利用内源性血管生成抑制因子Arresten基因制备蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种基因重组、表达技术，具体为一种利用内源性血管生成抑制因子Arresten基因制备蛋白的方法。解决了现有技术中存在的利用人体中的Arresten基因制备具有抑制肿瘤血管生成的蛋白质过程中存在的效率低下的问题。步骤包括，从人体中提取总RNA，加入上、下游引物，RT－PCR反转录扩增得到Arresten基因的DNA，再取质粒载体pBV220双酶切后与RT－PCR扩增产物Arresten DNA双酶切后连接，得到连接反应产物pBV220－Arr，最后将产物转化入到宿主大肠杆菌中表达，得到Arresten蛋白。与现有技术相比，本发明使用一种同时作为连接载体和表达载体的质粒pBV220，既简单又经济，节省了成本，而且表达效果非常好，提高了合成的效率。为所需目的蛋白的合成提供了一种新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组、表达技术，具体为一种利用内源性血管生成抑制因子Arresten基因制备蛋白的方法。

背景技术

肿瘤是一种典型的血管依赖性疾病，20世纪70年代初，Folkman提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”。新生血管不仅为肿瘤生长提供充足的氧气和营养物质，并及时运走代谢产生的有害物质，而且还以旁分泌的形式刺激肿瘤的生长，促进肿瘤细胞进入血液循环，从而向其它组织器官浸润转移。因此Folkman提出对实体瘤采用抑制血管生成的治疗方法，人的抗血管生成治疗研究始于1988年，最新发现的来源于人基底膜胶原的肿瘤血管生成抑制因子Arresten、Tumstatin、Canstatin、Endostatin和Vastatin、Restin等具有特异性抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖生长作用，其与肿瘤细胞分泌的促血管生长因子相拮抗，从而达到阻止肿瘤血管生成，使肿瘤毛细血管生长萎缩，切断肿瘤营养供应的目的。Arresten是由Colorado等2000年研究发现的一种强有效血管生成抑制因子，在胎盘中表达量高，胎肝中也有表达。它是IV型胶原α1链的羧基末端NCl结构域多肽片段，全长690bp，编码229个氨基酸，等电点为6.4，分子量约为26KD。所以利用人体中的Arresten基因制备具有抑制肿瘤血管生成的蛋白质是当前国内外研究开发的重点，例如Colorado等采用质粒pET22b(+)进行原核表达；郑启昌等采用连接载体pGEM-T，表达载体pET22b(+)，而且用的也是原核表达系统，即大肠杆菌作为表达宿主菌；而卢灿荣等则采用真核表达体系，真核表达载体pcDNA3.1(+)；何爱彬等用T载体pGEM-T作为连接载体，最后在毕赤酵母中表达。这些操作方法都是将连接和表达分开进行，效率比较低下。

发明内容

本发明为了解决现有技术中存在的利用人体中的Arresten基因制备具有抑制肿瘤血管生成的蛋白质过程中存在的制备效率低下的缺点而提供了一种利用内源性血管生成抑制因子Arresten基因制备蛋白的方法。

本发明采用以下技术方案实现的，利用内源性血管生成抑制因子Arresten基因制备蛋白的方法，步骤包括：从人体中提取总RNA，加入上、下游引物，(RT-PCR)反转录扩增得到Arresten基因的DNA，再取质粒载体双酶切后与RT-PCR扩增产物Arresten DNA双酶切后连接，得到连接反应产物，最后将产物转化入到宿主菌大肠杆菌中表达，得到Arresten蛋白；连接及表达载体所用质粒为pBV220，按载体pBV220/目的ArrestenDNA的摩尔数比：1∶1～1∶3，在15～18℃连接8～10小时，得到连接反应产物pBV220-Arr。    

反转录扩增反应条件的起始温度控制在93-95℃，40sec；退火温度56-58℃，40sec，延伸71-73℃，1min，共35个循环。

引物的设计和合成：根据已知的Arresten mRNA基因序列设计出引物，上、下游引物近5′端分别引入限制性内切酶，酶切位点和一对起始密码子及两对终止密码子。

宿主菌大肠杆菌为E.coliJM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)，均由山西医科大学生物化学教研室提供。

大肠杆菌培养温度30℃，时间4个小时，表达一般在42℃，时间4个小时，最佳溶解氧量选择比例在1∶5。

1、四种菌性能筛选对比实验数据如下：

1.1、重组质粒pBV220-Arr在JM109中的表达

(1)将重组质粒pBV220-Arr转化JM109感受态细胞

①-70℃保存的E.coliJM109在Amp阴性的LB平板上划线，37℃恒温箱培养15h；

②从平板中挑取一个直径2mm大小的单克隆菌落，移至含5ml LB培养基的试管中，37℃，220r/min强烈振荡培养8h；

③吸取试管中的菌液2ml转移至100ml LB三角瓶中，37℃ 220r/min强烈振荡培养3h，使细胞浓度达到OD₆₀₀在0.4左右；

④将培养物在冰上放置10min，然后转到两个50ml离心管中，4000r/min，4℃离心10min；

⑤弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余液体，然后加入10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl₂悬浮细胞，置于冰上10min；

⑥4000r/min，4℃离心10min回收细胞，弃上清，分别加入2ml冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，悬浮细胞。按每份200μl分装细胞，若不马上进行转化，分别加入50μl 80％的灭菌甘油，置-70℃冻存。

⑦取本室-70℃保存的pBV220空质粒4μl加入200μl感受态细胞中，温和混匀，置冰上30min；

⑧设立对照，将不加任何质粒的200μl感受态细胞置于冰上30min；

⑨将⑥⑦同时于42℃水浴热休克90sec，迅速放冰上2min，加入800μlLB培养基，37℃，225r/min，振荡培养1h，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白；

⑩取200μl转化混合物铺于LB(Amp⁺)平板，室温下放置20min，待溶液被琼脂吸收后，放置平皿于37℃培养15h；

(2)pBV220-Arr/JM109生长曲线研究

从成功转化的琼脂平板上挑取一个阳性克隆，接种到5ml LB(Amp10μL)液体培养基，30℃，220r/min过夜培养至OD₆₀₀＝1.0左右，取1份样品按照1∶50扩种于50ml(Amp50μL)液体培养基，30℃，分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h取样，然后在600nm波长下测定OD₆₀₀，并绘制pBV220-Arr/JM109生长曲线。如图7所示意

