香蜂草苷在制备治疗或预防出血性疾病的药物中的应用

摘要

本发明提供了香蜂草苷在制备治疗或预防出血性疾病的药物中的应用，具体地提供了香蜂草苷在制备治疗或预防内出血、阴道出血、消化道出血、病理性出血及外出血的药物中的应用。

说明书

发明领域

本发明涉及香蜂草苷在制备治疗或预防出血性疾病的药物中的应用。

背景技术

血具有营养和滋润的作用。血在脉中循行，内注五脏六腑，外濡皮肉筋骨，如环无端，运行不息，以维持生理活动所需的营养。故《素问，五脏生成篇》说：“肝受血而能视，足受血而能步，掌受血而能握，指受血而能摄。”此外，血又是气的载体，又是机体精神意识思维活动的主要物质基础，故有“血气者，人之神”之说。出血过多可出现贫血，严重时并发出血性休克，危及生命。随着生活水平的提高，开发有效安全的止血药物成为研发热点。断血流是唇形科植物荫风轮或风轮菜的干燥地上部分，在民间广为用做止血药物其药理作用得到广泛证实【韩传环，周晓琳，叶寿山.断血流口服液的药效学研究.中药药理与临床.1998，14(3)：27-28】，香蜂草苷是从断血流中提取的一个成分，化学名为5，7-二羟基-4′-甲氧基双氢黄酮-7-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。通过试验，我们惊奇的发现香蜂草苷在预防或治疗内出血、外出血等方面具有显著作用。

                            香蜂草苷的化学结构式

发明内容

本发明提供了香蜂草苷在制备治疗或预防出血性疾病的药物中的应用。

本发明提供了香蜂草苷在制备治疗或预防内出血的药物中的应用。

本发明提供了香蜂草苷在制备治疗或预防阴道出血的药物中的应用。

本发明提供了香蜂草苷在制备治疗或预防消化道出血的药物中的应用。

本发明提供了香蜂草苷在制备治疗或预防病理性出血(血友病)的药物中的应用。

本发明所述的香蜂草苷在用于上述任一用途时，其使用剂量范围为5mg～500mg/天。

本发明提供了以香蜂草苷为活性成分用于治疗或预防出血性疾病的药物组合物。

本发明提供的药物组合物，其活性成分的含量范围为5-500mg。

本发明提供的药物组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、阴道、静脉途径给药。药物组合物可以以粉针剂、注射液、栓剂、片剂、胶囊、软胶囊、滴丸或口服液的形式存在。本发明所提供的各种药物剂型均可以以药学常规方法制备而成。

以下详细的描述将有助于更进一步理解本发明。

外出血——体表可见到。血管破裂后，血液经皮肤损伤处流出体外。

内出血——体表见不到。血液由破裂的血管流入组织、脏器或体腔内。阴道出血：包括子宫功能性、功能失调性、子宫肌瘤、子宫肌腺症、宫颈炎症、宫颈癌、子宫内膜炎、子宫肌炎、子宫内膜癌、宫颈、宫体恶性肿瘤晚期引起的出血。

消化道出血：包括上消化道出血和下消化道出血，前者是指食管、胃、十二指肠、胰腺、胆道等部位的出血；后者是指空肠、回肠和大肠出血被称为下消化道出血。

创伤性出血：是指因事故、手术引起的出血。

本发明人通过下列试验证实了香蜂草苷具有治疗或预防的作用，下面的实施例用来更详细的说明本发明，但并不意味着本发明仅限于此。

具体实施方式：

制备实施例1：制备香蜂草苷

断血流药材粉碎后加入10倍量水，浸泡30分钟后用水煮，煎煮2小时后，过滤，滤渣再加入10倍量水煎煮，过滤，合并滤液，滤液浓缩至五分之一体积时，加入1倍量的95％乙醇，搅匀，静置过夜，过滤，滤液用5倍体积水稀释，用AB-8大孔树脂吸附，吸附树脂用去离子水洗后，80％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩后至无醇味后，用聚酰胺吸附，用40％的乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，用制备液相分离，蒸干即得，经HPLC检测，峰面积归一化法其纯度为98.6％。

薄层层析：

将分离制得的香蜂草苷用甲醇溶解后点样10μl于硅胶G预制板(100×100mm)上，展开剂为氯仿-甲醇-冰醋酸-水(70∶30∶10∶3)，显色剂为10％的硫酸乙醇溶液，喷雾后加热显色。检测结果表明香蜂草苷中无其它杂质斑点。

