一种真菌提取物的制备及在抗人类免疫缺陷病毒中的应用

摘要

一种植物内生真菌发酵产物的提取物在抗人类免疫缺陷病毒(HIV)中的应用，所用的真菌分离自兰科药用植物石斛根中，是瘤菌根菌属真菌EF1(Epulorhiza sp.)；EF1经液体发酵培养，制备发酵产物的提取物。该菌发酵工艺简单，生长周期短，可大规模工业化生产；该菌发酵产物的提取物获得容易，具有显著抗HIV－1的活性，其对HIV－1感染的作用位点是在逆转录后到HIV RNA表达之前，具有调节HIV－1基因表达的作用；药物联合实验表明，该菌发酵产物和抗艾滋病药物AZT联合使用显示出相加的抗HIV－1作用。该菌发酵产物的提取物在治疗艾滋病新药的开发方面具有重要价值，有望成为一种新的艾滋病治疗药物。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体地说涉及一种具有抗人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的活性，能调节HIV-1基因表达的内生真菌提取物的制备技术。

技术背景

1981年美国疾病控制中心首次报道获得性免疫缺陷综合症，又称艾滋病(AIDS)。80年代中期，艾滋病已发展成为一个全球性的流行病，其病原也被确定为人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)。二十多年来，在艾滋病病理及治疗领域的研究已经取得了一定的成绩，近几年高效抗病毒治疗使艾滋病的发病率和死亡率明显降低。但是目前在艾滋病的治疗方面存在以下问题：一方面，HIV的高变异性导致其很容易产生耐药性；另一方面，化疗药具有很强的毒副作用，且该类药物大多价格昂贵，很多经济落后国家和地区的艾滋病病人负担不起医疗费用，因而得不到及时有效的治疗。因此，寻找新的高效低毒的抗HIV药物就成为医药学研究领域的紧迫任务。

HIV进入人体后，主要通过与宿主细胞膜直接融合进入细胞，HIV的复制周期主要包括吸附及穿入、逆转录与环化、整合、转录、翻译、病毒颗粒装配、病毒体成熟、出芽等阶段。抗HIV物质针对不同的作用位点发挥抗病毒作用，主要包括：抑制吸附与进入的物质、抑制逆转录酶的物质、抑制整合酶的物质、抑制蛋白酶的物质、调节基因表达的物质、抑制病毒组装或出芽的物质。筛选抗HIV药物主要通过以下手段：一是计算机分子模拟设计，根据晶体衍射获得HIV特异性酶的三维结构模型，推测出酶的活性部位，计算机模拟设计出结构稳定、合适立体构象的底物类似物，以竞争性抑制方式来抑制HIV的复制。临床上抗HIV药物中的蛋白酶抑制剂均是依此而合成的。二是组合化学手段，通过对已知结构、具有抗HIV活性化合物的结构修饰，可以提供丰富的抗HIV化合物来源。HIV吸附和融合抑制剂ISIS5320就是应用组合化学而筛选出来的。三是从天然动植物、微生物和海洋生物等的提取物中筛选抗HIV化合物。从天然资源中寻找新的抗HIV药物或先导化合物的研究，是当前国内外新药研制的重要研究方向和非常活跃的领域，这也应该是我国新药研究的优势所在，一旦发现活性，往往以该结构为先导化合物，合成活性更强、可溶性好及毒性低的药物。

从传统中药中寻找高效低毒的抗HIV药物一直是国内外新药研制中非常活跃的领域，但是植物的大量采集可能导致植物资源的枯竭，从而造成植被和人类生存环境的破坏。植物内生真菌是存在于健康植物中，形成不明显侵染的一类真菌。植物与其内生真菌的关系是互惠共生的。近年来一些研究表明，与药用植物共生的内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分。从真菌代谢产物中寻找新的抗HIV药物或先导化合物的研究，是当前国内外治疗艾滋病的新药研制的重要研究方向和非常活跃的领域，这也应该是我国新药研究的优势所在。已经有研究表明，真菌代谢产物及提取物具有抗病毒和免疫调节作用；从食用菌中发现了具有抑制HIV-1蛋白酶的物质；真菌产生的物质和蛋白酶抑制剂具有协同抗HIV-1的作用。利用发酵法生产与植物相同或相似的次生代谢产物，具有可大规模工业化生产和易于进行质量控制等优点，并不会对自然资源造成破坏。

发明内容

本发明的目的是提供真菌液体发酵培养的方法和真菌发酵产物提取物制备的方法，该方法工艺简单、生产周期短、成本低，可用于真菌的大规模工业化培养，并以真菌发酵物为原料工业化生产发酵物的提取物。

