃培养过夜。取0.5ml培养物，加入50ml LB培养基中28℃继续培养至OD₆₀₀≈0.5。加入1.5ml离心管中，4℃离心收集菌体。用500μl 0.1mol/L冰CaCl₂重悬，冰浴30分钟后再离心，用200μl 0.1mol/L冰CaCl₂重悬，于0℃保存30分钟至24小时后用于转化。

大肠杆菌的转化。在200μl感受态细胞中加入5-10μl质粒，冰浴30分钟后，迅速放入42℃水浴中热激2分钟，迅速取出后0℃放置2分钟。然后加入800μl LB，37℃培养1小时。最后离心2分钟，将菌体涂布于LB+抗生素的平板上，37℃培养过夜。

2.2.2农杆菌感受态细胞的制备和转化(王关林等，植物基因工程原理与技术，科学出版社，1999).

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，感受态细胞的制备。根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD₆₀₀≈0.5时，4℃离心收集菌体，用0.1mol/L冰CaCl₂重悬，冰浴30分钟后离心，用0.1mol/L冰CaCl₂重悬后，于0℃保存。

冻融法转化根癌农杆菌。在200μl感受态细胞中加入5-10μl质粒，冰浴30分钟后，在液氮中速冻1-2分钟，迅速取出，放入37℃水浴中溶解。溶解完全后加入800μl LB，28℃培养3～5小时。最后离心2分钟，将菌体涂布于LB+利福平(40mg/L)+链霉素(25mg/L)+卡那霉素(75mg/L)平板上，28℃培养2天。

2.3通过愈伤组织转化川草二号老芒麦

2.3.1潮霉素(Hn)有效筛选浓度的试验

设置20mg/L、40mg/L、60mg/L和80mg/L四个潮霉素浓度处理，每个处理接入100个左右长势旺的胚性愈伤组织。26.0℃暗培养10d后，观察愈伤组织生长情况，选择合适的潮霉素筛选浓度。实验结果显示，60mg/L和80mg/L潮霉素浓度造成老芒麦愈伤组织迅速死亡，而细胞在死亡过程中会分泌大量的有毒次生代谢物质，因此在选择培养基上使用这个潮霉素浓度筛选转化细胞，势必造成转化细胞的生长受抑制，影响转化效率。20mg/L潮霉索不能有效抑制老芒麦愈伤组织生长，若用于抗性愈伤组织筛选，容易造成大量的非转化细胞的逃逸。而40mg/L潮霉素既能有效抑制愈伤组织的生长，又不至于造成细胞迅速死亡，是比较理想的筛选浓度。

2.3..2愈伤组织生理状态与农杆菌侵染的关系

取两个不同状态的愈伤组织，即直接诱导25d的愈伤组织和继代8周的愈伤组织。经相同条件的预培养、共培养和抗性筛选，然后统计和比较两处理的抗性愈伤率，选择适合农杆菌侵染的愈伤组织生理状态。实验发现直接诱导产生的愈伤组织的质地较硬，成块状，黄白色：而继代以后的愈伤的质地较松散，颗粒状，黄色。取大小基本相同的两种愈伤，经相同条件的预培养、共培养和筛选培养。试验结果表明，继代培养的愈伤组织经转化后能获得更高的抗性愈伤率。

2.3.3不同预培养和共培养培养基与农杆菌侵染的关系

设置五种不同的预培养和共培养培养基处理。经相同预培养和共培养时间、相同的农杆菌处理浓度和相同筛选培养基的条件培养后，通过统计和比较不同处理的抗性愈伤率，确定最适的预培养和共培养培养基。不同处理的抗性愈伤组织数和抗性愈伤率的结果见下表。

预培养与共培养培养基对抗性愈伤率的影响

  培养基  愈伤数  抗性愈伤数  抗性愈伤率(％)  1  2  3  4  5  100  100  100  100  100  26  31  62  68  71  26  31  62  68  71