(3)pBV220-Arr/JM109表达蛋白形式的研究

挑取一个阳性克隆，接种于5ml LB(Amp5μL)液体培养基，30℃，200r/min过夜培养至OD₆₀₀＝0.8左右，再按1∶50扩种于100ml LB(Amp100μL)液体培养基，30℃，培养3h至OD₆₀₀＝0.6左右升温至42℃诱导表达，分别于2h、4h、6h、8h，收集1ml菌液，离心收集菌体沉淀和上清；同时将携带有pBV220空质粒的JM109进行诱导表达作为对照。将二者上清和菌体SDS-PAGE凝胶电泳。按照说明书安装电泳槽，配制12％的分离胶和5％的积层胶，取少许样品加入等体积的上样缓冲液，于沸水中煮5min，取20μL上样，进行SDS-PAGE分析。积层胶电压为80V，进入分离胶后加入110V，电泳1h结束后，卸下胶进行考马斯亮蓝染色30min，脱色1h，照相保存。

如图8所示意

1：低分子量标准蛋白质  2：表达前  3：表达后2h  4：表达后4h  5：表达后6h  6：表达后8h

从图8可以看出，JM109菌在2h、4h、6h、8h均能表达Arresten蛋白，其Arresten蛋白表达量分别占到总菌体蛋白表达量的20.92％、24.65％、21.11％和19.08％，结合图及表达量可知重组质粒pBV220-Arr在JM109菌中表达4h达到最佳表达。

1.2、重组质粒pBV220-Arr在DH5α中的表达

(1)将重组质粒pBV220-Arr转化DH5α感受态细胞，方法同1.1(1)

(2)pBV220-Arr/DH5α生长曲线研究，方法同1.1(2)图9

(3)pBV220-Arr/DH5α表达蛋白形式的研究，方法同1.1(3)图10

1：低分子量标准蛋白质  2：表达前  3：表达后2h  4：表达后4h  5：表达后6h  6：表达后8h

从图10可以看出，DH5α菌在2h、4h、6h、8h均能表达Arresten蛋白，其Arresten蛋白表达量分别占到总菌体蛋白表达量的21.06％、24.38％、22.02％和21.15％，结合图及表达量可知重组质粒pBV220-Arr在DH5α菌中表达4h达到最佳表达。

1.3、重组质粒pBV220-Arr在BL21中的表达

(1)将重组质粒pBV220-Arr转化BL21感受态细胞，方法同1.1(1)

(2)pBV220-Arr/BL21生长曲线研究，方法同1.1(2)图11

(3)pBV220-Arr/BL21表达蛋白形式的研究，方法同1.1(3)图12

1：低分子量标准蛋白质  2：表达前  3：表达后2h  4：表达后4h  5：表达后6h  6：表达后8h

从图12可以看出，BL21菌在2h、4h、6h、8h均能表达出Arresten蛋白，其Arresten蛋白表达量分别占到总菌体蛋白表达量的21.08％、25.03％、22.15％和21.22％，结合图及表达量可知重组质粒pBV220-Arr在BL21菌中表达4h达到最佳表达。

1.4、重组质粒pBV220-Arr在BL21(DE3)中的表达

(1)将重组质粒pBV220-Arr转化BL21(DE3)感受态细胞，方法同1.1(1)

(2)pBV220-Arr/BL21(DE3)生长曲线研究，方法同1.1(2)图13

(3)pBV220-Arr/BL21(DE3)表达蛋白形式的研究，方法同1.1(3)图14

1：低分子量标准蛋白质  2：表达前  3：表达后2h  4：表达后4h  5：表达后6h  6：表达后8h

从图14可以看出，BL21(DE3)菌在2h、4h、6h、8h均能表达出Arresten蛋白，其Arresten蛋白表达量分别占到总菌体蛋白表达量的22.12％、26.10％、22.09％和21.26％，结合图及表达量可知重组质粒pBV220-Arr在BL21(DE3)菌中表达4h达到最佳表达。

1.5、重组质粒pBV220-Arr在四种菌中不同时间表达的比较

(1)重组质粒pBV220-Arr在四种菌中表达2h的SDS-PAGE分析

(2)重组质粒pBV220-Arr在四种菌中表达4h的SDS-PAGE分析图15

1：在JM109中表达2h    2：在DH5α中表达2h    3：在BL21中表达2 h

4：在BL21(DE3)中表达2h    5：低分子量标准蛋白质(14.4、20.1、31.0、43.0、66.2、97.4KD)

6：在JM109中表达4h        7：在DH5α中表达4h

8：在BL21中表达4h         9：在BL21(DE3)中表达4h

从图15可以看出，在四种菌中2h、4h均能表达出Arresten蛋白，其Arresten蛋白表达量占到总菌体蛋白表达量在2h、4h分别为20.92％、21.06％、21.08％、22.12％和24.65％、24.38％、25.03％、26.10％，结合图及表达量可知重组质粒pBV220-Arr在BL21(DE3)菌中表达4h达到最佳表达。

(3)重组质粒pBV220-Arr在四种菌中表达6h的SDS-PAGE分析

(4)重组质粒pBV220-Arr在四种菌中表达8h的SDS-PAGE分析图16

1：在JM109中表达6h    2：在DH5α中表达6h    3：在BL21中表达6h

4：在BL21(DE3)中表达6h    5：低分子量标准蛋白质(14.4、20.1、31.0、43.0、66.2、97.4KD)

6：在JM109中表达8h        7：在DH5α中表达8h    8：在BL21中表达8h    9：在BL21(DE3)中表达8h

从图16可以看出，在四种菌中6h、8h均能表达出Arresten蛋白，其Arresten蛋白表达量占到总菌体蛋白表达量在6h、8h分别为21.11％、22.02％、22.15％、22.09％和19.08％、21.15％、21.22％、21.26％。

