有助于农作物生长的假单孢菌RRj228及含有该菌株的微生物制剂

摘要

本发明涉及由1号序列所代表的假单孢菌RRj228，在农作物的种植过程中，该菌株通过定殖于植物根系内外而替代化肥来促进植物生长。本发明也涉及含有假单孢菌RRj228或由其产生的次级代谢物的环境亲和性微生物制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及由1号序列所代表的假单孢菌RRj228(Pseudomonas sp.RRj228)(该菌株于2003年6月11日被保藏在韩国农业培养物保藏中心(KACC)，保藏编号为KACC 91052；于2005年5月27日被重新保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏编号为KCTC 10812BP)，在农作物的种植过程中，该菌株通过定殖于植物根系内外而代替化肥来促进植物生长。本发明还涉及含有假单孢菌RRj228或由其产生的次级代谢物的环境亲和性微生物制剂。

根据本发明的环境亲和性微生物制剂通过含有假单孢菌RRj228或由其产生的次级代谢物而能够减少化肥的使用量、稳定农作物产量、保护水质和土壤环境并改善土壤生态系统的健康。

背景技术

肥料是决定农作物产量的一种重要的农业物资，但它作为农作物生长的劣质因子会导致农作物品质退化、河流富营养化、地下水污染、土壤营养失衡以及产量降低。因此，为促进农业的持续发展和农业环境的保护，必须合理使用具有促进植物生长的功能并有助于农作物强势生长的土壤微生物，来替代化肥。

不与寄主植物形成共生关系并能促进植物生长的植物根际促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria)(PGPR)在1980年由Kloepper等人命名，它包括固氮螺菌属(Azospirrilum sp.)(Okon，1985)、假单孢菌属(Kloepper等，1980)、芽孢杆菌属(Backman等，1994)等。被称为PGPR的植物生长促进微生物具有多种功能如固定大气中的氮、产生植物生长促进激素、促进养分吸收(Hallmann等，1997)以及避免植物受病害侵袭(Pleban等，1995)，因此帮助植物生长。

Ward等人在1992年报道指出已经分类并鉴定的该微生物种类占生活在土壤中全部种类的不到5％，而Torisvik等人在1990年报道指出在土壤中存在许多未被人工培养的微生物。因此，在土壤中还存在比以前发现的数量更多的具有优秀功能的微生物，这由此引起对它们的后续研究。

另外，已经证实接种不同的植物生长促进微生物可以使水稻产量提高19-60％(Baldani，2000)，并可提高西红柿(Kloepper和Schroth，1981)、豆类(Polonenko等，1987；以及Dashti等，1998)、小麦(Freitas和Germida，1990)和甜菜(Suslow和Schrith，1982)的产量。植物生长促进微生物的应用已经有所研究。

因此，本发明的发明者在研究土壤微生物的同时分离并鉴定了可定殖于水稻植物根系内外的假单孢菌RRj228，并发现该菌株可促进农作物生长，因此可替代化肥。

发明内容

本发明的目的是提供由1号序列所代表的假单孢菌RRj228，在农作物的种植过程中，该菌株通过定殖于植物根系内外而代替化肥来促进植物生长。本发明的目的还在于提供含有假单孢菌RRj228或由其产生的次级代谢物的环境亲和性微生物制剂。

本发明提供了由1号序列所代表的假单孢菌RRj228，在农作物的种植过程中，该菌株通过定殖于植物根系内外而代替化肥来促进植物生长。

假单孢菌RRj228是由本发明的发明人发现的一种土壤细菌，在自然条件下，该细菌定殖于植物根系内外，分泌植物生长促进物质，并通过对植物病原真菌和细菌的拮抗作用来抑制多种病原体的生长。

本发明的假单孢菌RRj228为在28±2℃的PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基中培养的革兰氏阴性杆状嗜温细菌。

使用本发明的假单孢菌RRj228获得的效果如下：

1)当使用含有该菌株的微生物制剂作为农作物接种物时，由于本发明的假单孢菌RRj228可提供优秀养分供给并促进植物生长，因此尽管使用少量的化肥，也能提高农作物产量。

