一种具有抗高血压作用的植物乳杆菌CW006

摘要

一种具有抗高血压作用的植物乳杆菌CW006，属于微生物制品技术领域。本发明公开了一种新菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CW006，保藏编号为CCTCC M 206032，和含有该菌株的保健和药物制品，该植物乳杆菌CW006具有蛋白水解活性并通过将原料乳发酵产生血管紧张素转换酶抑制肽达到抗高血压的作用，因此可以在乳品工业中用作起始菌，并应用于各种保健品和作为治疗性物质添加于药物制品中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的新菌株，以及该菌株在生产和制造具有抗高血压(和/或降血压)作用产品方面的应用，例如食品加工和制药业中的用途。属于微生物制品技术领域。

技术背景

高血压是一种以动脉血管收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症，是一种常见的心血管疾病。它发病率高，常伴随有高血脂、冠心病、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病和心脏、血管、脑以及肾脏等器官功能性或器质性改变，对身体健康造成很大的威胁，是全球性的重大的公共卫生问题。

在生物体中，许多系统都与血压的维持有密切的关系，其中比较重要的有中枢神经系统、肾上腺素系统、肾素-血管紧张素(RAS)系统、血管舒缓激肽-激肽-前列腺素(KKS)系统和血管内皮松驰因子-收缩因子系统等。这些系统受内外环境的影响而发生变化，从而参与血压的调控。

血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)首次由Skeggs(1954)从马血中发现，在血压调节过程中具有重要作用。一方面ACE在RAS系统中可以将无活性的血管紧张素I(AngI)水解为有活性的血管紧张素II(AngII)，促进血管的收缩，使血压升高；另一方面，在KKS系统中，它可以将舒缓激肽(BK)水解，使BK的舒张血管的活性丧失，进一步加重了血压的升高。当服用血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)时，ACEI可有效地抑制ACE酶的活性，使得AngI不能转化为AngII，BK也依然保留其舒张血管的活性，从而保持生物体的血压稳定。

目前，WHO/ISH推荐的一线抗高血压药物为利尿剂、β受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、钙通道阻滞剂(CaA)、α受体阻断剂、血管紧张素(Ang)受体拮抗剂等六大类。不同的药有不同的特点，也有一定的副作用。

ACEI对各期高血压患者都有效，不影响交感神经对血管平滑肌的调节作用，也不引起心率加快，合成ACEI的主要不良反应为易引起皮疹、蛋白尿、白细胞减少等。使用抗高血压药物治疗过程中潜在的对代谢方面有改变，特别是对脂肪、糖和尿酸代谢方面有不良影响；药物治疗也是导致冠心病发病率增加的原因；由药物引起的血压下降有可能导致脑血液减少，并可引起脑缺血、缺血性脑卒中和视力障碍等。因此高血压的非药物治疗越来越引起重视。WHO推荐的阶梯治疗方案已将非药物治疗作为治疗高血压的基础。

自从Ferreira等(1970)首次从一种蛇毒中发现了一种具有抑制ACE活性的小肽以来，已在各种食品中分离纯化到了各种结构、序列及长度大小不一的抗高血压肽。1979年，Oshima等首次报道了来源于食品蛋白质的抗高血压肽，研究人员利用胶原蛋白酶水解明胶，获得了九条具有ACE抑制作用的小肽，其中六条具有显著的ACE酶抑制作用，并且其C-末端都具有Ala-Hyp(Hyp：Hydroxyproline，羟脯氨酸)结构。日本学者Suetsuna等利用来源于米曲霉的一种名为denazyme AP酶水解沙丁鱼，得到了两条分子量大小为1000-2000的小肽，该小肽具有较强的ACE酶抑制活性，经体外实验测定，IC50(在ACE酶抑制活性的测定条件下，能抑制ACE酶50％活性所需要的该小肽的浓度，下同)分别为39.7mg/100ml和90.1mg/100ml。Yano等利用嗜热蛋白酶水解玉米蛋白，获得了大量的小肽片段，总水解物的ACE酶抑制活性的IC50为24.5μgml，其中一条三肽(Leu-Arg-Pro)ACE酶抑制活性最强，在体内也具有降压活性。另外，在酒糟(Saito等，1994a，b)、蜂王浆(Matsui等，2002)、金枪鱼(Matsumura等，1993；Yokoyama等，1992)、乳酸菌提取物(Furushiro等，1990)等食品蛋白中也发现了抗高血压肽的存在。