1.6、培养温度对BL21(DE3)表达Arresten的影响

同时制备3瓶100ml 1∶50扩种的LB氨苄阳性培养基，25℃、30℃、37℃，200r/min，恒温培养至对数生长期(约4h)，制备诱导前样品后升温至42℃诱导表达4h，测菌密度，同时制备表达后样品，共3支；SDS-PAGE，经凝胶分析系统得出定性、定量结论，并收集菌体。图17

1：25℃培养表达样品  2：30℃培养表达样品  3：37℃培养表达样品  4：低分子量标准蛋白质  5：表达前样品

从图17可见，25℃、30℃、37℃三种温度表达4h后42℃诱导4h的表达量都很高，分别为22.15％、26.23％、23.18％，可见30℃培养Arresten蛋白表达量最大，其次为37℃、25℃。

1.7、培养持续时间对BL21(DE3)表达Arresten的影响

同时制备3瓶100ml 1∶50扩种的LB氨苄阳性培养基，30℃，200r/min，恒温分别培养2h、4h、6h，制备诱导前样品后升温至42℃诱导表达4h，测菌密度，同时制备表达后样品，共3支；SDS-PAGE，经凝胶分析系统得出定性、定量结论，并收集菌体。图18

1：培养2h表达样品  2：培养4h表达样品  3：培养6h表达样品  4：表达前样品  5：低分子量标准蛋白质

从上图18可见，Arresten蛋白在2h、4h、6h的表达量分别为23.03％、26.23％、23.86％，可见在培养4h表达量最高。其次是6h和2h。

1.8、诱导温度对BL21(DE3)表达Arresten的影响

同时制备3瓶100ml 1∶50扩种的LB氨苄阳性培养基，30℃，200r/min，恒温分别培养4h，制备诱导前样品后升温至37℃、42℃、48℃诱导表达4h，测菌密度，同时制备表达后样品，共3支；SDS-PAGE，经凝胶分析系统得出定性、定量结论，并收集菌体。图19

1：37℃表达样品  2：42℃表达样品  3：48℃表达样品  4：表达前样品  5：低分子量标准蛋白质

从上图19可见，Arresten蛋白在42℃的表达量最高，占总体蛋白表达量的26.45％，48℃表达次之，为18.38％，而在37℃Arresten蛋白表达量为0％。

1.9、诱导持续时间对BL21(DE3)表达Arresten的影响

同时制备3瓶100ml 1∶50扩种的LB氨苄阳性培养基，30℃，200r/min，恒温分别培养4h，制备诱导前样品后升温至42℃分别诱导表达4h、6h、8h，测菌密度，同时制备表达后样品，共3支；SDS-PAGE，经凝胶分析系统得出定性、定量结论，并收集菌体。图20

1：诱导4h表达样品  2：诱导6h表达样品  3：诱导8h表达样品  4：表达前样品  5：低分子量标准蛋白质

从上图20可知，诱导表达4h Arresten蛋白表达量达到最高，占总体菌蛋白的26.45％，而6h、8h次之，分别为24.86％、22.59％，主要原因在于表达时间过长则会导致菌体生长过老，甚至细菌死亡，蛋白减少。

1.10、溶解氧量对BL21(DE3)表达Arresten的影响

分别于500ml的培养瓶中加入25ml、50ml、100ml、200ml LB氨苄阳性培养基，30℃，200rpm，恒温分别培养4h，制备诱导前样品后升温至42℃分别诱导表达4h，测菌密度，同时制备表达后样品，共4支；SDS-PAGE，经凝胶分析系统得出定性、定量结论，并收集菌体。图21

1：低分子量标准蛋白质  2：表达前样品  3：25ml LB  4：50ml LB  5：100ml LB  6：200ml LB

从上图21可见，溶解氧量比例在1∶5时表达量达到最高，占总体菌蛋白的25.24％，即500ml锥形瓶中装100ml培养基，而在25ml LB、50ml LB、200ml LB中表达量分别为20.35％、22.58％和23.38％，可见溶解氧量也是其中的一个影响因素。

1.11、最优表达条件的组合

在500ml的培养瓶中加入100ml LB氨苄阳性培养基，按1∶50扩种含重组质粒pBV220-Arr的BL21(DE3)，于表达前30℃，200r/min，恒温培养4h，升温至42℃，200r/min，恒温培养4h，分别制备表达前、后样品，SDS-PAGE，经凝胶分析系统得出定性、定量结论，并收集菌体。

小结

(1)大肠杆菌E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)均可表达Arresten蛋白，且对数生长期约为0.5～0.7之间，SDS-PAGE分析显示表达产物分子量约为26KD，表达产物主要以包涵体形式存在；

(2)分别对四种菌不同时间表达产物的SDS-PAGE分析及目的蛋白占总菌体蛋白表达量分析及湿菌重，最终筛选出最优表达菌种为E.coli BL21(DE3)，表达量为26.10％；

(3)最佳培养温度选择30℃，表达量为26.23％；

(4)最佳培养时间选择4h，表达量为26.23％；

(5)最佳表达温度选择42℃，表达量为26.45％；

(6)最佳表达时间选择4h，表达量为26.45％；

(7)最佳溶解氧量选择比例在1∶5，即500ml锥形瓶中装100ml培养基，表达量为25.24％；

(8)通过优化表达，结果在菌BL21(DE3)30℃培养4h，42℃诱导表达4h，溶解氧量比例在1∶5时表达量达到最高，表达量占全菌蛋白的25％以上。

本发明构建了重组质粒pBV220-Arr高效表达体系并在E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)中得到了高表达，同时对表达条件分别从菌种的选择、培养温度、培养持续时间、表达温度、表达持续时间和溶解氧量六个方面进行了优化，四种菌在2h、4h、6h、8h蛋白表达量分别占总菌体蛋白表达量的20.92％、21.06％、21.08％、22.12％；24.65％、24.38％、25.03％、26.10％；21.11％、22.02％、22.15％、22.09％；19.08％、21.15％、21.22％、21.26％。由数据可以看出，在表达4h时，各菌表达量达到最高，表达时间延长则会导致菌体生长过老，甚至细菌死亡，蛋白减少。结合E.coliBL21(DE3)湿菌重明显大于其他菌种，因此选BL21(DE3)为最优表达菌种。同理在选最优表达条件时也是考虑了成本效益之间的关系，选择经济且效益高的、好操作的作为最终条件。最终确定了在500ml的培养瓶中加入100ml LB氨苄阳性培养基中，E.coli BL21(DE3)30℃培养4h，42℃诱导表达4h，为最优表达体系，目的蛋白表达量占菌体总蛋白表达量的25％。经过研究发现，经42℃蛋白表达后以包涵体的形式存在，为了后续工艺生产大量的Arresten蛋白，我们决定采用包涵体的表达方式，这样既有利于目的蛋白的高产量表达，又有利于下游的分离纯化。