液相色谱分析：

将分离制得的香蜂草苷用甲醇溶解后进样10μl，进行HPLC分析，色谱条件如下：色谱柱为LUNA C₁₈粒径5μm，250mm×4.6mm，SUPELCO公司产品；流动相为甲醇-0.2％的磷酸(v/v)为50：50；流速为0.8ml/mim；检测波长为220nm；峰面积归一化其纯度为98％以上。本品为淡黄色粉末，mp：209～211℃，TLC酸水解，产生Glc和Rham。UV(λ_max，nm)：281，326.ESI-MS：595(M+H)⁺，¹H-NMR(DMSO)：12.02(1H，s，C₅-OH)，7.46，6.97(各2H，d，J＝8.7Hz，2’，6’-H，3’，5’-H)，6.13(2H，s，6，8-H)，5.57(1H，dd，J＝12.6，2.8Hz，2-H)，4.96(1H，d，J＝7.5Hz，Glc1-H)，4.51(1H，brs，Rham 1-H)，3.77(3H，s，OCH₃)，2.77(1H，dd，J＝17，2.7，3-H)1.08(3H，d，J＝6.0Hz，Rham-CH3)。¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱数据与文献报道【陈靖宇，陈建民等，荫风轮的化学成分研究(I)^*，天然产物研究与开发，1997，9(3)】香蜂草苷的波谱数据基本一致。

制备例2：制备片剂

取香蜂草苷细粉适量，以淀粉为添充剂，以5％的淀粉浆作为粘合剂，制粒，加入硬脂酸镁，混匀，用压片机压制为片剂。或按本领域技术人员公知的技术方法制备口崩片。

制备例3：制备胶囊剂

取香蜂草苷细粉适量，以淀粉为添充剂，加入硬脂酸镁，混匀，直接填充为胶囊剂。

制备例4：制备口服液

取香蜂草苷细粉适量用蒸馏水溶解，再加入总体积10％的糖浆作为调味剂和3％苯甲酸钠作为防腐剂分装即得。

制备例5：制备外用气雾剂

取香蜂草苷细粉适量用蒸馏水溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤，再加入总体积10％的异丙醇和3％苯甲酸钠作为防腐剂，分装并加入异丁烷、二氧化碳等适宜的抛射剂封装即得。

制备例6：制备注射液

用生理盐水将香蜂草苷溶解，以1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节pH值为5.5±1.0，加入0.1％的针用活性炭80保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤，0.22μm的微孔滤膜过滤；滤液分装于5ml的安瓿瓶中，熔封，灭菌即得。

制备例7：制备冻干粉针

用生理盐水将香蜂草苷溶解，加入10％甘露醇，以1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节pH值为5.5±1.0，加入0.1％的针用活性炭80保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤，0.22μm的微孔滤膜过滤；滤液分装于7ml的西林瓶中，冻干，压塞，压铝盖即得。

试验例1.小鼠的断尾出血实验：

1.1材料动物清洁级昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由山东省绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

药物香蜂草苷片：按制备例2制备，批号：050415；香蜂草苷注射液：按制备例6制备，批号：050416；断血流片，安庆乘风制药有限公司，批号040804。

2.1方法与结果

取健康小鼠60只，雌雄各半，按体重随机分为空白对照组(生理盐水)，香蜂草苷注射液(iv给药)1mg/kg组、10mg/kg组和100mg/kg组，香蜂草苷片100mg/kg，断血流片1g/kg组。各组连续给药3天，每天一次，末次给药0.5小时后，用手术刀将小鼠尾尖50mm处横断，待血液自行溢出时计时，每隔30s用滤纸吸血滴1次，直至血液自然停止，计算出血时间。结果见表1。

表1香蜂草苷灌胃给药后小鼠断尾出血时间(x±s，n＝10)

  组别  剂量  mg/kg 出血时间(mean±SD)min  空白组  香蜂草苷注射液  香蜂草苷注射液  香蜂草苷注射液  断血流片  香蜂草苷片   1  10  100  1000  100 10.5±5.2 6.9±4.4* 5.5±3.9* 4.7±2.7** 7.1±2.3* 5.0±2.9**

*与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

如表1所示，香蜂草苷4个剂量组均能明显缩短小鼠出血时间。

试验例2：香蜂草苷对小鼠肝素抗凝血的抑制作用

2.1材料动物清洁级昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由山东省绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

香蜂草苷片：按制备例2制备，批号：050415；香蜂草苷注射液：按制备例6制备，批号：050416；断血流片，安庆乘风制药有限公司，批号040804。

2.2方法与结果

取健康小鼠70只，雌雄各半，随机分成6组，空白对照组(生理盐水)，模型组(生理盐水)，香蜂草苷注射液1mg/kg组、10mg/kg组和100mg/kg组，香蜂草苷片100mg/kg；断血流片1g/kg组。各组连续给药3天，每天一次，末次给药0.5小时后，除空白对照组外，其它各组每只小鼠尾静脉注射肝素60U/kg，15min后由内眦球后静脉丛取血，按毛细玻管法测定凝血时间(min)，结果见表2。

