抗嗜水气单胞菌卵黄免疫球蛋白蛋黄粉包膜剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种抗嗜水气单胞菌卵黄免疫球蛋白蛋黄粉包膜剂的制备方法。收集含有滴度为1∶640及以上的抗嗜水气单胞菌卵黄抗体鸡蛋的蛋黄液，将β－环糊精和水混合、搅拌成β－环糊精水溶液；按体积比为2.8～5.6∶1将蛋黄液缓慢加入至β－环糊精水溶液中，在转速为250转/分钟的条件下搅拌，将含水率小于＜8％的淀粉与β－环糊精蛋黄液混合、搅拌，所获混合物料于60目筛网制粒，于卧式沸腾干燥机上干燥，80目筛网上过筛。所获产品在保留卵黄免疫球蛋白等生物活性物质活性的同时，具有缓释特性，减少了胃蛋白酶对其活性的影响，试验表明本发明制备的蛋黄粉包膜剂添加剂有较高的生物活性和较好的适口性。

说明书

                            技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，涉及饲料添加剂的制备工艺，特别是一种用于水产的具有调节动物生长和免疫机能的饲料添加剂，具体为抗嗜水气单胞菌卵黄免疫球蛋白蛋黄粉包膜的制备方法。

                            背景技术

嗜水气单胞菌(Aetomonas hydrophila)是一种革兰氏阴性短杆菌，有运动力。在自然界中分布广泛。越来越多的证据表明，嗜水气单胞菌可引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类等多种动物的全身性败血症或局部感染，常致动物大量死亡。20世纪80年代末在中国、菲律宾、泰国、印度等传统池塘养殖大国的鱼类爆发性疾病中，该菌被认为是重要的病原。

为了预防和控制在养殖过程中的鱼、虾、蟹、鳖、鳗鱼、龟类等水生动物嗜水气单胞菌病的发生，往往采用疫苗、抗菌素和其他化合物等。但是，利用疫苗控制水生动物传染性疾病免疫途径和免疫效率尚待考证；嗜水气单胞菌又具有与磺胺、四环素、链霉素以及氯霉素的抗药性有关的天然R质粒，为提高养殖动物的抗病能力和增加动物源食品的安全性，必须寻找无毒，无残留、低成本、高效的材料用于该病的防治。

鸡蛋作为一种食品营养的来源已广为人所知，蛋黄中不仅含有包括蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸等在内的多种氨基酸，而且还含有卵黄免疫球蛋白、卵黄高磷蛋白、脂蛋白、唾液酸、唾液酸低聚糖等可以抵抗细菌和病毒、免疫调节等功能生物活性物质。尤其是当其中含有高特异性卵黄免疫球蛋白的时候，就可能成为预防感染及替代或减少抗生素的材料使用。

但在利用特异性卵黄免疫球蛋白添加剂研制鸡卵黄粉的过程中，需要注意以下四方面的问题：1)高效价抗体的制备技术，2)在保留黄免疫球蛋白等生物活性物质活性的同时，去除蛋黄中的水分(约48％)，3)产品在口服过程中具有缓释特性，以减少胃蛋白酶对其活性的影响，4)生产成本低廉和工艺的便捷，适合大规模生产。

本发明在原有的高效价抗体的制备技术基础上，通过包被剂的选择和主要生产工艺关键参数的制定，提供一种包膜含抗嗜水气单胞菌卵黄免疫球蛋白的蛋黄粉饲料添加剂的方法，并将其产品在饲养中进行应用。

                             发明内容

本发明将检测合格后鸡蛋收集，将收集的鸡蛋用一定的方法去壳、壳膜和蛋清后，将蛋黄、水、β-环糊精、淀粉按一定程序和比例添加后，通过生产工艺流程、干燥过程中关键参数的控制，制成包膜含抗嗜水气单胞菌卵黄免疫球蛋白蛋黄粉饲料添加剂，经检测合格后以口服途径的方式可应用于鱼、虾、鳗、蟹、鳖等水产动物饲料。所述动物包括但并不局限于鱼、虾、蟹、鳖、鳗鱼、龟类等水产类动物。