Arresten蛋白产物分子量约为26KD，表达产物主要以包涵体的形式存在。以包涵体形式表达的蛋白质可以防止蛋白酶对目的蛋白的降解，并且有利于表达产物的纯化。包涵体中重组蛋白处于部分变性状态，因而不具有同野生蛋白一样的生物学活性，因此包涵体必须经过溶解成单体，再通过复性，才可能使部分蛋白恢复其天然构想，具有生物学活性。

2、Arresten蛋白从菌体内的分离过程优化实验，

实验方法

2.1、超声法破菌获得包涵体

(1)将菌体沉淀用STE缓冲液溶解并4000r/min，10min洗涤2次，以1∶5比例重悬于STE中，并进行分装于20支1.5ml EP管中，每管1ml。

(2)取4支12000r/min，4℃，离心2min，弃上清，每管中分别加入2M、3M、4M、5M尿素1ml，溶解后，静置片刻，以500W，超声3sec，间隔3sec，在冰浴的条件下超声200次。M均指mol/L

(3)将超声后EP管以6000r/min，4℃，离心10min，保留上清备用，沉淀用1ml STE洗涤两次，分别加入8mol/L尿素，混匀，分别制备上清及沉淀样品，进行SDS-PAGE，经凝胶分析系统得出定性、定量结论。

Arresten因子包涵体具有较强的抗剪切能力，直接使用高强度超声法不但避免了溶菌酶的引入，而且破菌效果好。

2.2、包涵体的洗涤和分离

(1)最优获取包涵体

取2.1(1)中的15支EP管，用微量离心机于12000r/min，4℃，离心2min，弃上清，均用2M尿素1ml，溶解后，静置片刻，以500W，超声3sec，间隔3sec，在冰浴的条件下超声200次。

(2)1-5M尿素洗涤包涵体效果评价

2.2(1)的沉淀样品取5支分别加入2M、3M、4M、5M尿素1ml，上下混匀，静置10min，6000r/min，4℃，离心20min，保留上清备用，同法再洗涤一次沉淀，离心取沉淀、上清制备SDS-PAGE样品。如图22

1：低分子量标准蛋白质              2：表达前样品

3：2M尿素洗涤包涵体离心上清样品    4：2M尿素洗涤包涵体离心沉淀样品

5：3M尿素洗涤包涵体离心上清样品    6：3M尿素洗涤包涵体离心沉淀样品

7：4M尿素洗涤包涵体离心上清样品    8：4M尿素洗涤包涵体离心沉淀样品

9：5M尿素洗涤包涵体离心上清样品    10：5M尿素洗涤包涵体离心沉淀样品

随着尿素浓度的增加，Arresten因子包涵体占沉淀总蛋白的百分比逐渐增加，分别占到40.42％、40.46％、40.95％、41.53％，上清中去除的杂质蛋白量也逐渐增加，因子的损失降到最小，但各种浓度之间差别不大，因此选用2M尿素。

(3)Triton X-100洗涤包涵体效果评价

2.2(1)的沉淀样品取3支分别加入1％、2％、4％的Triton X-100溶液各1ml，上下混匀，静置10min，6000r/min，4℃，离心20min，保留上清备用，离心取沉淀、上清制备SDS-PAGE样品。图23

1：1％Triton X-100洗涤包涵体离心沉淀样品    2：2％Triton X-100洗涤包涵体离心沉淀样品

3：表达前样品    4：4％Triton X-100洗涤包涵体离心沉淀样品

从上图可见，1％、2％、4％Triton X-100洗涤包涵体后蛋白分别占总菌体蛋白的35.76％、38.38％、37.91％，由此可见到2％Triton X-100洗涤包涵体效果最好。

(4)综合法洗涤包涵体效果评价

2.2(1)的沉淀样品取4支分别加入2M尿素1ml，在其中3支中分别加入1％、2％、4％Triton X-100溶液，和1M的蔗糖溶液，及少许的EDTA，上下混匀，静置10min，6000r/min，4℃，离心20min，保留上清备用，离心取沉淀、上清制备SDS-PAGE样品。图24

1：2M尿素洗涤包涵体离心上清样品    2：2M尿素洗涤包涵体离心沉淀样品3：2M尿素+1％Triton X-100洗涤包涵体离心上清样品    4：2M尿素+1％Triton X-100洗涤包涵体离心沉淀样品    5：2M尿素+2％Triton X-100洗涤包涵体离心上清样品    6：2M尿素+2％Triton X-100洗涤包涵体离心沉淀样品    7：2M尿素+4％Triton X-100洗涤包涵体离心上清样品    8：2M尿素+4％Triton X-100洗涤包涵体离心沉淀样品    9：表达前样品

从上图可见，三种差别不大，表达量都很高，但2M尿素与2％TritonX-100洗涤效果最好。表达量占菌体蛋白的42.48％。

2.3、包涵体的纯化、复性

(1)用8M尿素溶解的包涵体加入透析袋中，烧杯中加入6M的尿素，用搅拌子搅拌1d；

(2)烧杯中的溶液换为4M的尿素，用搅拌子搅拌1d；

(3)烧杯中的溶液换为2M的尿素，用搅拌子搅拌1d；

(4)烧杯中的溶液换为复性液〔0.6mol/l尿素，0.1mmol/l氧化型谷胱甘肽，20mmol/l Tris·Cl(PH8.0)，0.9mmol/l氧化型谷胱甘肽〕，用搅拌子搅拌1d，重复换液搅拌共3次，并回收复性液；

