通过流体静力压刺激改善深低温保藏生物材料解冻后存活

摘要

本发明涉及改善深低温保藏生物材料解冻后存活的方法，其包括向所述生物材料施加流体静力压；将所述生物材料在流体静力压下保持预先确定的时间段；释放流体静力压和使用任何对其适用的方法冷冻所述生物材料。本发明还涉及加压设备用于对待深低温保藏生物材料进行预处理的用途，以及涉及用于对待深低温保藏生物材料进行预处理的加压设备，所述设备包括用于容纳生物材料的压力室、产生所述压力的装置和维持该室内所述压力的装置。

说明书

技术领域

本发明涉及改善深低温保藏生物材料解冻后存活的方法，其包括向所述生物材料施加流体静力压；将所述生物材料在流体静力压下保持预先确定的时间段；释放流体静力压和使用任何对其适用的方法冷冻所述生物材料。本发明还涉及加压设备对待深低温保藏生物材料进行预处理的用途，以及对待深低温保藏生物材料进行预处理的加压设备，该设备包括容纳生物材料的压力室，产生该压力的装置和在所述室内维持该压力的装置。

背景技术

为了针对现代生物学和生物技术不同领域内的多种目的进行生物材料的贮藏，已经很好地建立起深低温保藏方法。这些方法遵循非常相似的基本步骤：

1.用包含低温防护剂的溶液处理生物材料。

2.下一步包括将生物材料冷冻至零度以下。

3.将如此准备的生物材料贮藏于低温下甚至很长一段时间，例如在液氮中。

4.使用前将生物材料温度回升。

5.从生物材料中除去低温防护剂。另外，要恢复生物材料的原有生存力可能还需要更多步骤。

因为深低温保藏过程对生物材料是有害的，所以已经有一些方法试图来改进上面略述的基本步骤。通过急速冷却和升温率或者在冷却到-80℃的过程中通过平衡冰点的逐渐降低来避免结冰的方法对于低温生物学每个领域还没有得到合理解决。已经尝试改进冷冻后存活：为了达到玻璃化，将低温防护剂高浓度水溶液过度冷却至十分低的温度，从而允许胞内发生玻璃化(Rall和Fahy，1985)。虽然Fahy等(1984)提到相当大地增加流体静力压可能具有作为促进玻璃化的额外因素的用途，但也考虑到它在生殖生物学中几乎没有实用的价值。其它研究报道，非依数性降低水溶液冰点的抗冻蛋白(AFP)的使用封闭了膜离子通道，并且由此在冷却过程中赋予一定的保护(Baguisi等，1987)。在上述任何方法中，冷冻保护剂的毒性作用和渗透性改变的有害后果不可忽视。

目前，这些方法对多种应用都有不同程度的功效。以保存胚胎为例，取决于物种、冷冻方法、胚胎的发育时期深低温保藏效率在0-80％范围内(Ishwar，1996；Van Wagtendonk-De Leeuw，1995，1997；Medeiro，2002；Reubinoff，2001；Hammitta，2003；Archer，2003；Stachecki，2002，Leibo和Songsasen，2002)。作为当今流行话题的人卵细胞深低温保藏成功率也远未如意。

自1912年后，人们已知当在不同温度下对水施加流体静力压时，水会经历不同的相(Bridgman，1911)(图7)。通过对溶液施加一定压力，即使在低于零下温度时溶液也能维持不冻状态(Bridgeman，1970)。为了降低冷冻损伤，Nakahashi等(2000，2001)先前使用高流体静力压(HHP)在零下温度保存用于移植的大鼠肝脏。这种方法使用HHP基本上降低培养基的冰点，从而使生物材料在零下温度时没有受到深低温保藏的任何负面影响。如在下面的实施例2和3中所略述，本发明者发现在保藏小鼠胚胎时这种方法并不可靠。

30-50MPa范围的流体静力压通常抑制多种生物体的生长：DNA复制起始就是大多数压力敏感的胞内过程之一(Abe等，1999)。影响的严重程度会依赖于压力大小和持续时间而变化(Murakami和Zimmerman，1973)。压力损伤的最初位点认为是细胞膜(Palou等，1997)。高流体静压力处理能改变膜的功能(诸如主动转运或者被动渗透性)，并且由此扰乱细胞的物理化学平衡(Yager和Chang，1983；Aldridge和Bruner，1985；Macdonald，1987；Schuster和Sleytr，2002)。Routray等(2002)最近研究发现，在用鳉(青鳉(Oryzias latipes))的卵和胚胎做实验时，尽管流体静力压(5MPa)使生存力迅速丧失但其促进了DMSO的吸收。改变压力条件下的物理或生物化学过程遵循Le Chatelier原理：伴随着体积的减少，所有反应会相当大的加速(Murakami和Zimmerman，1973；Welch等，1993；Palou等，1997)。压力的使用导致产生一群蛋白质构象异构体，包括部分或者完全非折叠构象。压力能够通过内在蛋白质相互作用的破坏与空穴释放的联合作用以及通过随后水的结合而引起蛋白质变性(Schmid等，1975；Weber和Drickamer，1983；Jaenicke，1991；Gross和Jaenicke，1994；Silva等，2001)。

最近的报道指出流体静压力促进休克蛋白质的产生(Welch等，1993；Wemekamp-Kamphuis等，2002)。研究发现：由亚致死冷休克所引起的细菌正常蛋白质合成的不稳定性能够通过所谓冷休克蛋白(CSP，HSP)的合成得到克服(Phadtare等，1999)。人们猜想CSP和HSP有许多功能，例如RNA分子伴侣(Graumann和Marahiel，1999)或者转录激活因子(LaTena等，1991)；猜测它们在冷冻保护中也起作用(Wouters等，1999)。进一步的观察发现，CSP和HSP的产生不但可以通过冷休克诱导，而且还可以通过其它环境应激诱导。例如在大肠杆菌(E.coli)中，一种类型CSP就是通过营养应激产生的(Yamanaka等，1998)。另外的试验表明高流体静压力处理激起某些冷诱导蛋白和热休克蛋白的产生(Welch等，1993)。其它最近报道指出流体静压力促进休克蛋白产生(Wemekamp-Kamphuis等，2002)。既然冷休克和高压力处理都能增加CSP和HSP水平，因此就交叉保护的可能性开展尝试。Wemekamp-Kamphuis等(2002)发现冷休克的单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)经过加压处理后存活水平比生长于37℃的细胞高100倍。

虽然食品微生物学家为了杀死有害微生物而研究上述过程(Butz和Ludwig，1986；Wemekamp-Kamphuis等，2002；Spilimbergo等，2002)，但是本发明的目的是为了促进深低温保藏生物材料的存活。

最近，将更多的关注集中于对休克蛋白在深低温保藏中的作用研究上。Huang等(1999)发表论文认为，休克蛋白HSP90的大量减少可能与公猪精子冷却过程中精子运动性的降低相关。Wen-Lei等(2003)报道深低温保藏后人精子中HSP90基本减少，其可能源自蛋白质降解。