本发明的抗嗜水气单胞菌卵黄免疫球蛋白蛋黄粉包膜剂的制备方法包括下述步骤：

(1)将含有滴度为1∶640及以上抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的鸡蛋收集；

(2)将鸡蛋用常规的方法去壳、壳膜和蛋清，收集蛋黄液；

(3)以重量比将β-环糊精、水按1∶2比例混合，调节pH至6.5，用转速为250转/分钟的手提搅拌机搅拌30分钟，获β-环糊精水溶液；

(4)按体积比为5.6∶1取蛋黄液与β-环糊精水溶液，将蛋黄液缓慢加入至β-环糊精水溶液中，用转速为250转/分钟的手提搅拌机搅拌30-60分钟，获β-环糊精蛋黄液；

(5)将含水率小于＜8％的淀粉与β-环糊精蛋黄液混合，淀粉与β-环糊精蛋黄液的重量比为16∶1，在转速为150转/分钟的搅拌机上搅拌25-40分钟，获混合物料；

(6)将上述混合物料于80目筛网的摇摆制粒机上制粒；

(7)将制粒后的混合物料在45℃条件下于卧式沸腾干燥机上干燥2小时；

(8)干燥后的产物于60目筛网上过筛。

产品直径约为0.3-0.5mm的小颗粒，具有良好的滚动性，呈淡黄色。

                           附图说明

图1为两种添加剂20×稀释后的OD₄₉₂值：

A.抗嗜水气单胞菌IgY添加剂；B.非特异性IgY抗体添加剂。

图2为抗嗜水气单胞菌IgY添加剂抗体滴度。

图3为抗体溶出曲线图。

                         具体实施方式

下面结合实施对本发明的包膜剂制备技术作进一步描述。

1、含特异性抗体蛋黄液收集

1.1、收集100公斤以一定技术制备的含有滴度为1∶640及以上抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的鸡蛋。

1.2、将鸡蛋用常规的方法去壳、壳膜和蛋清，收集蛋黄，100公斤鲜蛋获得28公斤的蛋黄液。

2、蛋黄液包埋

2.1、将β-环糊精、水按1∶1～2比例混合，调节pH至6.5，并用转速为250转/分钟的手提搅拌机搅拌30分钟。

2.2、将1.2中的蛋黄液缓慢加入至2.1(蛋黄液与β-环糊精的比例为2.8～5.6∶1)，并用转速为250转/分钟的手提搅拌机搅拌30-60分钟。

2.3、将淀粉(含水率小于＜8％)与2.2所得物料混合(淀粉与β-环糊精的比例为16～32∶1)，并在转速为150转/分钟的搅拌机上搅拌均匀，时间为25-40分钟。

3、制粒、干燥

3.1、将2.3于80目的筛网的摇摆制粒机上制粒。

3.2、将3.1在45℃条件下于卧式沸腾干燥机XF30上干燥2小时。

3.3、将3.2的产物于60目筛网上过筛。

为验证本发明方法所得抗嗜水气单胞菌卵黄免疫球蛋白蛋黄粉包膜剂的有益效果，进行以下试验：

1、ELISA法添加剂中抗体活性检测  经18h培养后的嗜水气单胞菌菌液用灭菌PBS(0.01mol·L^-1，pH7.2)洗涤3次，调整细菌浓度为10⁹CFU·mL^-1，用碳酸盐缓冲液(CBS：0.05mol·L^-1，pH 9.5)作10×稀释，包被96孔酶标板(NUNC)(每孔100μL)，4℃过夜；PBST(PBS+0.05％Tween-20(v/v))洗3次，每孔加入1％牛血清白蛋白200μL，37℃封闭2h；PBST洗3次，加不同稀释倍数待检含IgY的添加剂(每个样品设3个重复)，每孔100μL，37℃湿盒中反应1h，PBST洗3次，按每孔100μL加入500×稀释的兔抗鸡IgY(HRP标记)二抗(珠海百奥生物工程公司提供)，37℃湿盒中作用1h；PBST洗3次，按每孔100μL加入显色液(20mL磷酸盐-柠檬酸缓冲液+8mg邻苯二铵+100μL过氧化二氢)，37℃避光反应20min；2mol·L^-1硫酸每孔50μL终止反应，用酶标仪(美国，Bio-Tek，Elx800)检测492nm处吸光值。以免疫鸡IgY适当稀释度的OD₄₉₂值(P)与经适当稀释的阴性IgY的OD₄₉₂值(＜0.20)(N)之比大于2.1作为抗体阳性阈值，由此计算出免疫鸡IgY的抗体效价。

