光化学交联表面修饰生物材料的方法

摘要

本发明的目的在于提供一种用光化学交联凝胶对生物材料进行表面修饰和改性使其具有良好血液相容性和组织相容性的方法。本发明是这样实现的：a.将人工植入体浸泡在有机溶剂中超声清洗，干燥；b.在生物材料的表面上涂覆全氟磺酸；c.配制聚乙烯醇、重氮树脂和生物活性物质的混合溶液，并将其涂布到生物材料的表面上；d.干燥后利用紫外光照射高分子涂层，通过光化学反应使涂层内高分子之间发生共价键交联。

说明书

技术领域：

本发明属于生物医学材料领域，涉及一种用光化学交联对人工植入体进行表面修饰和改性使其具有良好血液相容性和组织相容性的方法。

背景技术：

生物相容性包括血液相容性和组织相容性，是生物材料应用的基本要求。除了设计、制各性能优异的新材料外，通过对传统材料进行表面化学处理(表面接枝大分子或基团)、表面物理改性(等离子体、离子注人或离子束)和生物改性是提高生物材料的生物相容性的最有效途径。利用细胞学和分子生物学方法可将蛋白质、细胞生长因子、酶及多肽等固定在现有材料的表面，并通过表面修饰构建新一代的分子生物材料，来引发我们所需的特异生物反应，抑制非特异性反应。目前，可以通过肝素、尿激酶等的表面固定化提高材料的抗凝血性；通过Fibronectin和Insulin等的固定化增加细胞在材料表面的粘附力和生长速度；通过酶的固定化赋予材料以生物催化的功能以及通过抗体、抗原的表面固定化使材料具有亲和层析的功能等。

与血液相容性好的生物材料不仅要具有生物活性，同时还要具有抗凝血和抗容血作用。特别是对人工血管和插入血管里的导管来说，其抗凝血性，抗菌性和抗磨(或亲水润滑)性是非常重要的，它关系到治疗的成败。尽管膨体聚四氟乙烯(ePTFE)已成功地应用于较大直径血管的制造，但对于直径小于6mm的血管，由于血液凝结或组织堵塞的原因，这些材料无能为力。虽然在经过不断的改进和修饰后，长期通畅率有一定的提高，但与自体隐静脉相比仍不能获得满意的效果，血液相容性和组织相容性问题还远未解决，给动脉搭桥手术带来一系列问题。由于只有人工血管的表面与血液接触，所以目前的工作主要集中在对现有材料表面修饰与改性上，以达到血管植入的要求。

肝素(Hep)是一种天然的凝血抑制剂，具有很强的抗凝血作用。通过将肝素分子固定在人工血管的表面上来提高其抗凝血性能的方法一直是研究的热点。早期的研究人员使用离子键合的方式将肝素固定于生物材料的表面。从表面缓慢溶解下来与抗凝血酶-III(AT-III)在表面附近粘结在一起形成活的抗凝血剂。但由于溶解作用，肝素很快耗尽，因此这种方法只适用于短期血液导管。后来，人们将肝素通过共价键结合的方式将肝素直接连接于基体表面，稳定性大大提高，可适用于长期血液导管和人工血管。但就固定化肝素的抗凝血性能来说，一般却正好相反。因为硬连接的肝素不仅降低了人工血管的弹性而且不能与抗凝血酶很好的配合。因此，如何提高共价键合肝素的抗凝血性，同时又不影响材料的本体性能，一直是生物材料肝素化研究的主要内容。研究表明如果使肝素分子与聚合物表面保持一定距离将提高抗凝血性能。此外，为了使固定化肝素具有较高的抗凝血性，除了减少固定化对肝素生物活性的影响外，还应该提高材料表面固定化肝素的浓度。