作为总结，高流体静压力所诱导的HSP90为：

·胞质蛋白质；

·分子伴侣，在胁迫耐受、蛋白质折叠、信号转导等中起着根本作用；

·已证实拥有内在的ATP酶，其对于真正客户蛋白(client protein)的体内激活是必需的(Pearland Prodromou，2000)；

·与精液运动性相关：

·激活一氧化氮合成酶(Garcia-Gardena等，1998)；

·保护细胞不受活性氧类别(ROS)损伤(Fukuda等，1996)，在冷却过程中活性氧类别明显增加并且极大损害精子运动性；

·参与ATP的代谢(Prodromou等，1997)。在冷休克后ATP水平减少并且以后将不能恢复(Watson，1981)；

·冷却公猪精液之后，HSP90基本减少连同精子运动性的降低。因此推断HSP 90可能在调节猪精子运动性中起着关键作用(Huang等，1999)；

·特异的HSP 90抑制剂格尔德霉素以剂量和时间依赖方式明显降低公猪精液的精子运动性(Huang等，2000)。

人精子在深低温保藏后，HSP90连同精子运动性基本降低；降低不是由于耗散，而是由于蛋白质降解的结果(Wen-Lei CAO等，2003)。

当压力影响积累到一定水平时是致死性的：在高压力时一些生物分子发生不可逆变化，在300MPa时大多数细菌和多细胞生物体死亡。虽然缓步动物在活动状态时于100-200MPa下死亡，但其在脱水的“tun”状态时能够在高达600MPa的压力下存活(Seki和Toyoshima，1998)。

本发明者惊奇的发现：通过使用流体静力压刺激然后使用最新技术的深低温保藏方法，生物材料的存活能得到明显改善。在本发明上下文中，术语存活意思尤其是指改善的持续体外和体内发育、高的孵化或植入和出生率(在胚胎的情况下)；高的解冻后运动性和/或改善的受精能力(在精子的情况下)；改善的持续体外和体内发育、改善的受精能力、高的孵化或植入和出生率(在卵母细胞的情况下)。应当意识到，术语存活可以取决于所处理其它生物材料的类型而包括不同的其它功能特征。

为了该目的，已经建立起某些类型生物材料的压力耐受(见实施例1、5和6)，随后对几种最新技术设想进行研究以实现改善加压生物材料存活的目标(见实施例2和3)。然后，本发明者进一步研究了压力处理对不同类型生物材料的影响，并且意外的发现本发明的压力刺激方法实现了其目标。

在本文中我们必须强调，本发明观点同样可以应用于多种不同的深低温保藏方法，并且对那些方案的选择并不局限于本发明。在改进的方案中所包括的唯一必需步骤是流体静力压刺激；当遵循本描述的教导时，本领域技术人员能容易地优化参数。

发明简述

本发明涉及改善深低温保藏生物材料解冻后存活的方法，其包括

(a)任选地根据预先确定的压力-时间谱(profile)对所述生物材料施加流体静力压；

(b)将所述生物材料在流体静力压下保持预先确定的时间段；

(c)释放流体静力压；

(d)使用任何对其适用的方法冷冻所述生物材料。

在一个实施方案中，在按照本发明的方法中使用的压力为1-250MPa。在优选实施方案中，压力优选为10-100MPa、更优选为20-75MPa并且仍然更加优选为30-60MPa。

在另一个实施方案中，在按照本发明的方法中使用流体静力压达1秒和300分钟之间的时间段。在优选实施方案中，压力优选使用达1秒和150分钟之间，更优选为1秒和90分钟之间并且仍然更加优选为1秒和60分钟之间的时间段。

在其它实施方案中，按照本发明的方法包括在1秒和4小时之间的时间段内逐渐释放压力。在其它实施方案中，释放压力的时间段为10秒和2小时之间，或者为1分钟和1小时之间，或者在其它情况下为10分钟和30分钟之间。压力的释放也可以是瞬间的。

在优选实施方案中，根据本发明的方法用于选自脊椎动物的卵母细胞、精子、受精卵、桑椹胚、胚泡、胚胎、干细胞、细胞或组织的生物材料。

其它优选实施方案涉及一种方法，其中所述脊椎动物为鱼、鸟或者哺乳动物优选牛、马、山羊、绵羊、猪、其它家畜、宠物、包括人类的灵长类动物。

本发明还涉及对生物材料进行压力处理的加压设备，其包括：

·容纳生物材料的压力室；

·产生1-250MPa、优选10-100MPa、更优选20-75MPa并且仍然更加优选30-60MPa压力的装置；和

·在该室内维持所述压力达1秒和300分钟之间、优选1秒和150分钟之间、更优选1秒和90分钟之间并且仍然更加优选1秒和60分钟之间的时间段的装置。

在优选实施方案中，本发明涉及一种设备，其中

·产生压力的所述装置为活塞并且所述压力室为容纳该活塞的圆柱形室；

·在室和活塞之间装备高压密封装置，和

·装备有向所述活塞施加力量的手工和/或自动操作装置。

在另一个优选实施方案中，本发明涉及一种设备，其中在该活塞上施加力的所述装置具有与所述活塞紧靠的表面的盘样元件，并且具有用于调节该活塞在所述室内位置的装置。

在其它优选实施方案中，设备包括控制压力室在1秒和4小时之间时间段内减压的系统。

在其它优选实施方案中，设备还包括指示室压的压力表。

在另一个优选实施方案中，所述压力室含有液体介质。

在特殊实施方案中，所述压力室具有厚度大约10-25mm、优选小于20mm的壁，所述室具有优选小于100mm、更优选小于50mm、特别是大约20mm的内径和优选小于250mm，更优选小于100mm、特别是大约200mm的内高。

在另一个优选实施方案中，本发明涉及一种设备，其中所述生物材料选自脊椎动物的卵母细胞、精子、受精卵、桑椹胚、胚泡、胚胎、干细胞、细胞或组织。

本发明还涉及加压设备用于生物材料压缩的用途。

在优选实施方案中，本发明涉及加压设备的用途，其中加压是用作所述生物材料深低温保藏的预处理。

在优选实施方案中，加压设备的使用可以并入本发明的任何深低温保藏过程。

在优选实施方案中，本发明的用途涉及加压设备，其包括适宜容纳生物材料的压力室和提供1-250MPa、优选10-100MPa、更优选20-75MPa并且仍然更优选30-60MPa可控压力的装置。

在其它优选方案中，本发明的用途涉及加压设备，其包括维持所述压力达1秒和300分钟之间、优选1秒和150分钟之间、更优选1秒和90分钟之间并且仍然更加优选1和60分钟之间的时间段的装置。

在优选实施方案中，本发明的用途包括与加压设备相连的可控系统的用途，其用于压力室在1秒和4小时之间的时间段内减压。

在特殊实施方案中，本发明还涉及加压设备的用途，其中在加压设备中获得流体静力压。

在另一个优选实施方案中，本发明涉及加压设备的用途，其中所述生物材料选自脊椎动物的卵母细胞、精子、受精卵、桑椹胚、胚泡、胚胎、干细胞、细胞或组织。

本发明还涉及根据本发明的加压设备用于生物材料压缩的用途。

发明详述

为了说明发明观点的目的，通过使用小鼠胚胎对本发明进行更详细的描述。很显然，公开的过程同样应用于在本领域中常规深低温保藏的所有种类的不同生物材料。为了轻松入门和操作，选择了小鼠胚胎作为详细研究的受试者。无需说，由于其在工业和保健中的适用性使得胚胎深低温保藏处于深低温保藏研究的前沿。然而，在根据本研究的方法中和同样地在本描述中，术语‘小鼠胚胎’和术语‘生物材料’可互换使用。在本说明书中，实验数据也可为牛IVF胚胎和公牛精子的数据，只要其出乎意料的增强解冻后存活即可。代表性生物材料可以是例如不同哺乳动物物种植入前和植入后阶段胚胎、脊椎动物和人的卵母细胞、精子、干细胞、组织、器官或者甚至整个身体。脊椎动物可以是任何物种，例如鱼、鸟或者哺乳动物，优选牛、马、山羊、绵羊、猪、其它家禽、宠物、包括人在内的灵长类动物。