(5)最后将烧杯中溶液换为PBS液，用搅拌子搅拌1d，回收作为对照。

(6)用考马斯亮蓝法测蛋白浓度。

包涵体复性的方法有一步稀释法和梯度稀释法，本发明用梯度稀释法，采用透析方法复性包涵体，对纯化的溶解蛋白进行重折叠，同时进一步提高了目的蛋白的纯度。透析复性的优点是不增加纯化蛋白溶液的体积，能通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂的去除速度。包涵体的复性效率受多种因素的影响，包括蛋白质的复性浓度，缓冲液pH值，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。在透析复性前，首先将蛋白溶液稀释至融合蛋白浓度约为0.1mg/ml，尿素浓度为6M，并调整溶液pH值至7.4。然后，进行透析使缓冲液中的尿素浓度得以逐级降低，以免尿素下降太快而使蛋白形成聚集体沉淀。表达的目的蛋白中含有半胱氨酸残基，故在复性过程中加入了GSH/GSSG氧化还原体系，以促使二硫键形成。GSH/GSSG氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率。在透析过程中，仍有部分融合蛋白沉淀出来。透析后蛋白悬液经离心分层，上清液即为复性的目的蛋白溶液，沉淀部分为不能正确折叠的目的蛋白。SDS-PAGE分析结果显示，上清中目的蛋白的纯度达到40.5％。

2.4、Arresten蛋白抑制新生血管的鸡胚绒毛尿囊膜实验结果

取不同浓度的Arresten蛋白与阳性对照组比较

(1)鸡胚在38-40℃、60％相对湿度的孵箱内正常发育。实验共使用鸡胚60个，死弱精5个，取材55个，总受精率91.67％，成活率90％。整个CAM的血管呈叶脉状分布。阴性对照组(PBS组、空白组)载体膜下血管生长良好，血管分支适中；20μg/ml组、40μg/ml样品组和阳性对照组的载体膜下血管数明显减少，出现大血管断裂、小血管消失的现象，部分样品出现血管绕行的现象，以20μg/ml实验组、40μg/ml实验组尤甚。

(2)对载体膜周围一级、二级血管生长的影响

以药物载体膜为中心，计数与其边缘相接的一级、二级血管数，进行比较发现阳性对照组、20μg/ml组与阴性对照组(PBS组、空白组)比较无显著性差异，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。说明复性后的Arresten因子抑制血管新生的效果显著。

表1：Arresten因子对鸡胚CAM影响的一级、二级血管计数(X±s)

    组别    N    一级血管数    二级血管数    PBS    空白    Arresten 20μg/ml    Arresten 40μg/ml    阳性对照    6    7    12    13    12    2.26±0.23    2.31±0.58    1.49±0.47*    1.15±0.24*    1.39±0.22*    10.42±3.56    10.69±4.27    8.76±4.58    7.21±2.53*    9.03±3.51

*P＜0.05(与空白组比较)

(3)对载体膜周围大、中、小血管生长的影响

对照组中、小血管数明显较多，与实验组比较有显著性差异，而大血管数无显著性差异，说明Arresten因子主要抑制中、小血管的发生。Arresten与对照组比较无统计学意义。

表2：Arresten因子对鸡胚CAM影响的大、中、小血管计数(X±s)

    组别    N    大血管    中血管    小血管    PBS    空白    Arresten 20μg/ml    Arresten 40μg/ml    阳性对照    6    7    12    13    12    5.80±2.20    5.63±2.31    4.95±3.24    5.61±1.10    5.49±2.51    5.50±2.18    5.38±2.54    3.14±3.26*    2.02±1.35*#    4.22±1.26    81.00±11.56    79.26±10.89    41.49±12.53*    38.68±10.52*    40.22±11.35*

*P＜0.05(与空白组比较)  #P＜0.05(与阳性组比较)

(4)对载体膜下血管生长的影响

图1：阴性对照组    图2：阳性对照组    图3：Arresten组

由图1、2、3看出，阴性对照组没有抑制血管生成的作用，阳性对照组和Arresten组均有抑制血管生成的作用，但Arresten组抑制血管生成的活性比阳性对照组强。

以上研究结果显示，本发明制备的重组人Arresten蛋白对体外血管内皮细胞的增殖和迁移具有抑制作用，并能有效抑制体内的新生血管形成；即重组人Arresten蛋白能在细胞和整体水平上显著抑制血管生成。总之，人Arresten重组蛋白能有效抑制血管内皮细胞的增殖、迁移以及体内血管生成，在肿瘤的抗血管生成治疗方面显示出良好的应用前景。载体pBV220是由中国研究人员成功构建的(购自上海生物工程技术有限公司)，全长3666bp，闭环双链，含有多克隆位点，温度敏感阻遏蛋白，Amp阳性位点及复制起始点、转录中止序列等。本发明选用原核表达体系，在原核细胞中高效表达外源基因时，需要一个可调控的启动子，因为某些外源蛋白对宿主细胞可能有毒，并在短时间内快速合成外源蛋白质，可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白的破坏作用。pBV220载体为PRPL启动子，温控诱导表达，PR和PL启动子为λ噬菌体启动子，为强启动子，受λ噬菌体CI基因的负调控，CI阻遏蛋白是温度敏感蛋白，在28-30℃时，CI阻遏蛋白产生抑制作用，在升温至42℃，CI被破坏，PR和PL启动子开始转录，利用温度控制，使宿主菌在30℃生长，42℃诱导表达目的蛋白。温控诱导的方式合理地调节了宿主菌的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，减少了大量外源蛋白给宿主菌生长和代谢带来的损伤。

与现有技术相比，本发明使用了一种同时作为连接载体和表达载体的质粒pBV220，既简单又经济，节省了成本，而且表达效果非常好，提高了合成的效率。为所需目的蛋白的合成提供了一种新途径。