注1：培养基

1)：MS+2，4-D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1％AGAR Powder

2)：1/2MS+2，4-D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％AGAR Powder

3)：1/4MS+2，4·D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucosc+1.0％AGAR Powder

4)：1/4MS+100μMAS+CH600mg/L+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％AGAR Powder

5)：AA+2，4-D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％AGAR Powder

注2：培养基pH：预培养培养基pH5.8，共培养培养基pH5.6

统计结果显示，不同的预培养和共培养培养基对农杆菌的侵染影响很大。随着培养基无机盐浓度的降低，抗性愈伤率逐渐增高，也即农杆菌的侵染力逐渐增强。培养基中添加氨基酸和短肽可提高抗性愈伤率，即提高农杆菌对愈伤组织的侵染能力。这些结果与前人结果相同。第五种培养基是常用于农杆菌悬浮的AAM，从结果看，它与第四种培养基产生的抗性愈伤率差异不大。

2.3.4农杆菌处理菌液浓度与其侵染力的关系。

用相同的悬浮培养基配制0.5OD、1.0OD、1.5OD和2.0OD四种农杆菌菌液浓度，分别处理预培养后的质地、大小和生理状态基本一致的愈伤。处理后，经相同的方法共培养和筛选，最后统计和比较不同处理的抗性愈伤率，确定农杆菌的最适使用浓度。

用接种环将LB培养基上生长2d后的农杆菌刮入MS₀液体培养基，振荡培养3～4h，用分光光度计600nm波长光测定，调至0.5OD、1.0OD、1.5OD和2.0OD四种菌液浓度。按前面介绍的方法侵染、共培养和筛选培养。两次筛选培养后，统计抗性愈伤数，结果显示，并不是农杆菌苗液浓度越高，则抗性愈伤率越高；而是1.0OD浓度的农杆菌苗液侵染愈伤组织才能获得最高的抗性愈伤率。

2.3.5共培养温度与农杆菌侵染的关系

预培养后的愈伤组织，经相同的农杆菌苗液处理后，分别置于15℃，19℃，23℃和27℃四种温度条件下共培养。共培养后，经相同的方法和条件筛选，最后统计和比较不同处理的抗性愈伤率，确定最适的共培养温度。实验结果表明，19℃～23℃共培养温度条件下，农杆菌具有最高的侵染活性，产生最高的转化率。

2.3.6程序化转基因体系的建立及其有效性的验证试验

根据各项参数优化试验的结果，建立模式化的农杆菌介导的牧草转基因操作体系，并严格按照这个操作程序进行三次重复实验，验证该实验程序的有效性和稳定性。

2.4转化植物的分子检测

2.4.1转基因植株基因组总DNA的提取、PCR和southern blotting分析

取1-2g新鲜叶片，采用CTAB法抽提待测的植株的基因组DNA。用DNA含量测定仪测定DNA浓度，用TE将各样品的DNA浓度调至300ng/ul和30ng/ul各一份，存于4.0℃备用。以插入了ppIP片断的质粒作阳性对照，非转化植株作阴性对照，通过PCR来验证试验材料的基因组DNA中是否转入了类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(ppIP)和潮霉素磷酸转移酶(hpt II)基因，操作方法见分子克隆实验指南。

通过Southern blotting分析验证ppIP基因是否转入目的植株。取10μg待测材料的基因组DNA，用HindIII消化；取10μg非转化植株的基因组DNA，用同样的酶消化，作阴性对照；同时取10pg质粒pCAMBIA1304-ppIP进行EcoRV酶切，作为阳性对照。电泳检测酶切是否完全。在电压为45V，胶浓度为0.8％的琼脂糖凝胶中电泳16-18h，然后转移到尼龙膜上。用扩增ppIP基因约900bp片断作为杂交探针的模板，采用PCR法对探针实行地高辛-dUTP(digoxigenin(DIG)-dUTP)(PCR DIG Probe Synthesis Kit，Roche)标记。然后用(DIG)-dUTP)标记的PPIP基因探针与尼龙膜上的DNA片段进行杂交，具体操作见植物基因工程(王关林，方宏筠.2002)。