作为高度发育真核生物的小鼠胚胎比缓步动物和细菌更容易受到流体静力压的影响。所以第一个目标就是要建立处于压力下的小鼠胚胎形态学和存活方面的基本特性。

为了对本发明方法进行完全研究，制造了一个原型设备。图8中所描述的加压设备1已经用于开展了在下面实施例中进行讨论的实验。

加压设备1包括一个具有两个开口3、4(一个在顶部和一个在底部)的圆柱形压力室2，并且在顶部开口连着压力表5且通过底部开口4插入活塞6。压力表5可以是任何合适的量表，只要它能测量目的区域压力即可，也就是在1-250MPa、优选10-100MPa、更优选20-75MPa并且仍然更加优选30-60MPa的范围。压力室2具有60mm左右的内高和20mm左右的宽度。室2的壁7能耐受250MPa的压力、优选至少高达75MPa的压力并且仍然更加优选高达60MPa的压力。室2的壁7优选地由抗腐蚀材料制造，优选塑料或不锈钢。为了增强底部开口4处的壁7内侧与活塞6之间的紧密装配，后者装备了环形压力密封8，例如特氟隆(Teflon)密封环。此种或其它种类压力密封8也优选应用于装配压力表5的顶部开口3处。围绕底部开口的部分壁7有一个外围突出，形成了凸缘9。压力室2还装配厚盖10，以挡住活塞6并使其进一步向室2的内部移动。通过如螺丝11的固定方法，将盖10连在凸缘9上。每个螺丝的抗拉强度必须适当高以抵抗由于室2中的高压产生的拉力。在压力室2中填充适合在相对较小压缩下产生高压的介质12，这种压缩可以通过将活塞进一步压向压力室2的内部引起。这种介质可以是能应用于高压技术领域的任何已知类型的非固体介质12(优选流体或者胶状介质12)，然而为了研究的目的使用普通水。为了防止压缩过程中介质12发热，压力室2的壁7优选为导热材料。

应当意识到，上述加压设备1可以建造成此种直径以致于为了实现本发明的改进深低温保藏方法提供轻便的装置。下列尺寸仅仅作为一个实例，并且应当理解本领域技术人员能轻易地预想更大的和更小的具体设备。压力室2具有60mm的内高H_i和20mm的内径D_i，这也与活塞6的直径对应。活塞6的高度H_p的选择与H_i相称，例如在短测试设备中其为20mm。室2的壁7具有10mm左右的厚度D_W。环绕活塞6的压力密封8具有5mm的高度H_s和2mm的厚度D_s。用于将盖10固定到凸缘9的螺丝11具有8mm的直径D。此种尺寸的商品化螺丝11具有800MPa的抗拉强度，这足以确保承担高达200MPa的压力。可以根据待处理生物材料和用于将生物材料应用于设备的可得装置来设计设备的实际尺寸。

在待深低温保藏小鼠胚胎的预处理过程中，将胚胎(预先装入带有适宜胚胎保存液的塑料吸管中)放置到压力室2内的流体介质12中(后者为普通水)；在对其不施加任何额外力的情况下将活塞6插入底部开口4处，并且通过螺丝11在邻接活塞6的位置将盖10连接到室2的凸缘9上，在介质12处于非压缩状态时活塞6从室2中部分突出。接着，通过以一定速度并且以达到所开展特定实验所要求的压力条件的程度拧紧螺丝(或者人工或者通过自动旋转螺丝)将盖拉近底部开口4，以便使活塞6更一部压向压力室2内部。通过压力表5监测室2内的所得到的压力。经过所要求的时间段后，通过逐渐松开螺丝11或者通过将压力表5从顶部开口移走由此使流体介质12以类似瞬时方式膨胀将室减压。

把胚胎放进室的装置并不仅限于塑料吸管。根据特殊应用和生物材料，可以将待处理样品放置入不同支持结构。例如，可以将胚胎或细胞放在冷冻环或者电子显微镜格(electron microscopic grid)上。在不同的实施方案中，可以将含有生物材料的一滴保存溶液简单地包上作为流体介质12的矿物油。在该情况下，整个加压设备可以小型化，使它能够适合在立体显微镜下轻松恢复。对于肉眼可见的生物材料，不需要特殊放置装置，样品可以放进室内并且流体介质12本身就可以为保存溶液。能够对生物材料产生高流体静压力作用的用于防止和保存室内生物材料的任何装置均处于本发明的范围内。

通过提供程序化的控制系统可以将加压设备1完全自动化。这种控制系统可能包括以下输入参数：压力增加率、最大压力时的期望时间和压力释放率。尽管有压力室2的壁7这样的高度导热材料足以防止有害的温度变化，但是还可以使用温度控制装置。可以将温度控制装置想象成为一种综合加压冰冻设备(integrated pressurizing-freezing device)，这为深低温保藏过程提供了一步解决方案。在那种情况下，加压和冷冻部件可以是自动化的并且安装到装置上用于根据不同生物材料的要求程序控制压力处理和冷冻。

还可以想象到一种轻便设备，其与上述测试单元非常相似并能提供用于处理生物材料的容易且简单的方法，该步骤之后使用容易可得的技术保存所述生物材料。这种方法会帮助偏远地区的从业者，或者用于不同的计划诸如野生生物保护。

精心设计实验以便研究不同生物材料的压力耐受性。为了以后的实际应用，所用压力和时间大小限定在最宽的可应用范围。例如，如图7所示，水的相变温度随着压力降低，从0.1MPa时的0℃降低到210MPa时的-21℃，并且在该压力水平以上观察到相反的作用。所以，在根据本发明方法中使用的压力在1MPa至250MPa范围内选择或者甚至可高达在设备运行温度时介质的冰点。更加具体而言，能施加于膨胀胚泡期胚胎的流体静力压是1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200或250MPa，或者为这些中间范围间的任何值。

可以根据预先确定的压力-时间谱向所述生物材料施加流体静力压。本领域技术人员应当意识到，施加到生物材料的压力要根据待处理材料随着时间逐渐升高。适于特定生物材料的谱可以按经验确定，其可能是线性的、逐渐的或者其它常规应用的时间谱。

类似地，对于将处于高流体静力压下的生物材料可以选择广的时间段。更加具体而言，小鼠胚胎可以在选定压力下保持1秒和6小时之间的时间段，更加具体而言为1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、8分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、300分钟或360分钟。随着压力的增加，胚胎在压力作用下的存活时间降低。

本领域技术人员应当意识到，压力预处理结束和深低温保藏开始之间的时间在特殊实施方案中相当不同。生物材料的状态会在该时间范围内依赖于给定方案而发生改变。如果时间足够长则这一阶段允许细胞进行物理修复，或者相反细胞过程启动(即发生休克蛋白的合成和积累)。在不同的环境下，这些影响可能有利或者有害；因此在这点上有必要通过实验优化方案。