附图说明

图1为阴性对照组

图2为阳性对照组

图3为Arresten蛋白组

图4为人胎盘组织中总RNA变性胶电泳图

图5为人Arresten基因cDNA的RT-PCR

图6为PCR产物的克隆纯化及酶切鉴定

图7为pBV220-Arr/JM109的生长曲线

图8为重组质粒pBV220-Arr在JM109菌中表达前后SDS-PAGE分析

图9 pBV220-Arr/DH5α的生长曲线

图10重组质粒pBV220-Arr在DH5α菌中表达前后SDS-PAGE分析

图11 pBV220-Arr/BL21的生长曲线

图12重组质粒pBV220-Arr在菌BL21中表达前后SDS-PAGE分析    

图13 pBV220-Arr/BL21(DE3)的生长曲线

图14重组质粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中表达前后SDS-PAGE分析

图15重组质粒pBV220-Arr在四种菌表达蛋白2h、4h的SDS-PAGE分析

图16质粒pBV220-Arr在四种菌表达蛋白6h、8h的SDS-PAGE分析

图17重组质粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同培养温度表达前后SDS-PAGE分析

图18重组质粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同培养时间表达前后SDS-PAGE分析

图19重组质粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同诱导温度表达前后SDS-PAGE分析

图20重组质粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同诱导时间表达前后SDS-PAGE分析

图21重组质粒pBV220-Arr在菌BL21(DE3)中不同溶解氧量表达前后SDS-PAGE分析

图22图3-1  2-5M尿素洗涤Arresten因子包涵体SDS-PAGE结果

图23 Triton X-100洗涤Arresten因子包涵体SDS-PAGE结果

图24综合法洗涤Arresten因子包涵体SDS-PAGE结果

具体实施方式

实施例1

3、材料与试验方法

3.1材料

3.1.1标本

胎盘组织    由山西医科大学第二附属医院妇产科提供。

3.1.2质粒和菌株

宿主菌E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)和原核表达载体pBV220均由山西医科大学生物化学教研室-70℃保存提供。

JM109：基因型recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyr A96 relA1 thiΔ(lac-proAB)F′[traD36 proAB⁺lac I ^qlacZΔM15]

DH5α：基因型supE44ΔlacU169(80 lacZΔM15)hsdR17 recA1 endA1gyrA96 thi-l relA1

BL21：基因型F^-，ompT，hsdS_B(r_B^-，m_B^-)gal，dem

BL21(DE3)：基因型hsdSgal(λcI ts857indl Sam7 nin5 lacUV5-T7基因1)pBV220空质粒载体：全长3666bp，氨苄青霉素抗性(Amp⁺)，为温控诱导表达载体，具有P_RP_L强串联启动子。

3.1.3主要试剂

TRIzol试剂为Invitrogen产品，PCR反转录试剂盒、100bp DNA LadderMarker购自宝生物工程(大连)有限公司，T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH I、EcoR I、Pvu II、Lambda DNA/HindIII+EcoR I Markers均购自华美生物工程公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，琼脂糖(Agrose)、低熔点琼脂糖购自Promega公司，胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品，其它试剂均为国产分析纯。

3.1.4培养基和溶液

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，10g/L酵母提取物，调节pH至7.4，高压灭菌。

LB(Amp⁺)培养基：含100mg/L Amp的LB培养基。

LB(Amp⁺)平板：含100mg/L Amp的LB平板。

STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA，高压消毒灭菌，4℃保存。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1％SDS(新鲜配制)。

溶液III：60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5ml水。

5×TBE缓冲液(每升)：54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

3.1.5、引物设计和合成

根据GenBank中报道的Arresten mRNA序列(序列号：AF258349)，用DNAman软件设计引物，上、下游引物近5′端分别引入限制性内切酶BamHI、EcoR I(划线部分)酶切位点和一对起始密码子及两对终止密码子(着重号部分)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物5′--GCCGAATTCATGTCTGTTGATCACGGC  3′

下游引物5′-GCGGATCCCTATTATTATGTTCTTCTC  3′

3.2、试验方法

3.2.1胎盘组织中总RNA的提取和检测

(1)用TRIzol试剂从健康中国人胎盘组织中提取总RNA。

①取100mg新鲜的胎盘组织，在液氮中研磨成粉末；

②待液氮挥发干，立即加入1ml TRIzol，融化后，用加样枪吸打，使样品充分裂解，移入1.5ml离心管中，室温静置5min；

③在离心管中加入0.2ml预冷的氯仿，振荡混匀；

④将离心管在4℃，12000r/min，离心15min；

⑤用移液器小心吸出上层水相(不要吸取中间白色的那层)，加入另一离心管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，振荡混匀；

⑥-20℃沉淀过夜；

⑦4℃，12000r/min，离心15min；

⑧小心移出上清；

⑨沉淀中加入1ml 75％预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，4℃，12000r/min，离心5min；

⑩重复用75％预冷的乙醇洗涤一次RNA沉淀，去上清，稍微凉干，RNA略显透明，加入20μL RNase-free的水充分溶解。

(2)定量和检测总RNA

①紫外定量和检测

i用752紫外光栅分光光度计检测RNA的产量，在260nm的吸光度，1OD＝40μg/ml；

ii根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

②琼脂糖凝胶电泳检测

i配制1％的琼脂糖凝胶

Agrose           0.25g

5×TBE缓冲液     2.5ml

去离子水         22.5ml

微波炉加热熔解Agrose，稍微冷却至60℃，加入

10mg/mL溴乙锭    1.25μL

摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×TBE缓冲液中平衡10分钟，待用。

ii样品变性

5×Loading Buffer           2μL

RNA样品                     1μg

RNase-free水                调节至10μL

65℃变性5min，立即置于冰上冷却。

iii电泳

将处理好的RNA样品，稍微离心，加入加样孔中，60V恒压电压10min电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。

鉴定检测结果：

从正常人的胎盘组织中提取总RNA，甲醛变性电泳可见清晰的三条带，即5.8s、18s、28s，且28s亮度是18s的两倍，结果见图4，符合要求。

紫外定量和检测总RNA：

OD₂₆₀＝0.019，OD₂₈₀＝0.010，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.9，正好在RNA的正常值范围内，RNA的浓度为0.76μg/ml

