一种包心芥菜细胞质雄性不育系的选育方法

摘要

本发明属于十字花科蔬菜育种技术领域，具体地，本发明属于一种包心芥菜细胞质雄性不育系选育方法。其特征在于，选择天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6－102A为母本，保持系包心芥菜6－150作父本，通过连续回交和分子标记辅助选择，得到遗传稳定的包心芥菜细胞质雄性不育系和保持系，繁殖该不育系得到可供生产利用的包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6－150。该包心芥菜细胞质雄性不育系的不育胞质类型与6－102A相同，与波里马细胞质雄性不育(pol CMS)、萝卜细胞质雄性不育(Ogu CMS)、tour CMS、nap CMS等细胞质雄性不育类型均不相同，是一种新的细胞质雄性不育类型，该不育系的不育度和不育株率均为100％，且不受环境和遗传背景的影响。本发明的包心芥菜细胞质雄性不育系可用于蔬菜杂种优势育种。

说明书

                                      技术领域

本发明属于十字化科蔬菜育种技术领域，具体涉及一种新的包心芥菜细胞质雄性不育系的选育方法。

                                      背景技术

细胞质雄性不育(英文简称CMS，下同)是油菜杂种优势最重要利用途径。目前国内外已报道的细胞质雄性不育类型很多，根据其来源不同可分为异源细胞质雄性不育和同源细胞质雄性不育两大类：在异源CMS中，最有利用价值并已开始商业化育种的有ogu CMS、kosena CMS和tour CMS；在同源CMS中，具有商业利用价值的主要是波里马细胞质雄性不育系(简称Pol CMS，下同)。Pol CMS是华中农业大学傅廷栋教授1972年发现的国际上第一个有实用价值的油菜波里马细胞质雄性不育系，根资料报道，1985-1994年国际上70％以上的油菜杂交中均由pol CMS育成，它仍为当前国内甘蓝型油菜杂种生产中普遍使用的主要不育细胞质源。但Pol CMS的主要不足是不育系因核背景而异，存在不同程度的生态敏感性，即通常在低温或高温条件下出现可育花粉，影响制种纯度。而上述的nap CMS更易受环境和温度的影响，在杂种生产上的利用亦受到了限制。

Pol CMS不育源不仅在油菜雄性不育系的选育中被广泛利用，而且还被广泛地应用到其它十字花科蔬菜作物雄性不育系的选育中。如柯桂兰等1992年利用甘蓝型油菜波里马不育源为材料与大白菜多代转育，获得了异源胞质白菜不育系CMS3411-7，其不育株率可达100％，不育度在95％以上，但其致命弱点是在不利的环境条件下(例如在低温或高温条件)会出现微量花粉以及轻度蕾败育现象(柯桂兰等，大白菜异源胞质雄性不育系CMS3411-7的选育及应用[J]，园艺学报，1992，19(4)：333-340)。

有关萝卜细胞质雄性不育系的研究利用进展，自Ogura1968年发现Ogu CMS以来，国内外学者对该不育材料进行了大量的回交转育。目前已转育到油菜、甘蓝、白菜、青花菜等十字花科作物中。但由于最初的Ogu CMS存在低温条件下出现苗期黄化、蜜腺不发达等问题，至今在生产中仍未得到推广利用(张德双等，大白菜CMS96细胞质雄性不育系的特点分析，华北农学报，2005，20(1)：59-62)。

芥菜为十字花科，芸薹属，为一两年生草本植物。芥菜在我国栽培历史悠久，多分布于长江以南各省，类型和品种很多，有芥子菜、叶用芥菜、茎用芥菜、薹用芥菜、芽用芥菜、根用芥菜等。平时所说的芥菜一般指叶用芥菜。叶用芥菜有大叶芥菜、小叶芥菜、雪里蕻(音红)、包心芥菜等，广东地区以大叶芥菜、小叶芥菜最为常见。包心芥菜又叫肉芥菜，是冬春季叶菜类的主要蔬菜品种之一。其肉质肥厚、鲜甜可口，可与肉类一同炒食，也可以用来腌制酸菜食用。

迄今为止尚无有关包心芥菜细胞质雄性不育系的选育方法的报道。

                                    发明内容

本发明的目的在于克服现有包心芥菜细胞质雄性不育系选育的缺陷，提出一种新的育性稳定的包心芥菜细胞质雄性不育系的方法，为包心芥菜蔬菜杂种优势利用提供新的种质资源。利用本发明选育的包心芥菜细胞质雄性不育系，不育性稳定、彻底，不受如低温或高温环境影响等优点。