2、抗体溶出度测定  称取10g添加剂微囊置于智能溶出仪转篮中，在37℃90ml 0.01MPBS中100rpm速度搅拌。取样时间设定：0m、10m、20m、30和40m。

3、试验动物和试验饲粮  杭州中德养殖有限公司提供的中华商品鳖。饲料配方和营养水平见表1。

       表1  试验饲料配方和营养水平

  原料  含量  营养成分  含量  白鱼粉  α-淀粉  豆粕  啤酒酵母  其他  复合预混料^*  57.0  23.0  8.0  5.0  5.0  2.0  水分  粗蛋白  粗脂肪  粗灰分  钙  磷  8.54  43.37  3.52  14.96  3.89  2.04

注：^*复合预混料由浙江大学饲料研究所提供

4、饲养试验和样品采集  选择900只120日龄健康中华鳖，按养殖试验要求分成3组，每组300只(含3个重复，每个重复100只，雌雄各半)，饲养于9个彻底消毒的水泥池中，每池面积为12m²，池底铺30cm细砂，设水泥板为食台。3组分别饲以添加0、2‰自制抗嗜水气单胞菌IgY添加剂和2‰自制无特异性IgY抗体的添加剂的相同饲料。饲料加水制成团状，每天上午(8:30)和下午(16:00)定量投食各喂一次。残余饵料回收，烘干称重。试验用水为发电厂余热水，入池前用本场供水池中的水调温至30℃左右，在水温和水质监控条件下，进行65d(120～185日龄)的养殖试验，每日记录料耗和摄食时间。养殖试验结束后，称重并计算中华鳖的日平均采食量、日增重和饵料系数。

5、攻毒试验  养殖试验结束后，每组随机取30只(每个重复10只)用10⁹CFU·mL^-1嗜水气单胞菌(HZD111株)腹腔注射每只0.25mL进行攻毒试验，在上述养殖条件下，饲养14d，计算各组的死亡率。

6、细菌分离和计数  无菌采集攻毒试验过程中死亡的中华鳖肾脏0.5g，置于无菌的碾钹中磨碎后，用无菌PBS作10×连续稀释，取10^-4稀释的组织捣碎液100μL均匀于涂布于含有氨苄青霉素(20μg·mL^-1)的LB平板上，35℃培养24h，计算细菌数。

7、数据处理  数据均以X□s表示，数据差异显著性分析采用SAS 6.03版的t检验法。试验结果分析：

1、添加剂中抗体效价

图1显示，抗嗜水气单胞菌IgY添加剂和无特异性IgY抗体添加剂经20×蒸馏水稀释后，OD值分别为1.095和0.147。进一步对抗嗜水气单胞菌IgY添加剂的效价检测(图2)，抗体滴度达到1∶640(640×稀释时其P/N值为2.21)。

2、抗体溶出度测定

随着放置时间的延长，添加剂中卵黄抗体的逐渐溶出，至30分钟左右，抗体达到完全释放(图3)，表明该添加剂具有良好的缓释效果。

3、添加剂对中华鳖摄食时间、死亡率和生长性能的影响

由表2可见，添加2‰抗嗜水气单胞菌IgY添加剂组平均日增重比对照组和2‰无特异性IgY抗体添加剂组提高0.148g(P＜0.01)和0.1g(P＜0.05)，而平均死亡率降低了66.7％、45.5％。添加2‰抗嗜水气单胞菌IgY添加剂组平均摄食时间比对照组缩短了24.15％(P＜0.01)，与2‰无特异性IgY抗体添加剂组基本一致。各组的日采食量无显著差异。

         表2  添加剂对中华鳖生长性能的影响

  项目    组别Groups   对照组   2‰无特异性   IgY抗体添加剂  2‰抗嗜水气单   胞菌IgY添加剂  始重/g  末重/g  平均日增重/g·d^-1  平均日采食量/g·d^-1  平均摄食时间/min  平均饵料系数  死亡总数  平均死亡率/％  120.88±7.51  165.57±1.87^a  0.69±0.03^a  1.48±0.13  40.7±5.3^a  2.14±0.36^a  18  6％  120.57±10.33  168.01±1.05^a  0.74±0.01^b  1.5±0.57  30.09±4.8^B  2.02±0.21^b  11  3.3％  120.01±9.07  174.82±1.45^b  0.84±0.02^B  1.5±0.43  30.87±4.1^B  1.85±0.14^B  6  2％