设计互相穿插的聚合体网状物材料时，在各种各样的亲水性聚合体中，聚乙烯醇(PVA)已经成为生物技术和生物医学领域的首选。PVA作为一种基本材料应用于生物医学领域的各个方面，包括皮肤移植材料，人造软骨替换等等，主要原因在于它的固有的非毒性、非致癌性，好的生物相容性，合适的物理特性，例如天然弹性，在水溶液中高度膨胀和很好的成膜特性。以乙烯醇水凝胶作为人工血管等人工植入体的覆盖物，虽然能够增加其表面的亲水性和组织相容性，但是却缺少相应的抗凝血性能。若将乙烯醇与肝素分子结合起来，既能增强人工血管的亲水性和组织相容性，又能其抗凝血活性。肝素和乙烯醇本身都具有强的亲水性和较多的活性官能团，但是构成人工血管的聚四氟乙烯等聚合物具有很强的化学惰性和疏水性，不能与肝素或乙烯醇分子直接反应。因此，共价结合法的主要步骤是对构成人工血管的聚合物材料表面进行化学预处理，使其具有和肝素或乙烯醇分子的反应能力，然后再键合肝素或乙烯醇分子。目前虽然存在多种对人工血管预处理的方法，但均存在所需仪器设备昂贵、对材料本体结构有影响、操作工艺复杂等问题，难以广泛使用。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种用光化学交联凝胶对生物材料进行表面修饰和改性使其具有良好血液相容性和组织相容性的方法。本发明是这样实现的：a、将人工植入体浸泡在有机溶剂中超声清洗，干燥；b、在生物材料的表面上涂覆全氟磺酸；c、配制聚乙烯醇、重氮树脂和生物活性物质的混合溶液，并将其涂布到生物材料的表面上；d、干燥后利用紫外光照射高分子涂层，通过光化学反应使涂层内高分子之间发生共价键交联。

本发明的方法具有以下优点：

(1)不需要对生物材料进行化学预处理，既经济又可避免由于预处理对材料本体性能造成的损害。

(2)在生物材料的表面涂覆聚乙烯醇使肝素等生物活性分子与生物材料表面有一定距离，从而提高其生物活性，克服了在传统固定化方法中将生物活性分子硬连接到材料的表面使其生物活性降低的缺点。

(3)采用肝素/重氮树脂/聚乙烯醇复合凝胶对生物材料进行表面修饰与改性，不仅可提高其抗凝血性能，而且可大大增强其组织相容性。

(4)将含肝素等生物活性分子的凝胶通过光化学交联固定在生物材料的孔隙中，不仅大大增加了生物活性分子的表面浓度，还可以延缓其释放时间。

(5)本发明工艺简单，反应条件温和，易操作，重现性好，环境友好，适用于多种复杂体型的材料表面、生物医用装置和多孔组织工程支架材料及其宏观制品的表面修饰，具有良好的应用前景。

附图说明：

图1为紫外交联前后灌注了(DR-PVA-Hep)凝胶的聚四氟乙烯血管的表面衰减全反射红外光谱(ATR)：(1)为未交联的ePTFE人工血管；(2)为交联后的ePTFE人工血管。

图2为灌注修饰前后聚四氟乙烯血管的血小板粘附扫描电镜检测结果：A和B为聚四氟乙烯人工血管(ePTFE)；C和D为灌注了(DR-PVA-Hep)凝胶的聚四氟乙烯人工血管(ePTFE)。其中A和C放大倍数为500倍，B和D为5000倍。

具体实施方式：

具体实施方式一：本实施方式是这样实现的：a、将生物材料浸泡在有机溶剂中超声清洗，干燥；b、在生物材料的表面上涂覆全氟磺酸；c、配制聚乙烯醇、重氮树脂和生物活性物质的混合溶液，并将其涂布到生物材料的表面上；d、干燥后利用紫外光照射高分子涂层，通过光化学反应使涂层内高分子之间发生共价键交联。

本实施方式中，生物材料可以是包括膨体聚四氟乙烯在内的各种材料制成的各种口径的人工血管，也可以是各种材料制成的各种口径的血导管、聚合物膜或多孔支架，以及用玻璃、陶瓷、硅、各种金属或各种聚合物等材料制成的各种形状的生物医学装置，优选聚四氟乙烯人工血管。