本发明通过以下技术方案实现：

一种包心芥菜细胞质雄性不育系的选育方法，包括选用天然芥菜型细胞质雄性不育系6-102A作母本，以保持系包心芥菜6-150作父本，杂交获得F1，通过分子标记辅助选择和连续回交，得到遗传稳定的包心芥菜雄性不育系利保持系，繁殖该包心芥菜细胞质雄性不育系，得到所述的繁殖该包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150。

具体选育步骤如下：

(1)利用RFLP分子标记方法对天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A进行遗传分类，获得新型油菜细胞质雄性不育材料6-102A；

(2)用步骤(1)得到的6-102A作母本，以保持系包心芥菜6-150作父本，杂交得到杂种F1；

(3)对F1进行育性鉴定，用步骤(1)得到的F1植株为母本，以保持系包心芥菜6-150作父本，杂交得到BC1F1细胞质雄性不育系；

(4)对BC1F1进行育性鉴定，用步骤(2)得到的BC1F1细胞质雄性不育系作母本，以保持系包心芥菜6-150作父本，得到BC2F1细胞质雄性不育系；

(5)对BC2F1细胞质雄性不育系进行育性鉴定，用步骤(3)得到的BC2F1细胞质雄性不育系为母本，以保持系包心芥菜6-150作父本，杂交得到BC3F1细胞质雄性不育系；

(6)对BC3F1细胞质雄性不育系进行育性鉴定，用步骤(4)得到的BC3F1细胞质雄性不育系作母本，以保持系6-150作轮回亲本连续回交5代，得到BC8包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150。

将上述育种得到的包心芥菜细胞质雄性不育系在秋播或夏播隔离条件下进行繁殖，即得到本发明所称的包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150。

本发明的积极效果是：

1、本发明的包心芥菜细胞质雄性不育系的不育性十分稳定和彻底。该不育系不受环境影响(例如低温或高温)，在中国甘肃兰州和湖北武汉武昌连续五年10代种植并进行育性鉴定表明，其育性均表现0级。其不育株率和不育度均为100％。

2、本发明的包心芥菜细胞质雄性不育系没有任何死蕾和苗期黄化等现象。

3、本发明的芥菜型油菜不育细胞质可转移到其他十字花科蔬菜中，将为十字花科蔬菜的杂种优势提供了新的育种途径和方法。

                               附图说明

图1：是本发明技术流程图；

图2：是芥菜型细胞质雄性不育系6-102A，6-102B的花药发育细胞学观察图RFLP分子杂交图谱

图中：A是芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A和6-102B的花药的石蜡切片图；B和C是RFLP分子标记多态性分析(其中B使用的探针为atp6，C使用的探针为atp9)，图2中B和C的第2个泳道是本发明的芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A。

图3：是本发明的包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150与包心芥菜常规品种6-150茎杆和叶片表型比较图中：A是本发明选育的包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150的茎杆；B是包心芥菜常规品种6-150的茎杆；

C是本发明选育的包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150的叶片；B是包心芥菜常规品种6-150的叶片；

图4：是本发明选育的包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150与包心芥菜常规品种6-150苗期对比和包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150花器官形态图

图中：A和B是本发明选育的包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150与包心芥菜常规品种6-150的幼苗对比，C和D包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150花器官形态图

                                     具体实施方式

实施例1  包心芥菜细胞质雄性不育系的选育

一、对芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A进行遗传分类，其步骤如下：

1、恢保关系的测定：

(1)通过恢保关系的测定，对芥菜型细胞质雄性不育系进行了正确的遗传分类，确定编号为6-102A的材料为新的细胞质雄性不育胞质类型。

(2)通过恢保关系的测定(见傅廷栋，《杂交油菜的育种与利用》，湖北科学技术出版社，2000年版所介绍的方法)，分别选取39个甘蓝型和芥菜型油菜品种或品系分别与pol CMS；ogu CMS，tour CMS，nap CMS，6-102A进行测交，其恢保关系测定结果如表1所示。

