去细胞光氧化交联处理的牛颈静脉光化学法RGD表面修饰及再内皮化的研究

摘要

第一部分，目的：探讨RGD光化学偶联法修饰去细胞光氧化牛颈静脉基质的方法，以及修饰的RGD肽在体内存留情况。 方法： 1．制备去细胞、光氧化交联的牛颈静脉基质材料，裁减成1×1cm<'2>大小的48个血管片，随机分入12个组中；将RGD-FITC和光偶合剂SANPAH分别配制成0.12mM、0.6mM、1.2mM和6mM四种浓度的溶液，按照1∶0、1∶1和1∶10的三个反应摩尔比在避光下反应2小时，制成12组反应液。每组100μl反应液滴加在血管片上，365nm的紫外线照射5分钟，引发光化学偶联，将RGD共价结合到牛颈静脉血管片上，震荡漂洗6小时，样品制成快速冰冻切片，荧光显微镜下观察。通过观察基质材料表面不同浓度、不同摩尔比反应接枝后的荧光差别，从而初步推断出合适的反应和结合浓度。 2．以浓度为0.6mM、反应摩尔比为1∶1的FITC-RGD和SANPAH，同法制备表面修饰后的牛颈静脉血管片(实验组)，物理吸附RGD的血管片作为对照组，8只SD大鼠随机平均分入上述两组中，将血管片分别植入两组大鼠下腔静脉，于术后5天、10天、15天、20天取出标本，进行快速冰冻切片，观察并照相留底，以了解荧光标记的RGD是否能经受体内血流的冲击和细胞的吞噬而仍然存在。 结果：应用光偶联剂后，血管内膜面有一层较强的荧光，随着RGD和SANPAH的浓度的升高，荧光整体上是越来越强，但是二者的浓度高于0.6mM时，荧光差别不明显；相同浓度下当二者的反应摩尔比为1∶1时，荧光最强。经过光化学偶联后的FITC-RGD肽在体内20天仍然存在，只是荧光略有衰减，单纯涂覆的RGD组绿色荧光5天即完全消失。 结论：光偶联剂SANPAH能够实现RGD与去细胞光氧化牛颈静脉的化学偶联， RGD和SANPAH较为合适的接枝反应浓度是0.6mM，反应摩尔比是1∶1，光化学交联方法接枝的RGD在体内保留时间至少超过20天，体内存留效果良好。 第二部分，目的：探讨RGD表面修饰后的牛颈静脉体内和体外促进再内皮化的情况。 方法： 1．体外细胞黏附生长：牛颈静脉经过去细胞和光氧化交联后，裁成与24孔培养板孔径相同大小的、直径1.6cm的血管片，用光偶联剂SANPAH采用第一章的方法将RGD接枝到牛颈静脉血管片上，以未接枝RGD的作为空白对照。在其上面种植人脐静脉内皮细胞株细胞(CRL-2480)5×10<'5>/ml，静态培养5天，取1，3，5天标本消化血管片表面细胞并记数，标本切片HE染色，对比RGD接枝后和空白对照组血管片表面细胞黏附数目和HE的染色结果，以探讨接枝RGD体外能否促进细胞黏附和生长。 2．再内皮化的体内实验：8只SD大鼠平均分入处理组和对照组，将RGD表面修饰和未修饰的血管片植入下腔静脉，采用连续缝合的方式进行补片，术后两组均给予10mg/kg/天剂量的阿托伐他汀喂养，分别于术后5天、10天、15天、20天取出血管片，标本进行石蜡包埋、HE染色、扫描电镜和Ⅷ因子免疫组织化学检测，取普通显微镜40倍下的HE染色的血管片留底照片，在Image Pro Plus图像测量软件上测量内膜厚度，计算平均值，两组间进行比较。 结果： 1．体外培养： (1)细胞记数：细胞培养第1、3、5天，RGD组细胞数目均多于对照组。 (2)标本石蜡包埋后切片HE染色结果：第1天各组血管片表面细胞排列密集，紊乱，未完全铺开；第3天，对照组血管表面细胞数量减少明显，有断裂出现；RGD组细胞连接成片，呈单层排布；第5天这种现象更明显。 2．体内实验： (1)组织大体观结果：血管片隆起于下腔静脉表面，质软，周围粘连较轻，颜色变白，亚甲兰的蓝色已完全消失。剖开下腔静脉后见补片表面光滑，无血栓，缝线清晰可见，其上附着一薄层增厚组织，薄而透明，为新生内膜组织。 (2)HE染色结果：经过光氧化交联的BJV植入体内，细胞浸润受到抑制，浸润全层首先在血管片吻合区域发生， 20天两组中间区域均未能浸润全层，只是在小部分个别区域全层BJV有细胞相连；RGD组在新生内膜中有更多的细胞，而对照组则主要还是纤维素等不定型成分。新生内膜在吻合区域薄，中间较厚，剔除新生内膜后的HE切片显示：术后5天，RGD组BJV表面有细胞黏附，对照组几乎没有细胞；RGD组5天即能在内膜面看到内皮样细胞覆盖，10天完整覆盖补片，对照组则需要20天才能看到内膜面较多的细胞覆盖。 (3)Ⅷ因子染色结果：RGD表面修饰后的血管片植入大鼠体内5天Ⅷ因子染色即呈阳性，而且新生内膜中已经形成新生微血管，10天阳性更强；对照组5～15天内膜面只有很少的细胞，Ⅷ因子染色是阴性,20天虽然内膜面虽有较多的细胞，但是Ⅷ因子染色仍是阴性。 (4)扫描电镜结果：RGD组术后5天内膜面可见较多的上皮样细胞顺血流方向排列，但是细胞之间有间距，术后10天内膜面附着一层排列致密、整齐的内皮细胞，细胞间可见形成的牢固连接；对照组术后10天内膜面仍是增厚的纤维素样物质，下面似有细胞突起，可能为平滑肌或成纤维细胞，表面无内皮样细胞覆盖，只是黏附一些大分子物质和散在的一些小细胞。 (5)内膜厚度的比较：术后第5天，RGD组新生内膜较对照组厚，但是没有统计学意义，随后的10天、15天、20天RGD组新生内膜均较对照组薄，而且有统计学意义。两组新生内膜总体上说随着时间的延长，厚度越来越大，术后15天时达到高峰，20天即开始下降，RGD组术后10天新生内膜厚度有波折，其在20天时下降到术后5天的水平，而对照组厚度值仍然较大。 结论：RGD表面修饰的牛颈静脉，体外能促进内皮细胞的黏附与生长，体内能快速达到内皮化的效果，虽然仍然伴有内膜的增生，但是新生内膜的厚度显著薄于未经RGD修饰的牛颈静脉。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章基质材料的制备及表面RGD修饰的研究

前言

1.主要试剂和仪器：

2.实验方法：

3.结果

4.讨论

5.结论

附图

第二章RGD表面修饰BJVC后体外、体内的再内皮化研究

前言

1.主要试剂和仪器

2.实验方法

3.结果

4.讨论

5.结论

附图

参考文献

综述一 血管移植的研究进展

综述二 RGD及其血管支架表面修饰的研究进展

致 谢

攻学位读期间研究及论文情况