2)本发明的假单孢菌RRj228是化肥的替代品，对农作物有广泛的使用范围，如可用于水稻、辣椒和黄瓜。

3)当本发明的假单孢菌RRj228接种到农作物中时，该菌株可以通过抑制土壤中的植物病原微生物来帮助农作物生长并免受病原体的危害。

4)本发明的假单孢菌RRj228通过定殖于农作物根系内部可在被接种的农作物中大量表达。

5)根据本发明，除了可替代化肥的功效之外，通过将来自假单孢菌RRj228培养液的植物生长促进或病原生长抑制物质分离并纯化而获得的次级代谢物也可产生更多的价值。

6)由于本发明的假单孢菌RRj228不可能污染环境，所以可以保护水质和土壤环境，并改善土壤生态系统的健康。

本发明还提供了含有假单孢菌RRj228或其产生的次级代谢物的环境亲和性微生物制剂。

可以使用本领域熟知的方法将本发明的微生物制剂配制成植物生长促进剂或植物病原生长抑制剂，但本发明并不局限于此。为替代化肥，本发明的微生物制剂优选配制成用于促进植物生长的有机肥料。

当本发明的微生物制剂为干粉状或液态肥料状的植物生长促进剂时，每1克干粉或1毫升液体中的假单孢菌RRj228含量为105-107。

当本发明的微生物制剂为干粉状或液态肥料状的病原生长抑制剂时，每1克干粉或1毫升液体中的假单孢菌RRj228含量应超过107。在这种情况下，其特征是该菌株含量比植物生长促进剂中的菌株含量高。

根据本发明的环境亲和性微生物制剂通过含有假单孢菌RRj228而能够减少化肥的用量、稳定农作物产量、保护水质和土壤环境并改善土壤生态系统的健康。

假单孢菌RRj228可生产成为合适的微生物制剂，该制剂可接种到农作物如水稻、辣椒和黄瓜中。

生物保藏

本发明的RRj228菌株被命名为假单孢菌RRj228，并于2003年6月11日被保藏在附属于韩国农村振兴厅/农业生物技术国家研究所的韩国农业培养物保藏中心(KACC)，保藏编号为KACC 91052。

2005年5月27日，RRj228被重新保藏到韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏编号为KCTC10812BP。

附图说明

图1表示假单孢菌RRj228培养物的平板；

图2a和2b是假单孢菌RRj228的电镜照片；

图3是定殖于植物根内部的假单孢菌RRj228的照片。

具体实施方式

本发明可通过下列与假单孢菌RRj228的分离、鉴定和植物生长促进活性相关的实施例体现出来，假单孢菌RRj228是从俄罗斯圣彼得堡(St.Petersburg)的土壤中分离出来的，它也是从韩国和俄罗斯土壤中分离出的172种菌株之一。然而，提供这些实施例只是用来解释说明，并不能被认为是对本发明范围的限制，所附的权利要求对本发明的范围做了恰当的描述。

实施例1

土壤微生物RRj228的分离

土壤微生物RRj228的分离方法如下。

如图1所示，把在无菌培养基中萌发的一粒水稻种子转移到0.6％琼脂糖培养基中。将0.5克土壤样品(来自俄罗斯圣彼得堡)接种在距水稻根部1-2厘米处，然后将培养基在28℃培养48小时。将根碾碎使之形成悬浮液后，将该悬浮液涂在LC培养基上(该培养基含有细菌培养用胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、MgSO₄·7H₂O 8克、1M Tris 1毫升和蒸馏水1升)，以分离菌株。

实施例2

土壤微生物RRj228的鉴定

A.生理生化特性

RRj228菌株的生理生化特性显示在下表1中。

所述RRj228菌株呈杆状，大小为2.0-3.0×0.5-0.7微米，如图2a和2b所示它具有鞭毛。当该菌株在PDB培养基中培养24小时后，会形成黄色略带红色的菌落。所述RRj228菌株是革兰氏阴性菌，进行需氧代谢并具有过氧化氢酶和氧化酶活性。当加入培养基的碳源为阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、甘油或木糖时，该菌株会产生酸，而当加入培养基的碳源为乳糖、糊精、ramnose、山梨糖醇、麦芽糖或半乳糖醇时，该菌株会产生碱。另外，如图3所示，本发明的RRj228菌株的特征是存在于植物根系外部并定殖于根系内部。

[表1]

  类别  特性  类别  特性  菌株形态  杆状  菌株大小(微米)  2.0-3.0×0.5-0.7  鞭毛  有  芽孢  无  革兰氏染色  -  PDA培养基上菌落  颜色  黄色略带红色  需氧代谢  +  厌氧代谢  -  过氧化氢酶活性  +  氧化酶活性  +  明胶水解活性  +  脂酶活性  -  淀粉水解活性  -  酪蛋白水解活性  +  使用碳源的  反应  葡萄糖  形成酸  使用碳源  的反应  蔗糖  形成酸  阿拉伯糖  形成酸  麦芽糖  形成碱  木糖  形成酸  甘露醇  形成酸  乳糖  形成碱  山梨醇  形成碱  半乳糖  形成酸  半乳糖醇  形成碱  果糖  形成酸  甘油  形成酸  Ramnose  形成碱  糊精  形成碱