图1显示胚胎可以在相当大的压力下存活而其形态没有任何可见变化(例如90MPa 1秒或者30MPa 2小时)。胚胎的压缩依赖于所施加压力处理的大小和持续时间。本发明的范围不受理论限制，我们认为压力不是将水从胚泡挤出的直接原因。根据所引用文献，胚胎的压缩是由于压力诱导的不同蛋白质(冷休克蛋白，CPS)产生、蛋白质结构和代谢过程可逆改变的结果。压缩的胚胎可以在体外培养4-5小时后恢复其正常形态，并且与对照一样重新开始发育(例如通过90MPa 30分钟或者30MPa 3小时刺激的胚胎)。

本发明的范围不受理论限制，从对IVF牛胚胎的研究推测压缩不是最佳压力预处理的标准。压缩是压力改变膜渗透性、改变通过细胞膜的扩散和主动转运的结果。这种可逆的形态学变化认为是一种形态‘标记’，其标志着胚胎受过‘亚致死’冲击处理。根据文献，‘亚致死’休克是一种诱导所谓‘休克蛋白’产生的冲击，据猜测‘休克蛋白’在提高深低温保藏成功率中起作用。

然而，在某些应用中压缩胚胎优选用来深低温保藏。加压后，膨胀的胚泡开始压缩，并在这种状态下持续3-4小时，然后它们再次膨胀。基于这种现象，选择在冷冻过程之前使用压力处理的胚胎。既然胚胎的形态学改变和压力预处理的有利影响可能来自于蛋白质结构和/或特性的改变和/或不同压力诱导蛋白质的增强产生，所以对这些蛋白质的检查预示着在深低温保藏过程之前生物材料被施加了高流体静力压。

在一定程度上，压力预处理还与胚胎在深低温保藏后重新开始其正常发育的时间关联。观察该过程指示着预处理的性质，因为施加高流体静力压能大大缩短恢复所需的时间。

压力强度越高，胚胎存活时间越短。压力影响超出一定的强度和持续时间时会引起不可逆的变化：体外培养2小时后胚胎开始碎裂或者在减压后已经碎裂(例如通过90MPa 2小时或者30MPa 5小时刺激的胚胎)。本领域技术人员能够通过使用对于所使用特殊生物材料的常规实验来确定这些压力限和时间限。

应当意识到，通过逐渐减压能提高加压胚胎的存活率。研究表明，如果加压胚胎逐渐恢复则其存活率明显提高。虽然90MPa处理60分钟对所有胚胎都是致死性的，但是使用120分钟逐渐减压时存活率为80％。减压时间也是本发明的特征，这可以通过本领域技术人员对特殊应用的考虑来确定。更加具体而言，保持在所选择压力下的小鼠胚胎可以在1秒和4小时之间的时间段内减压，更加具体而言为1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、8分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟或240分钟。与压力的应用类似，可以根据预先确定的压力-时间谱进行减压。

同样不受理论限制，对该特征的可能解释为：在压力下产生了相当数量的CO₂(Abe和Horikoshi 1995)。压力的提高促进CO₂的水合和离子化(HCO₃^-和H⁺)，这是因为反应以依赖于所施加压力强度的方式伴随着体积的降低(#0.26ml/mol)(Palou等，1997；Welch等，1993)。胞内产生的二氧化碳立刻溶解，然后游离出HCO₃^-和H⁺，这样就降低了胞内的pH(Abe和Horikoshi，1995，1997，1998；Abe等，1999)。可以想象，通过升高的压力所维持的平衡对于大气压力下的胚胎是致死性的。也可以这样假设，压力的瞬间降低导致CO₂从细胞质的水合和离子化形式释放增加，从而引起胚胎立即死亡。在具有一定减压时间的条件下，通过提高的流体静力压可逆失活的质膜蛋白质(H⁺-ATP酶)(Schmid等，1975；Péqueux和Gilles，1978)又开始起作用，其(和主动扩散一起)逐渐将平衡移向生理状态。

先前，Nakahashi等(2000，2001)将高流体静力压(HHP)施加于移植用大鼠肝脏的零下温度保存以便降低冷冻损伤。该方法使用HHP大大降低了培养基的冰点，因此可以在零下温度保存生物材料而没有任何深低温保藏的负面影响。为了以小鼠胚胎为例研究深低温保藏的方法，将研究设计成在0℃下对胚胎加压。胚胎存活率显著降低。虽然在室温(RT)下用30MPa处理45分钟胚胎平均存活率为90％，但在0℃下进行同样加压处理胚胎没有一个存活。对于60MPa和90MPa的压力，在0℃下分别处理10分钟或者5分钟后胚胎全部死亡。相反，在室温时该两种情况下的存活率都在90％左右。还将胚胎在0℃下加压并逐渐减压。在低温下使用逐渐减压对于胚胎的存活并没有有利影响。基于这些发现，由于压力和低温一起对胚胎是致死性的所以此现象的用途在这种形式是不实用的。

本发明涉及通过流体静力压刺激改善深低温保藏小鼠胚泡的解冻后存活。这可以通过将加压的胚胎在用任何类型深低温保藏方法处理并解冻之后转移到培养基和/或者假孕接受者中评价。体外发育、植入和进一步的子宫发育和健康幼仔的出生都是其具有生物学潜能和遗传潜能的明显证据。

如上所详细描述，通过在冷冻步骤之前进行一定的压力处理能提高深低温保藏的膨胀小鼠胚泡的存活率。将60MPa 30分钟的压力施加于胚泡，此时大约80％-90％的胚胎变成压缩的并且存活率与未处理对照没有差别。根据体外评价结果，施加压力处理显著改善了冷冻后胚胎的体外发育。体外研究表明，流体静力压刺激不但提高了所处理胚泡的存活率，而且还改进了胚胎重新回到天然状态的恢复时间。在我们的代表性的研究中，在6小时后98％的加压处理胚泡在形态(直径、结构完整性和大体形态)上与对照胚胎完全相同，并且95％的胚泡和对照一样在20小时内完全孵化。没有经过压力处理的胚胎仅仅在融化后20小时又重新膨胀。重新膨胀胚泡的比例显著低于接受压力处理的那些胚泡(46％对98％)。另外，该组中没有胚胎孵化。因此，很明显根据本发明的方法适宜获得高可育性小鼠胚胎。

附图描述

图1显示在室温用10MPa和150MPa之间的不同压力(相差10MPa)处理不同时间(1秒、5分钟、15分钟和以30分钟的间隔从30分钟到300分钟)胚胎的存活率。每组使用14-16个胚胎；每一实验重复三次。在标有‘a’和‘b’的区域内的胚胎存活率与未处理对照没有差异(p＜0.05)。

图2显示用90MPa加压30、60、120分钟并减压30-180分钟的胚胎存活率。(对于加压30、60和120分钟的即可减压存活率分别为50％、0％、0％)。在图形上用不同上标标记的存活率彼此之间显著差异(p＜0.05)。

图3a显示在室温用30、60和90MPa的压力处理1秒至45分钟的胚胎存活率。

图3b显示在0℃用30、60和90MPa的压力处理1秒至45分钟的胚胎存活率。每组使用12-15个胚胎；每一实验重复三次。在室温和0℃下加压组之间具有显著差异(p＜0.01)。