    表2.香蜂草苷对小鼠肝素抗凝血的抑制作用

  组别  剂量  mg/kg  凝血时间(mean±SD)  min  空白组  模型组  香蜂草苷注射液  香蜂草苷注射液  香蜂草苷注射液  断血流片  香蜂草苷片  -  -  1  10  100  1000  100  2.72±0.78  11.31±2.91  7.02±2.23*  6.32±2.57**  5.13±3.27**  7.27±2.72*  5.01±2.17***

*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

如表2所示，香蜂草苷能明显对抗肝素引起小鼠凝血时间的延长。凝血时间显著缩短。

试验例3：香蜂草苷对脾胃虚寒出血模型止血作用的影响

3.1材料  动物  清洁级昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由山东省绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

香蜂草苷片：按制备例2制备，批号：050415；香蜂草苷注射液：按制备例6制备，批号：050416；消炎痛，邯郸滏荣制药有限公司生产，批号020203；乙醇，山东烟台市化工厂生产，批号021127。平面体视显微镜，北京泰克仪器有限公司生产。

3.2方法与结果

将昆明种小鼠50只随机分为空白对照组、模型组，香蜂草苷注射液高(10mg/kg)、低剂量(1mg/kg)组，香蜂草苷片100mg/kg组。空白组对照组饲以普通饮食，模型组及给药组参照文献[陈小野.实用中医证候动物模型学.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1993.285]造摸，饲养10日后，禁食16h，外，其它各组利用消炎痛加乙醇，每日灌胃造模药0.25ml/10g体重，连续给药10d后，胃出血造模参照文献[沈雅琴，陈光娟，朱自平.中药荜澄茄“温中止痛”药理研究.中药药理与临床，1991(2)：18]用消炎痛加乙醇法，腹腔注射消炎痛7.5mg/ml，0.1ml/10g体重，0.5h后，给药组灌胃给予香蜂草苷，3h后重复灌胃1次，第2次灌胃2.5h后，模型组再灌胃50％乙醇，0.1ml/10g体重，解剖取胃，福尔马林固定，解剖镜下观察腺胃部糜烂出血点数。结果见表3。

      表2.香蜂草苷对脾胃虚寒出血模型止血作用

  组别  剂量(mg/kg)  糜烂出血点数(个/胃)  空白  模型  香蜂草苷注射液  香蜂草苷注射液  香蜂草苷片  -  -  10  1  100  0.60±0.52  32.41±6.51  14.90±4.83***  23.43±5.92*  13.82±3.77***

*与模型组比较，*P＜0.05，***P＜0.001

如表3所示，与模型对照组比较，香蜂草苷显著降低胃溃疡出血点数。

试验例4：香蜂草苷对早孕大鼠子宫出血的影响

4.1材料动物：SD大鼠，♀鼠220～250g，♂鼠250～300g，由山东省绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

香蜂草苷片：按制备例6制备，批号：050415；香蜂草苷注射液：按制备例6制备，批号：050416；宫血宁胶囊：云南白药集团有限公司生产，批号030414；米非司酮：上海华联制药有限公司产品，批号44040807，用时以5g/L羧甲基纤维素钠配制成混悬液；米索前列醇：北京紫竹药业有限公司制造，批号42040705，用时以5g/L羧甲基纤维素钠配制成混悬液。

4.2方法与结果

造模：大鼠每日20:00时♀、♂按2∶1比例合笼，次日08:00时进行阴道涂片检查，以发现精子为妊娠第1天。于第7天08:00和18:00时分别灌服米非司酮(13.8mg/kg)和米索前列醇(135ug/kg)，引起不完全流产模型。同时阴道内置入定量棉球一个(棉球重75～80mg，用塑料薄膜包裹半侧，以防血液漏出和尿液返流)。次日分别于08:00和18:00将棉球取出，放入塑料袋中密闭冷藏保存，同时置换一个新棉球于阴道内，观察阴道出血情况，连续至第14天。实验分组和给药方法：取48只妊娠大鼠，未造模的8只大鼠为空白对照组，其余40只造模大鼠随机分为5组：模型对照组、宫血宁组(0.1g/kg)、香蜂草苷注射液高剂量组(10mg/kg)、香蜂草苷注射液低剂量组(1mg/kg)。各组于造模次日(第8天)开始灌胃，连续7d。按照文献[王晓东，赵军宁，张白嘉等.药物致早孕大鼠子宫出血模型的建立.中国药理学通报，1999；15(2)：182～184]的方法测定子宫出血量。结果见表4