B.序列分析

为了分析RRj228DNA序列，采用16S rDNA序列分析方法。首先，用PCR(聚合酶链式反应)扩增16S rDNA部分，将产物插入pGEMT-T载体中，然后用DNA自动测序仪ABI3100(Applied Biosystem，美国)进行DNA序列分析。PCR反应使用2号序列的fD1(5′-agagtttgatggctcag-3′)和4号序列的rP2(5′-acggctaccttgttacgactt-3′)。另外，使用pUC/M13的正向引物(5′-gttttcccagtcacgac-3′：4号序列)和反向引物(5′-gcggataacaatttcacacagg-3′：5号序列)进行反应来分析上述引物的两端区域，并使用4个引物进行反应来分析内部的DNA序列。

根据大肠杆菌(Escherichia coli)16S rDNA序列(GenBank J01695号)，每个DNA序列使用16SP-1的311-330区域(5′-gccacactggaactgagacac-3′)，16SP-2的684-703区域(5′-tgtagcg gtgaaatgcgtg-3′)，16SP-3的944-963区域(5′-ggagcatgtgt tattcg-3′)以及16SP-4的1228-1247区域(5′-ctacacacgtgctacaatgg-3′)。

1号序列代表RRj228菌株的16S rDNA序列。对该菌株和GenBank数据库中DNA序列之间的同源性进行研究发现，该菌株与许多假单孢菌属成员如绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、皱褶假单胞菌(P.Corrugata)和P.tolaasii的同源性达99％，由此将该菌株归类为假单孢菌属。

因此，本发明的RRj228菌株被命名为假单孢菌RRj228。

实验实施例1

假单孢菌RRj228的植物生长促进效果

为了检测假单孢菌RRj228的植物生长促进效果，对玉米幼苗进行实验。将玉米根部末端3毫米浸入该菌株培养物悬浮液中1.5小时，其它玉米根部浸入无菌培养液中作为对照。将玉米幼苗放置在塑料箱中的湿滤纸上，然后用滤纸将起始线处的根部末端盖好，28℃培养24小时。测量新伸长的根的长度，重复10次，所述RRj228菌株的玉米生长促进效果显示在下表2中。

[表2]

RRj228菌株的玉米生长促进效果

  菌株  玉米生长(与未处理的相比％)  1∶50  1∶100  RRj228  -26  +13.0  金黄杆菌(Chryseobacterium  sp.)KR044  0  +8  芽孢杆菌(Bacillus sp.)KR091  0  0

如表2所示，将原液(4.5×10⁹c.f.u/毫升)以1∶50稀释并进行接种时，本发明的假单孢菌RRj228的生长促进水平降低了26％，而在将原液以1∶100稀释并进行接种时，其生长促进水平提高了13％。因此，本发明的菌株在用较低浓度接种时更加有效。

实验实施例2

假单孢菌RRj228的土壤病害拮抗作用

使用下列方法检测假单孢菌RRj228的土壤病害拮抗作用。首先，在PDA中分别接种病原真菌和细菌，然后将培养液转移到皮氏培养皿中并使之凝固。在每个平板中做一个半径为4毫米的加样孔，将100微升的假单孢菌RRj228在PDA液体培养基中28℃培养5天，然后接种到该加样孔中。将平板在28℃下放置5天，然后检测PGPR的生长抑制范围，该结果显示在下表3中。将5毫升(1×10⁶个孢子/毫升)真菌和5毫升(1×10⁸cfu/毫升)细菌分别与250毫升PDA培养基混合并于45℃振荡，每个皮氏培养皿各取溶液25毫升涂板，重复三次。

[表3]

RRj228菌株抑制植物病原真菌和细菌的生长范围^*(抑制生长范围Φmm)

  菌株        植物病原真菌            植物病原细菌 辣椒疫霉 (Phytophthora capsici)  腐霉菌  (Pythium)  胡萝卜软腐欧氏菌  (Erwinia  carotovora)3391  丁香假单孢菌  (Pseudomonas  syringiae)8300  RRj228 49.3±6.3  57.3±6.3  56.0±1.2  50.0±4.6

^*接种该菌株5天后的病原体生长抑制范围

结果显示，本发明的RRj228菌株对辣椒疫霉、腐霉菌、胡萝卜软腐欧氏菌和丁香假单孢菌表现出很强的生长抑制效果。

实验实施例3

假单孢菌RRj228竞争进入植物根部的相对能力

为研究假单孢菌RRj228和荧光假单孢菌(Pseudomonasfluorescens)WCS365竞争进入植物根部的相对能力，将两种菌株同时接种到水稻(Kumo水稻)和萝卜(Saxa nova)的根部之后，检测假单孢菌RRj228占定殖于根内的所有菌株的百分比，结果在下表4中显示。