图4显示精子运动性(加压处理和对照)的平均值。

图5显示经过加压和冻融后Bull I精子的平均运动性。

图6显示经过加压和冻融后Bull II精子的平均运动性。

图7显示不同压力下水的冰点。

图8是根据本发明的可能加压设备的横截面观示意图。

实施例

实施例1-4的材料和方法

实验动物和胚胎的产生

在标准条件下(22+/-2℃；黑暗12小时/光照12小时；水和食物随意)饲养CB6F1(Charles River，德国)小鼠。

通过腹膜内注射10IU的PMSG(Sigma，美国)并且在46小时后接着注射10IU的hCG(Sigma，美国)使雌体超排卵。施用hCG6小时后，将雌性与单配的可育雄性交配。通过用FertiCult冲洗液(FertiPro N.V.，比利时)冲洗输卵管获取一至两个细胞时期的胚胎(0天和1天)。在5％CO₂和最大空气湿度的恒温箱中于37℃培养胚胎。单细胞和紧密桑椹胚阶段的胚胎在矿物油Ovoil(Vitrolife，瑞典)下的G1.2培养基(Vitrolife，瑞典)中培养。随后，把胚胎转移到Ovoil下的G2.2(Vitrolife，瑞典)中培养，直到扩大到胚泡期。

加压

将胚泡装进含有M2(Sigma，美国)的塑料吸管中，不要出现气泡(每个吸管内7-9个胚胎)，然后将吸管加热封口。把吸管放入压力室，压力室内装满了作为压力介质的水。定做的能够精确提供1-150MPa范围内的控制压力的加压设备用不锈钢制作(内径2cm)并且与压力表相连。通过人工控制螺丝将活塞推进压力室产生流体静力压。达到预期的压力需要5秒到5分钟(分别为10MPa和150MPa)；压力释放时间是3秒。在研究逐渐减压影响的实验中，释放时间在30-210分钟之间。在0℃下开展的实验中，压力室浸没于Bio-cool(FTS-Systems，NY，美国)的冷浴中。

具有先前加压处理的深低温保藏

将胚胎随机分成三组。组I胚泡为如下所提到的根据Nowshari和Brem(1998)在包含7M乙二醇的玻璃化溶液中深低温保藏。组II胚胎用60MPa压力处理30分钟，随后按同样方法冷冻。组III作为未处理对照。解冻后，胚胎体外培养24小时。

深低温保藏

胚胎在添加10％胎牛血清(FCS)(Sigma，美国)的含有1.5M乙二醇(Sigma，美国)和0.25M溶于M2(Sigma，美国)的蔗糖的溶液中平衡5分钟，然后转移到预先装载到0.25ml塑料吸管中的玻璃化溶液中(含有7M乙二醇、0.5M溶于M2的蔗糖和10％FCS)(7-9个胚胎/吸管)。最后，将吸管加热封口。

在暴露于玻璃化溶液中1分钟后，把吸管缓慢浸入到液氮中。把吸管转移到30℃水中30秒进行解冻，随后恢复胚胎并置于再水合培养基中(添加10％FCS的0.5M的溶于M2的蔗糖)5分钟。然后如上所述在培养基G2.2中培养胚胎(Nowshari和Brem，1998)。

胚胎转移

如上所述，胚胎在G2.2中培养2小时。然后，在每个实验组中将它们分成‘死亡的’和‘存活的’，把它们分别转移(每个动物7-12胚胎)到假孕3天接受者中。将未处理胚泡转移作为对照。

评价和统计学分析

在刚刚释放压力后或者在刚刚解冻后和解冻后2、3、4、6、12、20和24小时，检查胚胎质量。通过形态学外观评价胚胎的存活：卵裂球的完整性、囊胚腔再膨胀和从透明带孵化都是存活的征兆。未处理的胚泡作为对照。

对于体内评价，如上将加压处理的胚胎在G2.2中培养2小时。然后以每个动物7-12个胚胎转移到假孕3天接受者中。转移未处理的胚泡作为对照。健康幼仔的出生是胚胎体内存活的证据。

用卡方测验比较了其与对照的存活率。

实施例1.在室温不同压力下小鼠胚胎的存活

在本实验中，将胚胎于室温暴露于10-150MPa(相差10MPa)的不同流体静力压下不同时间(从1秒至300分钟)。

超过一定量的压力和时间处理(图1)会导致可逆的形态学变化。膨胀的胚泡被压缩到透明带内：囊胚腔消失，卵裂球大小缩小，但是他们的结构完整性没有改变。体外培养4-5小时后，这些胚泡重新膨胀并且在24小时内从透明带孵化(a)。受到较小冲击的胚胎没有表现出形态学改变并且在体外培养24小时内孵化(b)，而受到较大冲击刺激的胚胎不能从压缩的状态重新膨胀并在2小时内碎裂，或者在减压后就已经分解(c)(图1)。

对于体内评价，在减压后的体外培养2小时之后判断所刺激胚胎的‘存活’(a和b)和‘死亡’(c)，并分别转移至接受者中。在170个转移的‘a’和‘b’胚胎中，出生了145个健康幼仔(85％)，但是在49个‘c’胚胎中没有一个幼仔出生(0％)。

在非加压对照、压缩和非压缩的加压‘a’和‘b’胚胎的孵化率(体外)和出生率(体内)之间没有显著差异(p＜0.05)。

这些结果表明，尽管压力强度越高胚胎存活时间越短，但是胚胎能够在相当量的压力下存活而存活率并没有任何改变(图1)。在体外培养2小时没有碎裂的胚胎与未处理对照具有相同的体外和体内存活率。

实施例2.使用不同减压方案后小鼠胚胎的存活

在本实验中我们研究了加压处理胚胎的存活率是否会通过逐渐减压得到改善。

将膨胀胚泡在90MPa下保持30、60和120分钟(此时在室温瞬间减压的存活率分别是50％、0％和0％)，然后在30、60、90、120和150分钟内分9步逐渐释放压力。结果表明通过逐渐减压显著改善存活，减压时间有一个最佳范围，其取决于胚胎在压力下所维持的时间。在压力下胚胎维持的时间越长，则最佳的出现效果时间(come-up time)就上升。随着加压时间的增加，通过减压所达到的最大存活率降低(图2)。

在体外评价时，将54个‘存活’和35个‘死亡’胚胎转移入9个接受者。在18天计数，在54个‘存活’胚胎当中有47个发生植入(87％)，但是在35个‘死亡’胚胎当中没有一个发生植入。‘存活’组的植入率和对照组没有差别(p＜0.05)。

实施例3.于低温不同压力下小鼠胚胎的存活

在本实验中研究温度对加压处理胚胎存活能力的影响。

在低温下(0℃)将胚胎在30、60和90MPa的压力下处理1秒、5、10、15、30和60分钟。虽然未经过加压处理的胚胎能够在0℃生存相当长的时间而存活率没有任何明显改变，但同时使用30、60、90MPa的压力处理分别在45、10、5分钟后胚胎全部死亡。与室温下处理组相比，在低温下加压处理的胚胎的存活率显著降低(P＜0.01％)(图3a，3b)。

在体外评价时，将40个‘存活’和28个‘死亡’胚胎转移至7个接受者中。在19天计数，在40个存活的’胚胎当中有34个发生植入(85％)，而在28个‘死亡的’胚胎当中没有一个发生植入。‘存活’组的植入率和对照组没有差别(p＜0.05)。

将于0℃、90MPa压力下保持30分钟的胚胎逐渐减压。在我们所使用的任何恢复时间(30、60、90、120、150、180分钟)时没有胚胎存活。在每组中使用8-12个胚胎，实验重复三次。