3.2.2、RT-PCR扩增Arresten及回收纯化

(1)阳性对照

①反转录反应

i反应体系为：    MgCl₂                    2μL

                 10×RT Buffer             1μL

                 RNase Free dH₂O          3.75μL

                 dNTP Mixture(10mmol/L)    1μL

                 RNase Inhibitor           0.25μL

                  AMV逆转录酶               0.5μL

                  Random 9 mers             0.5μL

                 Positive Control RNA      1μL

                  Total                     10μL

ii反应条件为：    30℃                  10min

                  42℃                  30min

                  99℃                  5min

                  5℃                   5min

②PCR反应

i反应体系为：     反转录反应液                    10μL

                  5×PCR Buffer                   10μL

                  灭菌蒸馏水                      28.75μL

                  TaKaRa Ex Taq^TMHS              0.25μL

                  Control F-1 Primer              0.5μL

                 Control R-1 Primer              0.5uL

                  Total                           50μL

ii反应条件为：    94℃              2min          1Cycle

                  94℃              30min

                  55℃              30sec

                  72℃              1min          30 Cycle

(2)Arresten

①反转录反应

i反应体系为：     MgCl₂                      2μL

                  10×RT Buffer               1μL

                  RNase Free dH₂O            3.75μL

                  dNTP Mixture(10mmol/L)      1μL

                  RNase Inhibitor             0.25μL

                  AMV逆转录酶                 0.5μL

                  Random 9 mers               0.5μL

                 总RNA                       1μL

                  Total                       10μL

ii反应条件为：    30℃                  10min

                  42℃                  30min

                  99℃                  5min

                  5℃                   5min

②PCR扩增反应体系

i反应体系为：     反转录反应液                  10μL

                  5×PCR Buffer                 10μL

                  灭菌蒸馏水                    28.75μL

                  TaKaRa Ex Taq^TMHS            0.25μL

                  Control F-1 Primer            0.5μL

                 Control R-1 Primer            0.5μL

                  Total                         50μL

ii反应条件为：    94℃            2min          1Cycle

                  94℃            40sec

                  57℃            40sec

                  72℃            1min          35 Cycle

                  72℃            延伸5min

(3)分别取阳性对照和Arresten扩增产物各10μL，用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余存放于-20℃以备后用。

(4)PCR产物的切胶回收纯化

①用1×TBE配制2％低熔点琼脂糖凝胶，并且在制胶的过程中使用宽梳子；

②将100μL扩增产物和20μL 6×loading buffer混匀后全部上样，80V电泳40min，将凝胶小心放到长波紫外灯下，照射时间尽可能短，用一干净锋利的刀片从琼脂糖凝胶中切取目的DNA片段，尽量少切凝胶，将胶条转移到一个1.5mL的无菌EP管中；

③加入1ml Binding BufferII，置于56℃水浴中10min，使胶彻底熔化。加热熔胶时，每2min混匀一次；

④将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000r/min室温离心1min；

⑤取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μL Wash Solution，8000r/min室温离心1min；

⑥重复步骤⑤一次；

⑦取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000r/min室温离心15sec；

⑧将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加40μLElution Buffer，37℃放置2min；

⑨12000r/min室温离心1min以洗脱DNA，将获得的DNA置-20℃保存；

⑩取2μL纯化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

鉴定结果：从人的胎盘组织中提取总RNA，进行RT-PCR扩增，扩增产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳，结果见图5，在相对分子量为700bp处，有特异性扩增条带，为拟扩增的目的基因片段，其分子量为718bp。如附图5

1:100bp DNA Ladder Marker    2：RT-PCR扩增产物(718bp)    3：Control RNA作为阳性对照(462bp)

3.2.3、质粒载体pBV220的获取及回收、纯化(为常规技术)

3.2.4、PCR产物及质粒pBV220的双酶切、连接

(1)BamH I酶切

              10×Buffer E                  2μL

              Acetylated BSA(1mg/ml)        2μL

              BamH I                        0.5μL

              纯化的DNA底物                 5μL

             无菌去离子水                  10.5μL

                                            20μL

加入内切酶后缓慢抽吸3次进行混合，37℃恒温箱孵育3h

(2)无水乙醇沉淀DNA

将20μL移至1.5ml EP管中，加入40μL冰预冷的无水乙醇，混匀，在4℃冰箱里冰上放置1h，12000r/min，4℃离心10min，弃上清，蒸发痕量乙醇。

(3)EcoR I酶切

              10×Buffer H                  2μL

              Acetylated BSA(1mg/ml)        2μL

              EcoR I                        0.5μL

              BamH I酶切并沉淀后DNA底物     0.5μL

             无菌去离子水                  15.5μL

                                            20μL

加入内切酶后缓慢抽吸3次进行混合，37℃恒温箱孵育3h，同时行1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

(4)酶切片段的挖块回收及纯化

方法同3.2.2(4)同时测OD₂₆₀与OD₂₈₀，得出各自浓度

(5)纯化的Arresten片段和pBV220载体片段的连接

按载体/目的DNA的摩尔数比：1∶2，则此反应体系如下：

              纯化的Arresten基因片段        13μL

              pBV220载体酶切基因片段        12μL

              T₄DNA连接酶                  2μL

              10×连接缓冲液               3μL

                                            30μL

16℃连接过夜一般为8～10小时，得到连接反应产物pBV220-Arr。

3.2.5、连接产物的鉴定

转化受体菌并进行碱裂解提取质粒，经PCR及经BamH I、EcoR I、PvuII分别酶切后行0.8％琼脂糖凝胶电泳.结果见图6，表明目的基因片段被成功克隆。

1：PCR产物PCR鉴定  2、4：重组质粒pBV220-Arr(4365 bp)  3：纯化的pBV220  5：Lambda DNA/HindIII+EcoR I Markers(5148/4973、4269、3530、2027、1904、1587、1375、941、831、564)  6：100bpDNA Ladder Marker(1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100)  7：纯化的Arresten8：酶切鉴定(约3645、565、150、10)

3.2.6、DNA序列测定

取含有重组质粒的菌液1ml，用pBV220F引物由上海生工基因组DNA测序仪序列测定。结果显示，Arresten基因的mRNA长度为690 bp，编码229个氨基酸。＞0719068(JM109)PBV220+sequence exported from chromatogramfile

测序表明其所编码的氨基酸与GenBank中编码人IV型胶原α1链非胶原末端229个氨基酸基本一致。但本试验从人胎盘中提取Arresten基因与美国Colorado等报道的人Arresten基因编码区cDNA序列(GenBank中报道的基因注册号：AF258349)的同源性达99％，有4个基因位点不同，即第132位由A变为C，第148位由G变为A，200位由T变为C，236位由A变为G。氨基酸由甘氨酸GGC变为甘氨酸GGA，丙氨酸GCC变为苏氨酸ACC，异亮氨酸ATT变为苏氨酸ACT，酪氨酸TAC变为半胱氨酸TGC。