注：同一行数据后字母不同者差异显著(小写字母)(P＜0.05)或极显著(大写字母)(P＜0.01)

4、攻毒各组的死亡率和肾脏中细菌总数

攻毒试验结果显示(表3)，添加2‰抗嗜水气单胞菌IgY添加剂组死亡率比对照组和2‰无特异性IgY抗体添加剂组分别降低了80.8％和79.2％，肾脏中的细菌数也明显减少。

       表3  试验各组的死亡率和肾脏中细菌总数

  组别    对照组    2‰无特  异性IgY   抗体添加  剂组  2‰抗嗜  水气单胞   菌IgY添  加剂  死亡数/尾  死亡率/％  肾脏中细菌总数/  CFU·g^-1  26  86.7  2.98±    1.5×10⁶  24  80  3.14±    1.8×10⁶  5  5.6  4.65±    2.1×10⁴

讨论

鸡蛋作为一种食品营养的来源已广为人所知，蛋黄中不仅含有包括蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸等在内的多种氨基酸，而且还含有卵黄免疫球蛋白、卵黄高磷蛋白、脂蛋白、唾液酸、唾液酸低聚糖等可以抵抗细菌和病毒、免疫调节等功能生物活性物质。试验表明，在水产饲料中添加多种氨基酸复合物有助于改善饲料的适口性和增加诱食效果。在进行饲养试验过程中，在中华鳖饲料中添加含有特异性IgY抗体、非特异性IgY抗体的蛋黄粉组与对照组相比，其平均日增重分别提高21.73％(P＜0.01)和7.24％(P＜0.05)，平均摄食时间分别缩短24.15％(P＜0.01)和26.06％(P＜0.01)，平均饵料系数分别下降了13.55％(P＜0.01)和5.6％(P＜0.05)，这可能与蛋黄粉中含有多种氨基酸和生物活性物质有关。

但是，在利用鸡卵黄研制添加剂的过程中，去除蛋黄中的水分(约48％)的同时，应考虑温度、pH等因素对卵黄免疫球蛋白等生物活性物质活性的影响，而且还须注意生产成本和工艺的便捷程度。本发明显示，通过向卵黄中添加一定比例的赋形剂后在卧式沸腾干燥机中的干燥方法，具有生产工艺简便、成本低廉等特点，制备的添加剂保留较高的生物活性(抗体滴度1∶640)和较好的适口性。

在人工养殖的鳖场流行所谓“甲鱼红脖子病”在我国有所报道，嗜水气单胞菌为其主要病原之一，该菌亦可引起软体动物、鱼类、两栖类、鸟类及哺乳类等多种动物的全身性败血症或局部感染，常致动物大量死亡，尤其是人工密集养殖和水温较高的条件下最为常发，该病的安全防治现已成为规模化人工养殖场的主要目标之一。结果显示，饲喂含有特异性IgY抗体的蛋黄粉组与对照组和添加非特异性IgY抗体的蛋黄粉组相比，其成活率分别提高了66.67％和45.45％。由于特异性IgY抗体具有中和嗜水气单胞菌及其毒素的作用，至饲养饲养试验结束时，饲喂特异性IgY抗体组的中华鳖体表光洁，疖疮明显减少。攻毒试验亦表明，特异性IgY抗体的饲料添加剂对该病具有较好的预防作用，与对照组和饲喂非特异性IgY抗体组相比，死亡率可降低80.8％和79.2％，肾脏中细菌总数也明显减少。但是IgY在中华鳖机体内的作用机理和代谢有待进一步研究。

本发明表明，通过向含有特异性抗体的卵黄中添加一定比例的赋形剂后在卧式沸腾干燥机中的干燥方法，不仅生产工艺简便、成本低廉，而且所制备的添加剂具有较高的生物活性和较好的适口性，可用于嗜水气单胞菌感染引起的中华鳖疾病预防和控制。