实施例4.在压力处理、冷冻和解冻后小鼠胚胎的存活

在本研究中，我们探索了深低温保藏的膨胀小鼠胚泡的存活率是否能够通过在冷冻过程之前进行加压处理而得到改善。结果示于表1。

      表1.进行/不进行先前压力处理的深低温保藏

      胚胎在冷冻-解冻后的存活

   n  6小时后存活征兆 20小时后存活征兆    1/2膨胀    完全膨胀    1/2膨胀  2/3膨胀  完全膨胀  已孵化 组I   115    9％    0％^b    17％  10％  19％  0％^b 组Ⅱ(压力处理)   95    -    98％^a    -  -  3％  95％^a 未处理对照   107    -    99％^a    -  -  5％  94％^a

具有不同上标的字母彼此之间差异显著(p＜0.01)

可以观察到在加压处理组和非加压处理组之间存活率差异显著(p＜0.01)。在深低温保藏之前接受压力处理的那些胚胎重新膨胀更快(4-6小时对20小时)且存活率更高(98％对46％)(表1)。对照组和压力处理组的存活率和孵化率间没有显著差异。

实施例5.压力处理、冷冻和解冻后牛胚胎的存活

材料和方法

卵母细胞收集和体外成熟(IVM)

除非另外指出，化学药品购自EMBRAPA(Brasilia，巴西)。从屠宰场收集卵巢并保存于35-37℃的生理水中。使用带有18G针头的20ml注射器吸取2-10mm滤泡来获取卵丘卵母细胞复合体(COC)，并且收集到50ml离心管中。在沉淀10分钟后，把COC吸入到含有已添加了胎牛血清(FCS)、青霉素、链霉素和肝素(Sigma H3149)的TCM-199 Hank′s培养基(Gibco)的培养皿中。收集之后，COC在成熟培养基(添加了FCS、LH(Sigma)、FSH(Sigma)、L-谷胺酰胺、青霉素和链霉素的TCM-199 Earl′s培养基)中洗涤3次并转移至2ml成熟培养基中(每个培养皿大约100个COC)，用矿物油覆盖。卵母细胞在38℃、5％CO₂和最大空气湿度下，成熟22小时。

精子准备、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)

为了进行体外受精，将COC在受精培养基中洗涤3次，然后以20-25个为一组转移至含有4滴200μl受精培养基(添加了BSA、青霉素(SigmaP4875)、hipotaurin(Sigma H1384)、epinefrin(Sigma E4250)和肝素(Sigma H3149)的TALP)的培养皿中，受精培养基上覆盖着矿物油。通过将冻融的精子(Gentec，Cuiaba，巴西)在Percoll不连续密度梯度上(在2ml的90％Percoll上加上2ml的45％Percoll)室温、700g离心20分钟，得到能动的精子。收集底部90％部分的精子沉淀，用HEPES缓冲的Tyrode’s液洗涤，并通过在700g离心5分钟沉淀。精子用血细胞计数器计数并在适当体积的TALP中稀释至2×10⁶个精子/ml的浓度；向每一受精培养基滴中加入200μl此种悬浮液的等分试样。将培养板在5％CO₂、空气湿度下于39℃孵育19小时。然后将可能的受精卵在5％CO₂、空气湿度下于39℃体外培养于盖有矿物油的SOF小滴中。

加压

将膨胀的胚泡装入含有胚胎保存培养基(Emcare Holding，Emcare，新西兰)的0.25ml塑料吸管中，不留气泡，然后用PVC将吸管密封。将吸管放进装满作介质的水的压力室中。如上详述，将胚胎在室温下暴露于60-90MPa(相差10MPa)的不同流体静力压下不同时间(15、30、45、50、60、90、100分钟)。

进行先前加压处理的深低温保藏

将胚胎随机分成三组。如下所提到，组I胚泡在包含1.5M乙二醇(EG)的冷冻溶液中深低温保藏。组II胚胎用80MPa压力处理50分钟，随后按同样方法冷冻。冷冻开始和加压处理之间的时间间隔为4-5分钟。组III作为未处理对照。解冻后，胚胎体外培养24小时。

深低温保藏

将预先装入0.25ml塑料吸管中的胚泡(每个吸管7-9个胚胎)在由1.5M乙二醇(Emcare，新西兰)组成的冷冻溶液中平衡8分钟。用PVC将吸管密封。将吸管放入程序控制的冷冻仪(Bio-cool，FTS-Systems，美国，纽约)中预冷至-5.2℃。三分钟后，植冰。在10分钟后，将吸管以-0.5℃/分钟冷却至-32℃，随后将其投入液氮中。通过在空气中轻轻摇动10秒然后将吸管放到35℃水中直到吸管中的冰融化将吸管解冻。从吸管中取回胚泡，在SOF中洗涤三次，移到盖有矿物油的SOF中，并放回培养箱培养24小时。

评价和统计学分析

在刚刚释放压力后或者在刚刚解冻后和解冻后2、3、4、6、12和24小时，检查胚胎质量。通过形态学外观和体外继续发育评价胚胎的存活：胚泡完整性、囊胚腔再膨胀和从透明带孵化都是存活的征兆。未处理的胚泡作为对照。

用卡方测验比较了其与对照的存活率。P＜0.05的概率值认为具有统计学意义。

结果

不同压力处理后胚胎的存活和继续发育

在第一组实验中，胚胎暴露于不同流体静力压下不同时间。结果总结于下表2：

                 表2.进行/不进行先前压力处理的深低温保藏

                 牛胚胎在冷冻-解冻后的存活

   压力  时间    n(减压后压缩/减压后未压缩)    继续发育6小时    继续发育24小时(已孵化)    I-II    III-IV    I-II    III-IV  80MPa  45分钟    8(5/3)    8    -    8(4)    -  60MPa  60分钟    8(3/5)    8    -    8(5)    -  90MPa  45分钟    7(7/0)    4    3    4(1)    3  90MPa  30分钟    7(3/4)    6    1    6(6)    1  对照    8    7    1    6(2)    2

I-II：完全再膨胀或2/3再膨胀的第一或第二类胚胎；III-IV：第三类胚胎或者死亡胚胎进行和不进行压力预处理的玻璃化胚泡的体外继续发育

在第二个研究中，我们探究了通过在冷冻步骤之前进行压力处理是否能改善深低温保藏的膨胀的体外成熟/受精/培养的牛胚泡的体外继续发育。每个实验组使用8-12个胚胎，实验重复6次。结果示于表3。

可以观察到加压处理组和非加压处理组的体外存活率之间具有显著差异(p＜0.01)。在深低温保藏前受到压力处理的那些胚胎的再膨胀更快(1-2小时对4-6小时)且存活率更高(81％对41％)(表3)。对照组和压力处理组之间在存活率和孵化率上没有显著差异。

           表3.冷冻前进行或不进行压力预处理的IVMFC牛胚泡

           在解冻后的体外继续发育

  1小时  4小时  12小时  24小时  n   I+II  IV  I+II  IV  已孵化  I+II  IV  已孵化  I+II  IV 进行预处理的冷冻  59   88％  12％  81％  19％  12％  81％  19％  17％  81％  19％ 未处理  61   46％  54％  41％  59％  0％  41％  59％  0％  41％  59％