部分特定的微生物如瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)LBK-16H在以乳为基料的基质中生长时，通过所分泌的蛋白酶的水解作用，即胞外蛋白酶消化动物奶蛋白质产生各种肽片段，所产生的肽片段经肽酶的作用进一步生成低分子量的肽，将这些特定肽片段释放出来，从而在体内产生降血压作用。Yamoto等在国际专利申请WO99/16862中公开了瑞士乳杆菌CM4，FERM BP-6060，能够产生三肽Val-Pro-Pro和/或Ile-Pro-Pro，这两种序列的三肽具有较强的ACE抑制作用。Nakamura等的美国专利5,449,661描述了采用瑞士乳杆菌JCM1004发酵脱脂乳制备Val-Pro-Pro三肽的方法。Annika等在美国专利6,890,529描述了瑞士乳杆菌LBK-16H，DSM13137能够产生生物活性肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro并能促进一氧化氮的产生，从而降低高血压。此外，部分微生物在生长过程中，能够合成某些物质，在原发高血压老鼠(SHR)体内也具有降血压作用。如干酪乳杆菌YIT9018的细胞自溶物中分离到一种多糖-糖肽复合物，SHR服用后血压下降10-20mmHg。

抗高血压作用的乳酸菌目前研究多集中在瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌这两大菌株中，在该领域中寻找可以在食品工业中用作发酵剂和益生菌、以及可以作为天然产品使用和用于制药业的新的有效的微生物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的：针对以上课题，以传统发酵食品(豆豉巴，豆酱，酸奶子，西藏灵菇)中的乳酸菌为目标菌群，采用特定的体外筛选模型，从中筛选出发酵乳以后产生降压肽的益生性乳酸菌，并进一步研究了其在抗高血压方面的功能与应用。

本发明的技术方案：提供一种植物乳杆菌CW006，该菌具有抗高血压的作用。

根据本发明，含有菌株植物乳杆菌CW006的细菌制品被提供给消费者，该细菌制品可以还含有其它微生物，该细菌制品可以是冻干的粉末或胶囊，就此使用或用于食品、功能性产品或药物的生产中。

本发明涉及含有上述菌株或通过使用上述菌株制备的乳制品或饮料制品，饮料制品优选乳清饮料、水果饮料或啤酒。

本发明还涉及利用菌株植物乳杆菌CW006在制备抗高血压产品中的应用。

本发明中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CW006的分离过程如下：以传统发酵食品(豆豉巴，豆酱，酸奶子，西藏灵菇)为样品，样品经预处理后，以pH6.8的PBS缓冲液浸泡混匀并梯度稀释，选择合适的稀释度溶液涂布于MRS和LBS平板上，37℃厌氧培养48小时，挑取典型菌落(菌落圆形、表面湿润光滑和边缘整齐等)转接至MRS平板纯化，挑取单菌落转接入MRS液体增菌，获得乳酸菌菌株并保存。

将乳酸菌在37℃条件下在MRS培养基中培养24h后转接入新鲜MRS培养基中，同条件培养12h，菌体离心，用PBS缓冲液重悬，以1％接入10％的脱脂奶(SKM)中，37℃发酵一定时间，发酵乳经4℃8500×g冷冻离心10min，所得清液用10mol/LNaOH调pH为8.3，于-70℃条件下保存待测。抑制ACE活性的测定采用Cushman和Cheung的方法。对于在体外对ACE有明显抑制作用的菌株进行菌种鉴定，获得植物乳杆菌CW006，并测定其发酵产物在自发性高血压大鼠(SHR)中的降血压作用。

该菌株具有如下特性：

植物乳杆菌菌株CW006是革兰氏阳性、杆状细胞。生长的温度范围是17-52℃，最适温度为34-40℃。

在34-40℃时，植物乳杆菌CW006在乳中生长良好，产生1.8％-2.1％乳酸(DL)。生长的最适pH是5.8-6.5。在未进行pH调节的培养中，乳的pH降低范围为4.2-4.5。

该菌株在通常用于乳酸菌属的培养基中也生长良好。

植物乳杆菌CW006的碳水化合物利用情况如下：

             表1  API鉴定结果和经典鉴定结果的比较

API凹槽号1  碳水化合物  CW006²  Lactobacillus plantarum³45  阿拉伯糖核糖  ++  d+

    610111213151819232526272829303132343547    木糖半乳糖葡萄糖果糖甘露糖鼠李糖甘露醇山梨醇苦杏仁甙七叶苷水杨苷纤维二糖麦芽糖乳糖蜜二糖蔗糖海藻糖松三糖蜜三糖葡糖酸    d++++-++++++++++++++    d++++-++++++++d+++++

1代表API试剂盒反应凹槽号。

2代表CW006经API系统的菌种鉴定结果。

3Bergey’s手册关于植物乳杆菌的碳水化合物反

应描述：“+”阳性，“-”阴性，“d”不明显。

植物乳杆菌CW006具有蛋白水解活性。通过OPA方法测定(该方法在以下实施例中有述并基于邻苯二醛测定蛋白水解度)，该菌株的蛋白水解活性为0.3-0.4。可以利用蛋白水解活性作为发酵剂和用于生物学活性物质的制备。