3.2.7、pBV220-Arr/JM109菌株的扩增和保存

将测序正确的菌株新铺于LB琼脂(Amp⁺)平板上，37℃倒置培养24h，挑取阳性克隆，接种于5ml LB(Amp10μL)液体培养基中，37℃、220 rpm过夜培养至OD₆₀₀约为0.6左右，然后取0.2ml加入到灭菌EP管中，加入50μL灭菌甘油，-70℃保存。

4、Arresten因子分离纯化

4.1材料

4.1.1试剂

(1)尿素、TritonX-100为上海生工进口分装产品，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽为北京鼎国生物技术发展中心，其它试剂同此

(2)鸡胚60颗由太原市小店区华夏种鸡场提供，0.22μm滤膜为Sigma公司产品，Arresten因子产品由本室制备，其它试剂均为国产分析纯。

4.1.2仪器

KS-600超声波粉碎机    宁波仪器厂

4.2、实验方法

4.2.1超声法破菌获得包涵体

(1)将菌体沉淀用STE溶解并4000r/min，10min洗涤2次，以1∶5比例重悬于STE中，并进行分装于20支1.5ml EP管中，每管1ml。

(2)取4支12000r/min，4℃，离心2min，弃上清，每管中分别加入2M(mol/L)、3M、4M、5M尿素1ml，溶解后，静置片刻，以500W，超声3sec，间隔3sec，在冰浴的条件下超声200次。

(3)将超声后EP管以6000r/min，4℃，离心10min，保留上清备用，沉淀用1ml STE洗涤两次，分别加入8mol/L尿素，混匀，分别制备上清及沉淀样品，进行SDS-PAGE，经凝胶分析系统得出定性、定量结论。

4.2.2、包涵体的洗涤和分离

(1)最优获取包涵体

取4.2.1(1)中的15支EP管，用微量离心机于12000r/min，4℃，离心2min，弃上清，均用2M尿素1ml，溶解后，静置片刻，以500W，超声3sec，间隔3sec，在冰浴的条件下超声200次。

(2)1-5M尿素洗涤包涵体效果评价

4.2.2(1)的沉淀样品取5支分别加入2M(mol/L)、3M、4M、5M尿素1ml，上下混匀，静置10min，6000r/min，4℃，离心20min，保留上清备用，同法再洗涤一次沉淀，离心取沉淀、上清制备SDS-PAGE样品。

(3)Triton X-100洗涤包涵体效果评价

4.2.2(1)的沉淀样品取3支分别加入1％、2％、4％的Triton X-100溶液各1ml，上下混匀，静置10min，6000r/min，4℃，离心20min，保留上清备用，离心取沉淀、上清制备SDS-PAGE样品。

(4)综合法洗涤包涵体效果评价

4.2.2(1)的沉淀样品取4支分别加入2M尿素1ml，在其中3支中分别加入1％、2％、4％Triton X-100溶液，和1M的蔗糖溶液，及少许的EDTA，上下混匀，静置10min，6000r/min，4℃，离心20min，保留上清备用，离心取沉淀、上清制备SDS-PAGE样品。

4.2.3、包涵体的复性、纯化

(1)用8M尿素溶解的包涵体加入透析袋中，烧杯中加入6M的尿素，用搅拌子搅拌1d；

(2)烧杯中的溶液换为4M的尿素，用搅拌子搅拌1d；

(3)烧杯中的溶液换为2M的尿素，用搅拌子搅拌1d；

(4)烧杯中的溶液换为复性液(0.6mol/l尿素，0.1mmol/l氧化型谷胱甘肽，20mmol/l Tris·Cl(PH8.0)，0.9mmol/l氧化型谷胱甘肽)，用搅拌子搅拌1d，重复换液搅拌共3次，并回收复性液；

(5)最后将烧杯中溶液换为PBS液，用搅拌子搅拌1d，回收作为对照。

(6)用考马斯亮蓝法测蛋白浓度，

实施例2：

试验方法同实施例1，区别在于Arresten的PCR扩增反应体系

反应条件为：    93℃              2min         1Cycle

                93℃              40sec

                56℃              40sec

                71℃              1min         35Cycle

                71℃              延伸5min

纯化的Arresten片段和pBV220载体片段的连接，按载体/目的DNA的摩尔数比：1∶1，15℃连接过夜，时间为10小时，得到连接反应产物pBV220-Arr。

实施例3：

上述试验方法同实施例1，区别在于Arresten的PCR扩增反应体系

反应条件为：    95℃               2min        1Cycle

                95℃               40sec

                58℃               40sec

                73℃               1min        35Cycle

                73℃               延伸5min

纯化的Arresten片段和pBV220载体片段的连接，按载体/目的DNA的摩尔数比：1∶3，18℃连接过夜，时间为8小时，得到连接反应产物pBV220-Arr。

                 英文缩略语(Abbreviation)

英文缩写             英文全称                            中文全称

LB                 Luria-Bertani medium                  LB培养基

AMP                Ampicillin                            氨苄青霉素

EDTA               Ethyline diaminetertraaacetic acid    乙二胺四乙酸

Tris               Tris(hydroxyrnethyl)aminomethane      三(羟甲基)氨基己烷

SDS                Sodium dodecyl sulfate                十二烷基磺酸钠

r/m                Revolutions per minute                每分钟转速

RNase              ribonuclease                          RNA酶

EB                 ethidium btomide                      溴化乙锭

PCR                prolymerase chain reaction            聚合酶链式反应

OD                 optical density                       光吸收值

PBS                phosphatic buffer solution            磷酸盐缓冲液

PAGE               polyacrylamide gel electrophoresis    聚丙烯酰胺凝胶电泳

DTT                dithiothreitol                        二硫苏糖醇

KD                 kilodaltons                           千道尔顿

RT                 room temperature                      室温

PH                                                       酸碱度

SDS-PAGE                                                 变性胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳

AP                 ammonium persulfate                   过硫酸胺。