本实施方式中，清洗生物材料用的有机溶剂为无水乙醇、丙酮、甲醇或者它们的混合物。

本实施方式中，重氮树脂可选用二苯胺-4-重氮树脂、取代二苯胺重氮树脂(如3-甲氧基二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-4-重氮树脂、2-硝基二苯胺-4-重氮树脂、2-磺酸二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-2-重氮树脂)中的一种或几种的混合物，优选二苯胺-4-重氮树脂。

本实施方式中，聚乙烯醇可选用各种分子量的聚乙烯醇，优选为MW：85K-146K。

本实施方式中，生物活性物质包括肝素、硫酸肝素、水蛭素、细胞黏附因子、细胞生长因子或细胞分化因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子(VGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)、各种抗生素(如ciprofloxacin、托普霉素和利福平等)，优选肝素。

具体实施方式二：本实施方式是这样实现的：

(1)人工血管预处理：将人工血管于无水乙醇中超声清洗1-300分钟，在10～150℃下干燥0.1-24小时。

(2)用0.01～30wt％全氟磺酸溶液灌注人工血管，浸泡1-300分钟，晾干。

(3)配制聚乙烯醇、重氮树脂和肝素的混合水溶液，灌注已干燥的人工血管，晾干。

(4)利用紫外光照射人工血管，通过光化学反应使涂层内高分子之间发生共价键交联。

本实施方式步骤(1)中，超声时间优选为30分钟，干燥温度优选为60℃，干燥时间优选为0.5小时。

本实施方式步骤(2)中，全氟磺酸溶液的浓度优选为0.1wt％，浸泡时间优选为1小时，室温下干燥时间优选为24小时。

本实施方式步骤(3)中，混合溶液中肝素优选浓度0.5wt％，聚乙烯醇的优选浓度为7.8wt％，重氮树脂的浓度优选为0.21wt％。

本实施方式步骤(4)中，紫外光照射时间优选为30分钟。

本实施方式采用灌注和浸泡的方式将全氟磺酸吸附在人工血管的表面上和孔隙间，增加了化学惰性很强的聚四氟乙烯人工血管表面的亲水性。这样，可以方便地将肝素/重氮树脂/聚乙烯醇凝胶沉积到人工血管的表面上和孔隙间。重氮树脂上的重氮基团(-N₂⁺)能够分别与聚乙烯醇上的羟基(-OH)和肝素上的羧基(-COOH)共价结合，从而将肝素共价结合到人工血管表面上。这样一方面能够提高人工血管表面肝素的稳定性，一方面也能够通过改变肝素/重氮树脂/聚乙烯醇凝胶的摩尔比来提高肝素的含量。肝素/重氮树脂/聚乙烯醇凝胶结合的反应示意图如下：

对修饰前后的人工血管进行称重，前后质量差为(0.3221-0.1982g＝0.1239g)，因此涂层质量为625mg/g。经过进一步计算，肝素在人工血管表面的浓度约为20mg/g。由此可见，与修饰前相比，修饰后人工血管的质量明显增加，从而初步证明了含大量肝素的凝胶涂层已经涂布在人工血管的表面。

本实验用表面衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)检测肝素化的人工血管(ePTFE-Nafion-DR/PVA/Hep)。可看到在1203和1147cm^-1处有强的吸收峰，归属于聚四氟乙烯(ePTFE)的特征谱带。由于全氟磺酸与聚四氟乙烯具有相似的氟碳骨干分子结构，因此特征谱带与聚四氟乙烯有重叠。在1581cm^-1处的吸收峰，可归属于肝素中羧酸根(-COO-)的特征吸收峰，在843cm^-1处的吸收峰，可归属于肝素中硫酸根(-COSO₂-)的特征吸收峰，从而证实了肝素已经修饰在人工血管上。从图中肝素化的人工血管(ePTFE-Nafion-DR/PVA/Hep)交联前后的红外光谱图上均可以观察到肝素和聚乙烯醇的羟基(-OH)在3315cm^-1的特征吸收。此外，在紫外交联前的谱图中，可看到重氮基团位于2170cm^-1和2222cm^-1处的吸收峰，在交联后谱图上明显地观察到重氮树脂的重氮基团(-N₂⁺)与肝素的羧基(-COOH)共价结合形成的羧酸酯结构(O-C＝O)产生的特征谱带(1736cm^-1)，重氮基团的特征吸收峰消失，说明了肝素和重氮树脂已经成功地通过聚乙烯醇交联在聚四氟乙烯人工血管上。重氮树脂/聚乙烯醇/肝素凝胶的表面固定是人工血管表面Nafion的负电荷基团与重氮树脂上的带正电荷基团(-N₂⁺)通过形成离子键相互作用实现的，而之后重氮树脂与肝素上的羧基等基团的交联反应则有利于成膜覆盖，有利于膜的稳定。