植物乳杆菌CW006对低pH值和胆汁有极好的耐受性。从保存性和生理活性的角度看，这是一个重要的性质。结果显示该菌株可以通过胃和小肠后在消化道中存活，并且在结肠中仍可存活。

植物乳杆菌CW006具有产生生物活性肽的能力。且抗高血压肽经模拟胃肠消化后仍保持80％的原有的活性。

本发明的有益效果：本发明中的植物乳杆菌CW006可以极好地用于制备含有生物活性肽的特殊产品，或作为可食用物质的成分或添加剂。可以单独培养植物乳杆菌CW006以形成纯培养物，也可以以混合培养物的形式培养该菌株，单独地或与常规使用的和商业可获得的发酵剂或益生菌一起使用。

附图说明

图1对比不同乳酸菌蛋白水解变化与ACEI变化关系

图2植物乳杆菌CW006发酵产物灌胃后24小时内对自发性高血压大鼠血压的影响

生物材料样品保藏

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CW006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2006年4月10日，保藏编号为CCTCCM206032。

具体实施方式

以下将通过实施例更为详细地描述本发明。这些实施例仅具有说明性，本发明不受这些实施例的限制。

实施例1初步筛选

以传统发酵食品(豆豉巴，豆酱，酸奶子，西藏灵菇)为样品，经革兰氏染色和过氧化氢酶实验将乳酸菌分离、纯化、保存，将保存的乳酸菌在37℃条件下在MRS培养基中培养24h后转接入新鲜MRS培养基中，同条件培养12h，菌体离心，用PBS缓冲液重悬，以1％接入10％的脱脂奶(SKM)中，37℃发酵一定时间，发酵乳经4℃8500×g冷冻离心10min，所得清液用10mol/LNaOH调pH为8.3，于-70℃条件下保存待测。发酵乳中抑制ACE活性的测定采用Cushman和Cheung(1971)的方法。

O.D_A为不存在抑制剂时的吸光值

O.D_B为存在抑制剂与ACE时的吸光值

O.D_C为抑制剂与ACE都不存在时的吸光值

得到初选菌株如下表

                    表2  ACE抑制活性乳酸菌初步筛选结果

  菌株编号  细胞数×10⁸CFU/mL    滴定酸度(％)    ACEI(％)  菌落形态  菌体形态来源  CZ0032CZ0043CZ0027CZ0023CW006DC25  2.48.19.99.53.02.0    0.4981.0260.9171.6041.7690.411    61.781.879.580.683.129.9  乳白透明乳白产粘乳白圆润乳白米粒状乳白圆润乳白透明  球短杆短杆杆杆球西藏灵菇西藏灵菇西藏灵菇西藏灵菇西藏灵菇豆豉巴

   DC05DC10S3S4B6DJ201    3.84.13.74.76.94.8    0.5170.6151.6350.7421.1090.917    47.835.468.851.772.438.2乳白产粘乳白乳白产粘乳白乳白透明乳白圆润    杆球短杆杆短杆短杆    显豉巴豆豉巴泡菜泡菜泡菜朝鲜豆酱

实施例2乳酸菌的耐酸耐胆汁特性

取实验菌株悬浮分别在pH2.0和pH3.0的MRS培养基中，37℃培养3小时，用平板计数方法测定活菌存活率。

实验菌株按1％接种量分别接入MRS和MRSO(加入0.3％牛胆汁的MRS)中，37℃培养，以MRS和MRSO培养液在A620nm达到0.3单位增长的时间差作为菌株胆汁耐受力的评判依据。

  表3  乳酸菌在酸性环境下的存活率

    菌种编号     活菌存活率(％) pH3.0    pH2.0    CZ0032CZ0043CZ0027CZ0023CW006DC25DC05DC10S3S4B6DJ201 81.5450.7780.0064.4479.3252.7872.6074.5579.2081.3588.1760.94    32.3120.7731.1124.4429.6719.6727.9510.3017.1729.4226.4526.56

        表4  乳酸菌在MRS和MRSO中递增时间对比

    菌株编号    A620nm值达到0.3个单位增长所需要的时间(h)    MRS    MRSO(0.3％牛胆汁)    LT^b(h)    CZ0032CZ0043CZ0027CZ0023    4.125.797.148.63    4.816.6710.6910    0.690.883.551.37

    CW006DC25DC05DC10S3S4B6DJ201    3.698.466.775.197.695.885.6111.21    4.2012.227.807.919.306.065.8313.79    0.513.761.032.721.610.180.222.58