      表4.香蜂草苷对早孕大鼠子宫出血的影响

  组别  剂量(mg/kg)  子宫出血量(ml)  空白  模型  香蜂草苷注射液  香蜂草苷注射液  宫血宁  香蜂草苷片  -  -  10  1  100  50  0.029±0.004  0.728±0.213  0.312±0.102**  0.593±0.127  0.499±0.117*  0.297±0.137**

*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

如表4所示，与模型对照组比较，香蜂草苷显著减少早孕大鼠子宫出血量。

试验例5：香蜂草苷对离体家兔动脉条的作用

5.1材料动物：新西兰大白兔，雌雄各半，1.5～2.5kg，由山东省绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

香蜂草苷溶液：按制备例4制备，批号：050416；去甲肾上腺素：上海禾丰制药有限公司生产，批号：0306012，；Krebs液：山东省绿叶天然药物研究开发有限公司药理室配置；BIOPAC M150多导生理纪录仪、张力传感器(TSD105A)均为BIOPAC Systems，Inc.公司生产。

5.2方法与结果

家兔胸主动脉条的制备取健康家兔(1.5～2.5kg)，雌雄兼用。猛击家兔头部，剪取胸主动脉制成3×30mm的螺旋形肌条，将肌条置于含有改良Krebs液中(38±0.5)℃，pH值为7.2～7.4，通以95％O₂+5％CO₂。肌条一端固定在通气钩上，另一端通过肌张力传感器记录在BIOPAC M150多导生理纪录仪上，负荷2g张力，平衡1.5～2h后开始实验，用0.01％去甲肾上腺素检验血管收缩活性。稳定后加入香蜂草苷溶液(浓度A组、浓度B组、浓度C组)，记录收缩曲线，作用达高峰后，继续记录一段时间，观察作用维持时间。结果见表5

                       表5.香蜂草苷溶液对兔主动脉条的作用

 组别  浓度  (mg/mL)  达作用高峰时  间(min)  张力提高最大  值(g)  作用维持时  间(min) 香蜂草苷溶液A 香蜂草苷溶液B 香蜂草苷溶液C  0.01  0.05  0.1  6  3  2  0.81±0.10  1.12±0.13  1.32±0.12  ＞30  ＞35  ＞40

表5可见，香蜂草苷可提高血管收缩力，具有较强的缩血管作用。

试验例6：香蜂草苷对正常大鼠离体子宫平滑肌收缩的作用

6.1材料动物：SD大鼠，♂鼠250～300g，由山东省绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

香蜂草苷溶液：按制备例4制备，批号：050416；；Krebs液：山东省绿叶天然药物研究开发有限公司药理室配置；BIOPAC M150多导生理纪录仪、张力传感器(TSD105A)均为BIOPACSystems，Inc.公司生产。

6.2方法与结果

取雌性未孕SD大鼠(体重250～300g)50只，随机分5组，每组10只。实验前24～48h皮下注射已烯雌酚1mg/kg体重促发情。实验时将大鼠处死，取子宫约长2cm，一端固定在通气钩上，另一端通过肌张力传感器记录在BIOPAC M150多导生理纪录仪上，负荷2g张力，平衡1.5～2h后开始实验，用0.01％去甲肾上腺素检验子宫的收缩活性。稳定后加入香蜂草苷溶液(高浓度组A、中浓度组B、低浓度组C)、缩宫素溶液D，记录收缩曲线，收缩幅度、收缩频率，结果见表6。

                     表6.香蜂草苷溶液对正常大鼠离体子宫平滑肌收缩的作用

 组别  浓度  (mg/mL)  收缩幅度(mm)  收缩频率(次/10min)  用药前  用药后  用药前  用药后 空白 香蜂草苷溶液A 香蜂草苷溶液B 香蜂草苷溶液C 缩宫素D  -  0.25  0.05  0.01  5  4.65±1.6  5.87±1.79  5.92±2.21  5.34±3.50  6.13±2.49  4.69±1.61  4.58±1.23*  4.96±1.70*  5.25±2.49  4.21±2.75*  8.00±1.41  6.82±2.24  6.57±1.27  7.26±1.58  7.02±1.76  8.21±1.35  9.86±2.54*  8.19±1.38*  7.38±1.25  12.27±2.50**

*与用药前比较，*P＜0.05

表6可见，香蜂草苷和缩宫素对正常大鼠子宫平滑肌收缩幅度、收缩频率均有明显影响，其效果与缩宫素接近，经检验与用药前有显著性差异(P＜0.05)。