[表4]

假单孢菌RRj228和荧光假单孢菌WCS365竞争进入植物根部的相对能力

  菌株         根内密度        (105cfu/厘米.根)    根内占有百分率(％)  水稻  萝卜  水稻  萝卜  假单孢菌RRj228  7.90(1,975)  72.5(145)  95.2  99.3  荧光假单孢菌WCS365  0.40(100)  0.5(100)  4.8  0.7

实验实施例4

在农作物中接种假单孢菌RRj228的效果

将常规培养的本发明假单孢菌RRj228的培养液接种到水稻、辣椒、黄瓜和番茄上，结果显示在下表5中。

[表5]

         农作物        产量  增产百分率(％)  未接种  接种 水稻(在韩国大山种植，盆栽3周)  40.4克  53.8克  33.2 辣椒(在韩国青阳种植，盆栽4周)  376.8克  408.7克  8.5 黄瓜(来自Dynasty黄瓜) (体内播种后第40天)  4.25克  5.16克  21.4 番茄(来自Sunyoung番茄) (体内播种后第40天)  1.66克  3.61克  117.5

如表5所示，证实假单孢菌RRj228使水稻生长增加了33.2％、辣椒生长增加了8.5％、黄瓜生长增加了21.4％、番茄生长增加了17.5％，并且本发明的假单孢菌RRj228可用做微生物肥料来替代化肥。

由于本发明的假单孢菌RRj228是直接从植物(水稻)根中分离出来的，而不是象之前的菌株是从土壤中分离的，所以该菌株可适当地定殖于农作物如水稻和黄瓜的根系内，因此当将该菌株接种到农作物上时，它能够通过稳定地定殖于农作物根系内而在根系内外自我增殖，在农作物存活期间，由于雨水或干旱很难使其密度减少，所以其接种效果可以长时间保持。

工业适用性

根据本发明的环境亲和性微生物制剂通过使用假单孢菌RRj228，能减少化肥的使用、稳定农作物产量、保护水质和土壤环境并改善土壤生态系统的健康。

                              序列表

<110>韩国农村振兴厅(Republic of Korea represented by Rural Development Administration)

<120>有助于农作物生长的假单孢菌及含有该菌株的微生物制剂

<130>I5042YOL

<150>KR10-2004-0041457

<151>2004-06-07

<160>5

<170>Patentln 3.1

<210>1

<211>1501

<212>DNA

<213>假单孢菌RRj228(Pseudomonas sp.RRj228)

<400>1

gagtttgatc ctggctcaga ttgaacgctg gcggcaggcc taacacatgc aagtcgagcg    60

gtagagagaa gcttgcttct cttgagagcg gcggacgggt gagtaatgcc taggaatctg    120

cctggtagtg ggggataacg tccggaaacg gacgctaata ccgcatacgt cctacgggag    180

aaagcagggg accttcgggc cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat tagctagttg    240

gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc cgtaactggt ctgagaggat gatcagtcac    300

actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa    360

tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc    420

actttaagtt gggaggaagg gtacttacct aatacgtgag tattttgacg ttaccgacag    480

aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa    540

tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gtggttcgtt aagttggatg tgaaatcccc    600

gggctcaacc tgggaactgc atccaaaact ggcgagctag agtatggtag agggtggtgg    660

aatttcctgt gtagcggtga aatgcgtaga tataggaagg aacaccagtg gcgaaggcga    720

ccacctggac atgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat    780

accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tgggagcctt gagctcttag    840

tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca    900

aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg    960

aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttccag agatggattg gtgccttcgg    1020

gaacattgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa    1080

gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa    1140

ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt    1200

acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt    1260

ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga    1320

agtcggaatc gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg    1380

tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc    1440

gggaggacgg ttaccacggt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtagccgt    1500

a                                                                    1501

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增假单孢菌RRj228基因的PCR扩增引物fD1

<400>2

agagtttgat ggctcag                                                   17

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增假单孢菌RRj228基因的PCR扩增引物rP2

<400>3

acggctacct tgttacgact t                                              21

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增假单孢菌RRj228基因的pUC/M13的PCR扩增正向引物

<400>4

gttttcccag tcacgac                                                  17

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增假单孢菌RRj228基因的pUC/M13的PCR扩增反向引物

<400>5

gcggataaca atttcacaca gg                                            22