表1  几种油菜细胞质雄性不育系之间的恢保关系测定

  品种(系)  代号  6-102A  tour CMS pol CMS Ogu CMS  5900  S  S F S  5148  S  S F S  5200  S  S F S  恢10  S  S F S  花叶恢  S  S F S  tourB  S  S S S  tour恢  S  F S S  02-102  S  S S S  02-106  S  S S S  萝卜恢  S  S S F  3706  S  S F S  3721  S  S F S  棚71-1  S  S F S

说明：1、CMS为细胞质雄性不育系的英文缩写，表1中英文字母含义：S表示细胞质雄性不育，F表示细胞质雄性可育)；

2、上述测定材料5900至棚71-1均分别来自华中农业大学油菜育种研究室。

(3)对获得的F1进行育性调查，结果表明，6-102A与其它几类不育系的恢保关系不同。

2、花药发育的显微镜观察：

取6-102A的花蕾制作石腊切片(参照余风群等，甘蓝型油菜几个品种花药发育的细胞学研究，中国油料，1988，(4)：23-25)，显微结构观察表明：本发明的芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A的花药发育的败育时期为雄蕊原基分化时期，其主要特点是雄蕊原基偏离正常的分化轨道，形成花瓣原基，不形成花药，着生雄蕊的位置长出小花瓣，败育时期和方式与现有报道的油菜细胞质雄性不育不同。

3、RFLP分子标记分析

(1)从天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A(芥菜型油菜)、保持系6-102B(芥菜型油菜)、pol CMS(甘蓝型油菜)、ogu CMS(甘蓝型油菜)、tour CMS(甘蓝型油菜)、nap CMS(甘蓝型油菜)共六种油菜材料中分别提取基因组DNA，参照CTAB法(murray and thompson，1980)提取基因组总DNA，具体步骤如下：

A、加2％CTAB提取液(Cetyltriethylammonium bromide)到25ml，65℃加热1hr，轻摇，冷却至室温；

B、加等体积的氯仿/异戊醇＝(24∶1)，轻轻混合，混匀，至下层为深绿色，静置10分钟；

C、将B步骤的混合液离心，3000rpm，13～20分钟；

D、取上清，尽可能倒出上清；

E、加入1/10体积的10％CTAB提取液，65℃加热10分钟；

F、加入25ml氯仿/异戊醇(24∶1)，纯化，3000rpm，12分钟；

G、加1倍体积的异丙醇沉淀DNA，在-20℃条件下放置20min；

H、用76％的乙醇洗洗涤DNA 2～3次(3200rpm，离心8分钟)；

I、加TE 200μl溶解，4℃过夜，待DNA溶解后，用RNase酶处理所得的DNA溶液(37℃加热1小时)，检测DNA浓度及质量。

(2)制备七种线粒体探针(详见表2)：

              表2  几种用于Southern杂交分析的线粒体探针

  基因  插入片段  克隆位点  来源  选择标记  atp6  2.7Kb  HindIII  玉米  Amp r  ap9  2.2Kb  XbaI  玉米  Amp r  atpA  4.2Kb  HindIII  玉米  Amp r  coxI  4.5Kb  BamHI  小麦  Amp r  coxII  1.7Kb  KpnI/BamHI  小麦  Amp r  Orf222  0.66Kb  EcoRI  油菜  Amp r

(3)用限制性内切酶EcoRI EcoRV、HindIII、BamIII、PstI对上述六种作物材料的基因组DNA进行酶切；

(4)进行Southern杂交(操作步骤参考sambrook，J，等著；《分子克隆实验指南》，北京，科学出版社，2002年)。

a.预杂交

将尼龙膜放入杂交袋或杂交管中，加入杂交液(20×SSC，见下面的描述)赶气泡，封口，放入65℃的杂交箱中，＞3hrs，杂交液浸没膜。一般地，12hrs。

b.标记探针

反应体系：1-2blots(19.5×9.5cm2)

          DNA                  100ng

          DNTP                 2.0μl

          Random primer        5.0μl

          Klenow(1u/μl)       1μl

          α-dCTP*             3.0μl

          加水至17.0μl

具体步骤是：将探针DNA变性(100℃，10min)-变性探针置于冰浴-按反应体系加入反应混合液于变性DNA中-再在同位素操作台上，加入³²P标记的dNTP(α-³²P dCTP*，α-³²P-dCTP)(放射性比活＞