I-II：完全再膨胀或2/3再膨胀的第一或第二类胚胎；IV：死亡胚胎

结论

我们的结果显示，在冷冻之前施加压力处理能改善IVMFC(卵母细胞的体外成熟、体外受精、胚胎的体外培养)牛胚胎的体外发育速度、存活和孵化率。该研究为压力刺激能极大增加深低温保藏成功率提供了进一步的证据。应当意识到，可以容易地将上述实验中的方法适用于全部范围的生物材料，特别是不同起源例如马、山羊、猪或者灵长类动物的胚胎，包括人胚胎。

实施例6.压力处理、冷冻和解冻后精子的存活

在本研究的第一部分中，我们旨在描述HHP如何影响新鲜公牛精液中活动细胞的比率。在实验的第二部分中，我们从草拟的压力-时间-精子运动性图表中选择4个参数对，并且比较了用所选择压力-时间参数预处理冷冻公牛精子的解冻后运动性和没有进行预处理的冷冻公牛精子的解冻后运动性。

精液样品从奥地利的Klessheim人工授精中心获得。如所述，样品用AndroMed混合剂(MiniTub，德国)稀释精子至浓度为8×10⁷个/ml。稀释的精子放入0.25ml吸管中，并保持室温。在压力处理前把装有精液样品的吸管切成两部分。一半加热封口并在特定压力/时间参数下加压；另一半用于比较加压后的运动性。每个压力/时间参数下的实验重复7次，通过两个分开的助手单独进行光学显微镜研究来估计改进的运动性。处理组用以下参数刺激：10MPa 30、60、90和120分钟；30MPa 30、60、90、120和510分钟；50MPa 30、60和90分钟；70MPa 30、60和90分钟；90MPa30、60、90、120和510分钟。加压设备通常用不锈钢制造，包括装有作为压力介质的水的压力室，和权威认可的压力表。达到预期压力量的时间为1-5分钟，减压需要2-3秒。

对照样品的平均运动性为75-90％，而加压处理样品的平均运动性为55％(90MPa/120分钟)至84％(10MPa/30分钟)。30MPa/510分钟和90MPa/510分钟的处理组与其它加压处理组相比运动性显著降低(分别为27％和33％；p＜0.05)。见图4。

在试验的第二部分中，精液样品来自两头公牛(其中一个有很差冷冻能力的历史)。如上述稀释样品，然后分成四个处理组。将处理组分成两半：一半用加热封口并在冷冻前用I：90MPa/30分钟；II：90MPa/90分钟；III：30MPa/30分钟；IV：30MPa/90分钟加压处理，另一半用相同的冷冻方法(在5℃平衡60分钟，然后在-110℃平衡10分钟，之后投入液氮)冷冻而不进行预处理。35℃水浴30秒解冻。也检查了进行和不进行加压处理的各组的最初运动性。每一试验重复8次。

两头公牛的平均最初运动性为65％-80％之间，然而在加压处理后降低到45％-75％之间。在两头公牛的平均解冻后运动性中，用压力预处理的样品要显著优于没有先前加压处理的冷冻样品(p＜0.001)(Bull I：没有加压处理的2-3％对加压处理的17-33％-图5；Bull II：没有加压处理的0％对压力预处理的21-35％-图6)。在所用参数当中，30MPa/90分钟证实显著更优(33和35％；p＜0.05)。

在我们的实验中，本研究清楚地描述了先前的压力处理对深低温保藏的公牛精子的解冻后运动性具有有利影响。该研究对压力刺激能极大的提高深低温保藏成功提供了进一步的证据。应当意识到，可以容易地将上述实验中的方法适用于全部范围的生物材料，特别是不同起源例如马、山羊、猪或者包括人在内的灵长类动物起源的精子。

工业适用性

上述实施例中的结果显示，在深低温保藏前施加压力处理能明显改善胚胎的体外发育速度、存活和孵化率。因此，达到了所有此种努力的最终目标：更多后代产生。同样，关于牛胚胎和公牛精子的数据预示着用于深低温保藏生物材料的发明的观点具有广阔适用性。根据本发明的方法的应用对于改善所有种类(包括其它哺乳动物种类，不排除人)胚胎深低温保藏和胚胎操作成功率是有用的并且可以应用于卵母细胞、胚胎干细胞、组织等等。本方法也在涉及应用生物材料深低温保藏的其它领域具有广阔潜能。

参考文献

Abe，F.和Horikoshi，K.(1995).Hydrostatic pressure promotes theacidification of vacuoles in Saccharomyces cerevisiae.FEMS MicrobiolLett 130，307-312.

Abe，F.和Horikoshi，K.(1997).Vacuolar acidification inSaccharomyces cerevisiae induced by elevated hydrostatic pressure istransient and is mediated by vacuolar H+-ATPase.Extremophiles 1，89-93.

Abe，F.和Horikoshi，K.(1998).Analysis of intracellular pH in theyeast Saccharomyces cerevisiae under elevated hydrostatic pressure：astudy in baro-(piezo-)physiology.Extremophiles 2，223-228.

Abe，F.，Kato，C.和Horikoshi，K.(1999).Pressure-regulatedmetabolism in microorganisms.Trends Microbiol 7，447-453.

Aldridge，B.E.，Bruner，L.J.(1985).Pressure effects on mechanismsof charge transport across bilayer membranes.Biochim Biophys Acta817，343-354.

Archer，J.，Gook，D.A.，Edgar，D.H.(2003).Blastocyst formation andcell numbers in human frozen-thawed embryos folloWing extended culture.Human Reproduction(Oxford，England)18，1669-1673.

Baguisi，A.，Arav，A.，Crosby，T.F.，Roche，J.F.和Boland，M.P.(1987).Hypothermic storage of sheep embryos with antifreeze proteins：development in vitro and in vivo.Theriogenology 48，1017-1024.

Bridgman，P.W.(1911).Water in the liquid and five solid formsunder pressure.Proceedings of the American Academy of Arts and Science47，441-558.

Bridgeman，P.E.(1970).The physics of high pressure.New York：Dover

Butz P，Ludwig H.(1986).Pressure inactivation of microorganisms atmoderate temperatures.Physica B+C 139-140，875-877.

Fahy，G.M.，MacFarane，D.R.，Angell，C.A.和Meryman，H.T.(1984).Vitrification as an approach to cryopreservation.Cryobiology21.407-426.

Fukuda，A.，Osawa，T.，Oda，H.，Tanaka，T.，Toyokuni，S.和Uchida，K.Oxidative stress response in iron induced acute nephrotoxicity：enhanced expression of heat shock protein 90.Biochem Biophys ResCommun 1996；219：76-81.

Garcia-Gardena，G.，Fan，R.，Shah，V.，Sorrentino，R.，Cirino，G.，Papapetropoulos.Dynamic activation of endothelialnitric oxide synthaseby HSP90.Nature 1998；392：821-4.

Graumann，P.L.，Marahiel M.A.(1999).Cold shock proteins CspBand CspC are major stationary-phase-induced proteins in Bacillus subtilis.Arch Microbiol 171，135-138.

Gross，M.，Jaenicke，R.(1994).Proteins under pressure.Theinfluence of high hydrostatic pressure on structure，function and assemblyof proteins and protein complexes.Eur J Biochem 221，617-630.

Huang，S.Y.，Kuo，Y.H.，Lee，W.C.，Tsou，H.L，Lee，Y.P.，Chang，H.L.等，Substantial decrease of heat-shock protein 90 precedes thedecline of sperm motility during cooling of boar spermatozoa.Theriogenology 1999；51：1007-16.