2.4.2转基因植株Northern杂交分析

提取待测植株的总RNA，事先采用乙醇沉淀法将RNA样品浓缩至3μg/μL以上。取30μgRNA，加入甲醛、去离子甲酰胺、10×MOPS和DEPC处理过的水，补足至40μL，混匀后于65℃变性10min，冰上急冷，加入微量溴乙锭和6μL RNase-free的上样buffer，立即上样，在1×MOPS缓冲液中于1v·cm^-1电泳，待溴酚兰迁移至凝胶的一半距离时转膜。使用Southern杂交后收集并保存在-20℃的探针，与膜上的RNA杂交，检测待测植株是否有PPIP基因的转录产物。具体的操作过程见植物基因工程(王关林，方宏筠.2002)。

2.4.4转基因植株的抗虫性鉴定

取杀虫蛋白基因转化体(T1代)的叶片饲喂竹蝗，四天后统计幼虫死亡率。结果表明川草二号老芒麦杀虫蛋白基因转化体具有较高的抗虫性。此结果证明了本发明中的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因在川草二号老芒麦中能够高效表达，并且杀虫效果显著。

2.5农杆菌介导的川草二号老芒麦转基因操作体系及体系效率的验证

根据以上的试验结果，建立操作程序如下：

(1)成熟胚去壳，70％乙醇泡1min，0.15％升汞消毒20min，无菌水洗3～-4次，接种到诱导培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。

(2)诱导培养40d后，取活力强、颗粒状愈伤转入继代培养基继代培养。

(3)取继代培养8周的愈伤颗粒，接入预培养培养基，26℃暗培养4d。然后接入诱导培养

(4)在预培养的第三天，用LB(LB+1.5％琼脂)划线接种农杆菌菌株，28℃静止培养2d之后，将农杆菌全部刮入MS₀液体培养基；28℃，200rpm振荡培养3--4h。分光光度计600nm波长光测定菌液浓度，调至1.0OD。

(5)将预培养后的愈伤组织接入100ml桶形瓶，加入调制好的农杆菌苗液，浸泡30min；中间摇动数次。

(6)倒去菌液，将愈伤置于灭菌滤纸上吸干表面菌液，接入共培养培养基，暗培养3d，

(7)将共培养后的愈伤用无菌水先快速摇动清洗两次；然后加入无菌水浸泡10min，使愈伤组织内部的菌体游离出来；倒去洗液，再加入含400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡15min；倒干洗液，将愈伤置于灭菌滤纸上吸干，接入筛选培养基；26℃暗培养。每两周继代一次，共两次。

(8)将筛选培养基的抗性愈伤组织接入预分化培养基，26℃暗培养一周。

(9)将预分化培养一周的抗性愈伤转入分化培养基(改用三角瓶或平底试管)；25℃，2000Lux光照培养，再生转基因植株。

(10)待小植株3～5cm：转入生根培养基上发根。

(11)将根系健壮的植株移入盆钵，凉棚过渡3～5d；然后移到自然条件下生长，直至成熟。

建立的这个经过优化的转基因体系，效率究竟如何？需要经过试验验证。试验设三个重复严格按上面操作程序，试验结果下表。

农杆菌介导的川草二号老芒麦基因转化系统的转化效率

  处理  愈伤数  抗性愈伤数  抗性愈伤率  分化绿苗的愈伤数  抗性愈伤的绿苗分化率  I  II  III  平均值  132  129  138  133  79  86  83  82.7  59.8％  66.7％  60.1％  62.2％  37  43  39  39.7  28％  33.3％  28.3％  29.8％

从试验的结果看，建立的川草二号老芒麦农杆菌介导的转基因体系具有很高的抗性愈伤率：最高达到66.7％，平均为62.2％；以及很高的转化率，平均为29.8％，完全能满足实际工作的需要。