3000Ci/mmol)-30℃温育2小时以上。

c.杂交

将标记好的探针，补加300μl杂交液100℃变性(或者0.4N NaOH变性)，加入杂交袋(盒)中(忌直接加于膜上)，杂交前作标记效率测定。＞25％以上可以往下做杂交。过夜杂交。杂交效率受杂交速率及杂交稳定性影响。

d.洗膜

按照从低严谨度到高严谨度洗膜。

1×SSC/0.1％SDS洗膜两次(冷5min，热65℃，15min)→0.5×SSC/0.1％SDS热洗65℃，15min。

e.包膜

膜从洗膜液中捞出，在滤纸上凉干，膜表面无可见水膜为止(忌太干，以防探针难以洗脱，影响再次使用)用保鲜膜包膜，压片，置-20℃或-70℃，依据信号强弱进行曝光(3-7天)

f.冲洗X-光片

在暗室红灯下取出X-光片，置入显影液中至杂交带显现出来(显影时间依据信号强弱及曝光时间长短可由几秒钟到2分钟)，转入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮(约10分钟)。自来水冲洗干净后，晾干，读片。

杂交缓冲液  Southern Blot Hybridization Buffer(Saghai’s Lab)

终浓度.                原液                  体积.

5×SSC                 20×                                      250ml

50mM PB(pH 6.8)        0.5M                  100ml

5×Denhardt’s         50×                                      100ml

2.5mM EDTA(pH 8.0)     0.5M                  5ml

100μg/ml ssDNA        5mg/ml                20ml

0.4％SDS               20％                  20ml

Dextran sulfate        50g

ddH₂O to                                    1000ml

20×SSC

NaCl                   175.3g                701.2g

Na₃Citrate            88.2g                 352.8g

dH₂O to               1000ml                4000ml

(5)RFLP结果分析

结果表明：探针orf222、atp6、atp9、Orf263-atp6检测结果表现12种多态性标记。二十八种线粒体探针/酶组合中，有十二种探针/酶组合检测到多态性，证明本发明得到的芥菜型细胞质雄性不育系6-102A与Pol CMS、Nap CMS、ogu CMS、tour CMS在线粒体DNA水平是完全不同的，即为不同的细胞质类型。杂交结果如图2所示，不育系6-102A与其它五类细胞质的mtDNA杂交图谱完全不一样，表现出明显的多态性。同时，四个线粒体基因的十二种组合也检测到6-102A和6-102B的mtDNA带型存在明显的多态性，表现为杂交带的数目和位置不同，只有orf222/EcoRI存在带型有无的差异。

二、包心芥菜细胞质雄性不育系的选育步骤如下：

(1)用天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A(见中国发明专利申请号：200510086942.7，该育种材料种子已于2005年11月12日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：P200504)作母本，以保持系包心芥菜6-150(该种子已于申请日前销售)作父本，杂交得到F1；

(2)对杂种F1进行育性鉴定：用步骤(1)得到的F1植株为母本，以保持系包心芥菜6-150作父本，杂交得到BC1F1 CMS；

(3)对BC1F1进行育性鉴定：用步骤(2)得到的BC1F1 CMS作母本，以保持系包心芥菜6-150作父本，得到BC2F1细胞质雄性不育系；

(4)对BC2F1细胞质雄性不育系进行育性鉴定：用步骤(3)得到的BC2F1细胞质雄性不育系为母本，以保持系包心芥菜6-150作父本，杂交得到BC3F1细胞质雄性不育系；

(5)对BC3F1细胞质雄性不育系进行育性鉴定；用步骤(4)得到的BC3F1细胞质雄性不育系作母本，以保持系6-150作轮回亲本连续回交六代，得到BC8包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150。

繁殖包心芥菜细胞质雄性不育系的步骤是：

在中国湖北武汉秋播包心芥菜细胞质雄性不育系(例如每年的9月)或在中国甘肃兰州进行夏播(例如每年的5月份)，在隔离条件下，按父本：母本行比为2∶4的比例繁殖包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150，栽培管理同普通油菜细胞质雄性不育系。

本发明的积极效果是：

表3  本发明选育的包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150与Pol CMS、6-102A的表型比较

  细胞质雄性不育类型  Pol CMS  6-102A  包心芥菜细胞质雄性不育系CMS6-150  调查株数(株)  2500  1900  1850  不育度(％)  有微量花粉  100％  100％  不育株(株)  2500  1900  1850  蕾败现象  轻度蕾败  无  无