Huang，S.Y.，Kuo，Y.H.，Tsou，H.L.，Lee，W.C.，King，Y.T.，Huang，H.C.等，The decline of porcine sperm motility by geldanamycin，aspecific inhibitor of heat shock protein 90(HSP90).Theriogenology 2000；53：1117-84.

Ishwar，A.K.，Memon，M.A.(1996).Embryo transfer in sheep andgoats：a review.Small Ruminant Research 19，35-43.

Jaenicke，R.(1991).Protein stability and molecular adaptation toextreme conditions.Eur J Biochem 202，715-728.

LaTena，A.，Brandi，A.，Falconi，M.，Spurio，R.，Pon，C.L.，Gualerzi，C.O.(1991).Identification of a cold-shock transcriptionalenhancer of the Escherichia coli major cold shock gene encoding nucleotideprotein H-NS.Proc Natl Acad Sci USA 88，10907-10911.

Leibo，S.P.和Songsasen，N.(2002).Cryopreservation of gamets andembryos of non-domestic species.Theriogenology 57.303-326.

Macdonald，A.G.(1987).The role of membrane fluidity in complexprocesses under high pressure.在：Jonnasch，H.W.，Marquis，R.E.，Zimmerman，A.M.编，Current Perspectives in High Pressure Biology.London：Academic Press，207-223页.

Medeiro，C.M.O.，Forell，F.，Oliveira，A.T.D.和Rodrigues，2002.J.L.Current Status Of Sperm Cryopreservation：Why Isn′t It Better？Theriogenology 57：327-344.

Murakami，T.H.，Zimmerman，A.M.(1973).DNA syntheseis inTetrahymena：a pressure study.Cytobios 7，171-181.

Nowshari，M.A.，Brem，G.(1998).Effeet of cryoprotectants and theirconcentration on post-thaw survival and development of expanded mouseblastocysts frozen by a simple rapid-freezing procedure.Theriogenology50，1001-1013.

Palou，E.，Lopez-Malo，A.，Barbosa-Canovas，G.V.，Welti-Chanes，J.和Swanson，B.G.(1997).Kinetic analysis of Zygosaccharomyces bailiiinactivation by high hydrostatic pressure.Lebensm.-Wiss.U.Technol.30，703-708.

Pearl，L.H.和Prodromou，C.Structure and in vivo function of Hsp 90.Curr.Opin Struct Biol 2000；10：46-51.

Piqueux，A.和Gilles，R.(1978).Effects of high hydrostatic pressures onthe activity of the membrane ATPases of some organs implicated inhydromineral regulation.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 59，207-212.

Phadtare，S.，Alasina，J.，Inouye，M.(1999).Cold-shock response andcold-shock proteins.Curr Opin Microbiol 2，175-180.

Phadtare S.，Alasina J.和Inouye M.(1999).Cold-shock response andcold-shock proteins.Curr Opin Microbiol 2，175-180

Graumann，P.L.和Marahiel，M.A.(1999).Cold shock proteins CspBand CspC are major stationary-phase-induced proteins in Bacillus subtilis.Arch Microbiol 171.135-138.

Prodromou，C.，Roe，S.M.，O′Brian，R.，Ladbury，J.E.，Piper，P.W.和Pearl，L.H.Identification and structural characterization of theATP/ADP-binding site in the HSP90 molecular chaperone.Cell 1997；90：65-75.

Rall，W.F.和Fahy，G.M.(1985).Ice-free cryopreservation of mouseembryos at-196 C by vitrification.Nature 313，573-575.

Reubinoff，B.E.，Pera，M.F.，Vajta，G.和Trounson，A.O.(2001).Effective cryopreservation of human embryonic stem cells by the openpulled straw vitrification method.Human Reproduction 16，2187-2194.

Routray，P.，Suzuki，T.，Striissmann，C.A.和Takai，R.(2002).Factorsaffecting the uptake of DMSO by the eggs and embryos of medaka，Oryzias latipes.Theriogenology 58.1483-1496.

Schmid，G.，Lüudemann，H.D.和Jaenicke，R.(1975)High pressureeffects on the activity of glycolytic enzymes.Biophys Chem 3，90-98.

Schuster，B.，Sleytr，U.B.(2002).The effect of hydrostatic pressureon S-layer-supported lipid membranes.Biochim Biophys Acta 1563，29-34.

Seki，K.，Toyoshima，M.(1998).Preserving tardigrades underpressure.Nature 395，853-854.

Silva，J.L.，Foguel，D.，Royer，C.A.(2001).Pressure provides newinsights into protein folding，dynamics and structure.Trends Biochem Sci26，612-618.

Spilimbergo，S.，Elvassore，N.，Bertucco，A.(2002).Microbialinactivation by high-pressure.The Journal of Supercritical Fluids22，55-63.

Stachecki，J，J.，Cohen，J.，Schimmel，T.，Willadsen，S.M.(2002).Fetal development of mouse oocytes and zygotes cryopreserved in anonconventional freezing medium.Cryobiology 44，5-13.

Van Wagtendonk-De Leeuw，A.M.，Den Daas，J.H.，Kruip，T.A.，Rall，W.F.(1995).Comparison of the efficacy of conventional slowfreezing and rapid cryopreservation methods for bovine embryos.Cryobiology 32，157-167.

Van Wagtendonk-De Leeuw，A.M.，Den Haas，J.H.G.和Rall，W.F.1997.Field trials to compare pregnancy rates of bovine embryocryopreservation methods：vitrification and one-step dilution versus slowfreezing and three-step dilution.Theri-ogenology48，1071-1084.

Watson，P.F.The effect of cold shock on sperm cell membranes.在：Morris，G.J.and Clarke，A.编，Effects of low temperature on biologicalmembranes.London：Academic Press；1981.189-218页.

Weber，G.，Drickamer，H.G.(1983).The effect of high pressure uponproteins and other biomolecules.Q Rev Biophys 16，89-112.

Welch，T.J.，Farewell，A.，Neidhardt，F.C.，Bartlett，D.H.(1993).Stress response of Escherichia coli to elevated hydrostatic pressure.JBacteriol 175，7170-7177.

Wemekamp-Kamphuis，H.H.，Karatzas，A.K.，Wouters，J.A.，Abee，T.(2002).Enhanced levels of cold shock proteins in Listeriamonocytogenes LO28 upon exposure to low temperature and highhydrostatic pressure.Appl Environ Microbiol 68，456-63.

Wen-Lei，C.，Yi-Xin，W.，Zu-Qiong，X.和Zheng，L.(2003).Cryopreservation-induced decrease in heat-shock protein 90 in  humanspermatozoa and its mechanism.Asian Journal Of Andrology 5.43-46.

Wouters，J.A.，Jeynov，B.，Rombouts，F.M.，de Vos，W.M.，Kuipers，O.P.，Abee，T.(1999).Analysis of the role of 7 kDa cold-shock proteins ofLactobacillus lactis MG1363 in cryoprotection.Microbiology145，3185-3194.

Yager，P.，Chang，E.L.(1983).Destabilization of a lipid non-bilayerphase by high pressure.Biochim Biophys Acta 731，491-494.

Yamanaka，K.，Fang，L.，Inouye，M.(1998).The CspA family inEscherichia coli：multiple gene duplication for stress adaptation.MolMicrobiol 27，247-255.