本发明的另一目的是提供上述发酵物的提取物用于抗HIV-1药物中的研究和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术是真菌EF1(Epulorhiza sp.)液体发酵培养，得到菌丝体和发酵液两部分材料，再用有机溶剂分别对菌丝体和发酵液部分进行提取，回收溶剂，得到发酵物的提取物。本发明采用的真菌由野生石斛根中分离得到，经培养鉴定为瘤菌根菌属真菌EF1(Epulorhiza sp.)，该菌种于2005年6月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCC No.1395。保藏和存活证明见附件。

具体地说，本发明所述的技术步骤如下：

1.真菌的发酵培养

将上述真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于25℃恒温培养10-14天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行发酵培养；

真菌液体培养的培养基组成为：葡萄糖1.5-4％，KH₂PO₄ 0.1-0.4％，MgSO₄0.1-0.3％；天然物为麦麸1-5％(煮汁)，以上组分均按重量百分含量计算，培养基pH5.0-6.5，三角瓶或其他容器振荡培养真菌。容器装量30-60％。高压灭菌后接入上述真菌。培养条件：振荡转速90-130转/分钟；22-26℃暗培养8-15天收获。

2.真菌发酵培养物的获得

上述真菌经发酵培养8-15天后，用80-120目尼龙网过滤，分为菌丝体和发酵液两部分；菌丝体部分用水冲洗干净，挤压除去大部分水分，晾干，或50-65℃烘干；发酵液部分常压加热浓缩，或60-80℃减压(真空度0.6-0.8)浓缩至原发酵液体积的10-20％。

3.真菌发酵产物提取物的制备

①干燥菌丝体用甲醇、95％乙醇或丙酮回流提取3次，每次提取时间分别为1-3小时、0.5-3小时和0.5-3小时，每次提取溶剂用量(V)分别为菌丝体重量(W)的10-15倍、8-12倍和8-12倍；或干燥菌丝体用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇或甲醇超声提取3次，每次提取20-60分钟，每次提取溶剂用量(V)分别为菌丝体重量(W)的10-15倍、8-12倍和8-12倍；或干燥菌丝体用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇或甲醇渗漉提取，溶剂用量(V)为菌丝体重量(W)的12-18倍。

②发酵液浓缩物加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，溶剂用量(V)为发酵液浓缩物体积(V)的3-5.5倍，震摇或剧烈搅拌后放置分层，收集上清液，沉淀部分加入75％-95％乙醇回流提取2次，每次提取时间分别为1-3小时和1-3小时，每次提取溶剂用量(V)分别为沉淀部分(V)体积的4-7倍。

③干燥菌丝体的提取液和发酵液浓缩物的提取液，分别于40-70℃减压(真空度0.6-0.8)浓缩至浸膏密度为1.1-1.3(50℃)，得到菌丝体和发酵液的提取物。

具体实施方式

实施例：

1.真菌的发酵培养

将瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.)真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于φ90mm含PDA培养基的平皿中，于25℃恒温培养12天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行发酵培养；

真菌液体培养的培养基组成为：葡萄糖20克/升，KH₂PO₄ 3克/升，MgSO₄ 1.5克/升；天然物为麦麸30克/升(煮汁)，培养基pH 5.5。500mL三角瓶装培养基200mL，121℃灭菌30分钟，接入瘤菌根菌属真菌(Epulorhiza sp.)。培养条件：摇床振荡转速110转/分钟；25℃暗培养10天收获。

2.真菌发酵培养物的获得

瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.)真菌发酵培养结束后，用100目尼龙网过滤，分为菌丝体和发酵液两部分；菌丝体部分用水冲洗干净，挤压除去大部分水分，55℃烘干；发酵液部分常压加热浓缩至原发酵液体积的15％。

3.真菌发酵产物提取物的制备

①干燥菌丝体用95％乙醇回流提取3次，每次提取时间分别为2小时、1.5小时和1.5小时，每次提取溶剂用量(V)分别为菌丝体重量(W)的12倍、10倍和8倍。合并3次提取液，60℃减压(真空度0.6)浓缩至浸膏密度为1.15(50℃)，得到菌丝体的提取物。

②发酵液浓缩物加入95％乙醇进行醇沉，溶剂用量(V)为发酵液浓缩物体积(V)的4倍，震摇或剧烈搅拌后放置分层，收集上清液，沉淀部分加入80％乙醇回流提取2次，每次提取时间均为1.5小时，每次提取溶剂用量(V)分别为沉淀部分(V)体积的5倍。合并醇沉上清液和2次提取液，60℃减压(真空度0.6)浓缩至浸膏密度为1.15(50℃)，得到发酵液的提取物