表1为修饰前后人工血管接触角的检测结果，未修饰的人工血管的θ_A和θ_R分别为139.23°±0.85°和134.70°±1.34°，灌注了DR-PVA-Hep复合凝胶后，人工血管交联前的θ_A和θ_R分别为30.88°±1.92°和23.43°±0.32°，交联后的θ_A和θ_R分别为38.56°±1.54°和27.97°±1.95°，交联前和交联后的接触角均明显小于修饰前人工血管的接触角，有力地证明了经过凝胶修饰后，聚四氟乙烯人工血管由修饰前的疏水性变为了亲水性，从而增强了人工血管的组织相容性。另外，交联后的接触角比交联前的接触角略大一些，是由于重氮树脂的重氮基团与羧基发生了交联反应，羧基数目减少，导致亲水性降低。

     表1(DR/PVA/Hep)修饰后人工血管交联前后接触角的检测

 接触角  修饰前             修饰后  交联前  交联后 前进角θ_A  139.23±0.85  30.88±1.92  38.56±1.54 后退角θ_R  134.70±1.34  23.43±0.32  27.97±1.95 θ_A-θ_R  4.53  7.45  10.59

溶血试验结果显示未修饰的人工血管的溶血度为0.181％，修饰后人工血管的溶血度为0.079％，与未修饰的人工血管相比，溶血度大大降低，因此更进一步证明了用(DR-PVA-Hep)复合凝胶修饰聚四氟乙烯人工血管后，其血液相容性得到进一步提高。

APTT(部分凝血酶原活化时间)测定是在血浆中加入APTT试剂(接触因子激活剂和部分磷脂)和Ca²⁺，测定血液出现凝固的时间，其意义在于检测内源性凝血系统。当血液中纤维蛋白原、凝血酶原等凝血因子缺乏或有抗凝物质存在时，APTT会有所延长。PT(凝血酶原时间)是在血浆中加入Ca²⁺和组织因子(组织凝血活酶)后测定凝血时间，它可以反映血浆中凝血酶原、因子V、因子VII、因子X以及纤维蛋白原水平，用于检测外源性凝血系统。

将聚四氟乙烯人工血管与新鲜枸橼酸钠抗凝血液接触，离心取上层血浆，用血凝仪检测APTT和PT。当与血液接触的时间为45s时，灌注了(DR-PVA-Hep)凝胶的聚四氟乙烯人工血管APTT为48.1s，较未修饰的人工血管有延长(42.3s)。当与血液接触时间增加至30min后，修饰后的人工血管APTT超过120s，较修饰前有明显延长。当与血液接触的时间为45s时，修饰前后的人工血管PT变化不明显。当与血液接触时间增加至30min时，PT由修饰前的14.3s延长至复合凝胶修饰后的70s以上，说明与血液接触时间的长短对PT有很大的影响。这是因为随着与血液接触时间的延长，肝素释放增多，血液中凝血因子消耗增多，导致了凝血时间的延长。

血液与高分子材料表面接触时，会引起血小板粘附，扩张变形。这一变化在后来的血栓形成过程中起着重要的作用。因此，生物材料表面粘附血小板的数量和形态变化已成为评价材料血液相容性的一个重要指标。图2为灌注修饰前后聚四氟乙烯血管的血小板粘附扫描电镜检测结果。从图中可以看出修饰前后的人工血管表面粘附的血小板数量都很少，几乎都看不到血小板粘附。结果说明了(DR-PVA-Hep)凝胶并没有增加血小板与人工血管表面的粘附，也能够阻止凝血系统的启动，起到较好的抗凝血作用。