实施例3模拟胃肠消化对ACE抑制活性的影响

将上述制备获得的乳清经截留分子量为10000Da的纤维素膜超滤处理后(去透过液)用于测定。根据Sandrine Parrot的方法，用1M盐酸将乳清pH调至2.0，取10ml样液加入1ml胃蛋白酶溶液(0.1g胃蛋白酶溶于1L0.01M盐酸)，其中E/S为1∶200，于37℃水浴摇床(160次/min)消化反应90min，然后85℃水浴加热5min后终止反应，用4％氢氧化钠将样液pH调至7.5，加入0.2ml胰蛋白酶溶液(0.5g胰蛋白酶溶于1L去离子水)，其中E/S约为1∶200，上述同条件下反应240min，再经85℃水浴加热5min终止反应。分别用胃蛋白酶消化90min、胰蛋白酶消化30min，120min，240min时取样，测定其ACE抑制活性。

                 表5  模拟胃肠消化对ACE抑制活性的影响

菌的编号消化前ACEI  胃蛋白酶消化90min后ACEI  胰蛋白酶消化30min后ACEI胰蛋白酶消化120min后ACEI胰蛋白酶消化240min后ACEI CZ0032CZ0043CZ0027CZ0023CW006DC25DC05DC10S3S4B6DJ201  65.280.477.679.882.235.445.233.770.948.768.836.2  48.464.577.782.185.649.333.418.774.535.274.524.1  39.646.348.776.474.525.134.29.860.130.762.719.526.235.860.366.876.720.620.730.665.731.560.921.216.728.950.261.372.322.739.430.663.529.860.319.8

实施例4乳酸菌蛋白水解活性的测定

参考Church的邻苯二甲醛(OPA)方法，将活化的乳酸菌以1％的接种量接种于脱脂复原乳(NFS为10％)中，在37℃下培养12小时，使用不含接种物的相应乳样品作为空白对照。准确吸取2.5毫升样品，加入试管中，再加入0.5ml重蒸馏水混匀，然后再加入0.5ml0.75mol/l三氯乙酸(TCA)，经旋涡混匀，于室温下静置10分钟，于3000r/min下离心5分钟，取上清液备用。取上清液150ul加入试管中，再加入3ml邻苯二甲醛(OPA)试剂，混匀后，在室温下反应2分钟，于340nm处测吸光度，如图1所示。

实施例5对SHR灌胃CW006发酵乳清测定其收缩压变化

植物乳杆菌CW006对10％的脱脂奶37℃发酵48小时后，发酵上清液经离心超滤处理后，获得粉末混合物，作为实验样品。

实验动物：自发性高血压大鼠(SHR)，26周龄，雄性，体重388±30克，由中国科学院上海实验动物中心提供，动物合格证号：沪动合证字152号。

清醒大鼠血压测定采用SHR大鼠电子血压仪(北京中日友好医院生产)进行尾动脉间接测压法，将大鼠置于38℃温箱内加热15-20min.测定收缩压。

自发性高血压大鼠8只，随机分为两组：给予生理盐水的对照组，给予0.6g发酵乳冻干粉/Kg体重的低剂量组，每组4只。大鼠在给药前一周开始测压，待血压稳定后开始实验，先测定大鼠给药前血压，然后灌胃给药，并分别每间隔2小时测定药物对大鼠的降压。

结果显示发酵产物的降压作用在8小时内到达峰值。

表6  植物乳杆菌CW006发酵产物灌胃对自发性高血压大鼠血压的影响

  实验分组    给药前血压(mmHg)         给药后血压(mmHg)  第一天  第五天  第十六天  对照组低剂量组    207±14198±15  204±18174±20  199±13168±16  203±12185±23

应用实施例1利用植物乳杆菌CW006制造具有降血压功能的乳酸菌饮料

将原料乳(脱脂奶、鲜奶、复原奶等)经两次95℃、20分钟或140℃、2秒钟的高强度热处理后冷却至5℃，加入本发明的植物乳杆菌CW006，使其浓度达到10⁹cfu/ml，5℃冷藏保存即得到活菌乳饮料。

应用实施例2利用植物乳杆菌CW006制造具有降血压功能的乳粉

将原料乳(脱脂奶、鲜奶、复原奶等)经两次95℃、20分钟或140℃、2秒钟的高强度热处理后冷却至5℃，以原料乳体积的4％接菌量加入本发明的植物乳杆菌CW006，37℃发酵48小时，离心取上清液。以1∶3(V/V)加入灭菌后的原料乳中均质，经真空浓缩、喷雾干燥处理后得到降血压乳粉，或制成降血压胶囊制品。

应用实施例3利用植物乳杆菌CW006制备具有降血压功能的酸奶

将原料乳(脱脂奶、鲜奶、复原奶等)经两次95℃、20分钟或140℃、2秒钟的高强度热处理后冷却至5℃，以3％-5％体积百分比的量加入本发明的植物乳杆菌CW006，以及加入可共生的制备酸奶的商业发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，37℃混菌发酵至滴定酸度为0.6％-0.7％(以乳酸计)，冷藏至5℃并冷藏保存即得到降血压酸奶。