比较例

1.真菌发酵产物提取物对MT-4细胞的毒性作用

EF1真菌(Epulorhiza sp.)接种到PDA培养基的平皿中，25℃恒温培养12天，转入液体培养基中，培养10天收获。分离菌丝体和发酵液。菌丝体用水冲洗干净，55℃烘干。干燥菌丝体用甲醇回流提取3次，每次1.5小时。合并三次提取液，减压浓缩至浸膏密度为1.2(50℃)，得到菌丝体的提取物。将菌丝体甲醇提取物做倍比稀释，采用MTT法检测其对MT-4细胞的毒性，共进行了3次实验，实验数据见表1，实验结果显示：菌丝体甲醇提取物在所测试浓度对MT-4细胞的毒性较低，其半数毒性浓度(TC₅₀)＞1000μg/mL。菌丝体甲醇提取物浓度与MT-4细胞生存率的量效关系曲线基本呈直线关系。

表1 菌丝体甲醇提取物对MT-4细胞的毒性作用

药物浓度(μg/mL)            生存率(％)  实验一  实验二  实验三1000500250125  96.00   86.50   83.60  97.00  98.90  64.79  87.53  94.13  98.90

2.真菌发酵产物提取物对感染HIV-1的MT-4细胞的保护作用

EF1真菌(Epulorhiza sp.)接种到PDA培养基的平皿中，25℃恒温培养12天，转入液体培养基中，培养10天收获。分离菌丝体和发酵液。菌丝体用水冲洗干净，55℃烘干。干燥菌丝体用甲醇回流提取3次，每次1.5小时。合并三次提取液，减压浓缩至浸膏密度为1.2(50℃)，得到菌丝体的提取物。将菌丝体甲醇提取物做倍比稀释，采用MTT法检测其对感染HIV-1的MT-4细胞的保护作用，实验数据见表2，实验结果显示：菌丝体甲醇提取物在所测试浓度对感染HIV-1的MT-4细胞的保护作用随浓度增加而增加，超过一定浓度，保护作用开始下降。菌丝体甲醇提取物对感染MT-4细胞的半数有效浓度(EC₅₀)为108.60μg/mL。

表2 菌丝体甲醇提取物对感染HIV-1的MT-4细胞的保护作用

  药物浓度  (μg/mL)          抑制率(％)  200TCID₅₀  100TCID₅₀  500  250  125  62.50  80.15  100.00  55.70  32.80  93.90  100.00  78.79  22.70

3.真菌发酵产物提取物对p24抗原的抑制作用

EF1真菌(Epulorhiza sp.)接种到PDA培养基的平皿中，25℃恒温培养12天，转入液体培养基中，培养10天收获。分离菌丝体和发酵液。菌丝体用水冲洗干净，55℃烘干。干燥菌丝体用甲醇回流提取3次，每次1.5小时。合并三次提取液，减压浓缩至浸膏密度为1.2(50℃)，得到菌丝体的提取物。将菌丝体甲醇提取物做倍比稀释，采用MTT法测定MT-4细胞培养上清中p24抗原含量。MT-4细胞被病毒感染后，培养过程中会释放病毒颗粒，测定培养上清中各种病毒蛋白可反映上清中病毒的含量。病毒核心结构蛋白又称p24Gag蛋白，是最常测定的一种抗原。共进行了3次实验，实验数据见表3，实验结果显示：菌丝体甲醇提取物在所测试浓度可以抑制MT-4细胞培养上清中p24抗原的表达，IC₅₀＜31.25μg/mL。

表3 菌丝体甲醇提取物对p24抗原的抑制作用

  药物浓度  (μg/mL)              抑制率(％)  第一次  第二次  第三次  500  250  125  62.50  31.25  99.94  99.10  85.82  61.43  61.05  99.55  91.51  44.94    99.99  99.80  95.52  76.65 

4.真菌发酵产物提取物抑制地塞米松诱导的MT-4细胞凋亡作用

EF1真菌(Epulorhiza sp.)接种到PDA培养基的平皿中，25℃恒温培养12天，转入液体培养基中，培养10天收获。分离菌丝体和发酵液。菌丝体用水冲洗干净，55℃烘干。干燥菌丝体用甲醇回流提取3次，每次1.5小时。合并三次提取液，减压浓缩至浸膏密度为1.2(50℃)，得到菌丝体的提取物。用菌丝体甲醇提取物进行细胞凋亡实验，共进行了3次实验，实验数据见表4，实验结果显示：菌丝体甲醇提取物可以显著抑制地塞米松所诱导的细胞凋亡，增加细胞的存活率。

表4 菌丝体甲醇提取物对地塞米松诱导细胞凋亡的抑制作用

           活细胞(％)        早期凋亡细胞(％)  实验一  实验二  实验三  实验  实验  实验  未诱  导组  诱导  组  正常对照  M1  诱导对照  M1  82.18  94.07   90.59  75.03  80.86  72.93  76.36  81.74  86.94  74.03  79.87  5.28  1.55   3.45  5.49  3.50  5.82  5.06  4.84  2.51  8.40  4.60